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1、实验过氧化氢酶活性测定第1页，本讲稿共10页一一 实验目的实验目的1 1掌握和学习测定过氧化氢酶活性的原理和掌握和学习测定过氧化氢酶活性的原理和方法；方法；2 2 了解过氧化氢酶的作用。了解过氧化氢酶的作用。第2页，本讲稿共10页二二 实验原理实验原理 过过氧氧化化氢氢酶酶（catalasecatalase）属属于于血血红红蛋蛋白白酶酶，含含有有铁铁，它它能能催催化化过过氧氧化化氢氢分分解解为为水水和和分分子子氧氧，在在此此过过程程中中起起传传递递电电子子的的作作用用，过过氧氧化化氢氢既既是是氧氧化化剂剂又又是是还还原原剂剂。可可根根据据H H2 2O O2 2的的消消耗耗量量或或O O2 2
2、的生成量测定该酶活力大小。的生成量测定该酶活力大小。第3页，本讲稿共10页 在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H H2 2O O2 2的量。的量。反应式反应式 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4第4页，本讲稿共10页三三 实验器材实验器材n10%H10%H2 2SOSO4 4；n0.2 mol/L pH7.80.2 m
3、ol/L pH7.8磷酸缓冲液；磷酸缓冲液；n0.1mol/L KMnO0.1mol/L KMnO4 4标准液：称取标准液：称取KMnOKMnO4 4（ARAR）3.1605g3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏，用新煮沸冷却蒸馏水配制成水配制成1000mL1000mL，再用，再用0.1mol/L 0.1mol/L 草酸溶液标定；草酸溶液标定；n0.1mol/L H2O20.1mol/L H2O2：取：取30%H2O2 30%H2O2（17.6mol/L17.6mol/L）溶液）溶液5.68mL5.68mL，稀释至，稀释至1000mL1000mL，用标准，用标准0.02mol/L KMnO40.0
4、2mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）标定。溶液（在酸性条件下）标定。1 1试剂试剂第5页，本讲稿共10页2 2材料材料:小麦叶片小麦叶片3 3主要设备：离心机，恒温箱，酸主要设备：离心机，恒温箱，酸式滴定管式滴定管第6页，本讲稿共10页四四 方法步骤方法步骤1、酶液提取酶液提取 取小麦叶片取小麦叶片2.5g2.5g加入加入pH7.8pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至研磨成匀浆，转移至25ml25ml容量瓶中，用该缓冲液容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，冲液定容，400040
5、00转离心转离心15min15min，上清液即为过氧，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。化氢酶的粗提液。第7页，本讲稿共10页2 2、滴定：取、滴定：取50mL50mL三角瓶三角瓶3 3个（个（2 2个测定，另个测定，另1 1个为个为对照），测定瓶中加入酶液对照），测定瓶中加入酶液2.5mL2.5mL，对照加煮死，对照加煮死酶液酶液2.5mL2.5mL，再加入，再加入0.1mol/L H0.1mol/L H2 2O O2 2 2.5mL 2.5mL，同，同时计时，于时计时，于3030恒温水浴中保温恒温水浴中保温10min10min，立即加，立即加入入10%H10%H2 2SOSO4 42.5mL2
6、.5mL。3 3、用、用0.1mol/L KMnO0.1mol/L KMnO4 4标准溶液滴定，至出现粉红色标准溶液滴定，至出现粉红色（在（在30s30s内不消失）为终点。内不消失）为终点。第8页，本讲稿共10页5 5 实验结果实验结果酶活性：每酶活性：每g鲜重样品鲜重样品1min内分解内分解H2O2的的mg数表示数表示式中：式中：A A对照对照KMnOKMnO4 4滴定滴定mLmL数；数；B B酶反应后酶反应后KMnOKMnO4 4滴定滴定mLmL数；数；V VT T提取酶液总量（提取酶液总量（mLmL）；）；V VS S反应时所用酶液量（反应时所用酶液量（mLmL）；）；W W样品鲜重（样品鲜重（g g）；）；T T反应时间（反应时间（minmin）；）；1.7 1.71mL0.1mol/L KMnO1mL0.1mol/L KMnO4 4相当于相当于1.7mgH1.7mgH2 2O O2 2。第9页，本讲稿共10页六六 思考题思考题 简述测定过氧化氢酶的生理意义？简述测定过氧化氢酶的生理意义？下周实验：实验下周实验：实验36谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定第10页，本讲稿共10页