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1、实验三的酶切实验三的酶切第1页，本讲稿共11页实验原理l限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链位点上，并切割双链DNA。第2页，本讲稿共11页限制性内切限制性内切酶酶酶分子酶分子识别位点识别位点切割位点切割位点 限制作用是限制作用是否需用否需用 ATP类类 三三亚亚基基双双功功能酶能酶 二分非对称二分非对称至至少少在在识识别别位位 点点 外外 1000bpYes类类内内切切酶酶与与甲甲基基化化酶酶分分子子不在一起不在一起4-6bp,大大多多数数为为回回文文对
2、对称结构称结构 在在识识别别位位点点中中或或靠靠近近识识别别位位点点无无特特异性异性No类类二二亚亚基基双双功功能酶能酶 5-7 bp 非非对对称称在在识识别别位位点点下下 游游 24-26bpYes限制性内切酶可分为三类限制性内切酶可分为三类第3页，本讲稿共11页类限制性内切酶 类类酶酶切切割割位位点点在在识识别别序序列列中中，有有的的在在对对称称轴轴处处切切割割,产产生生平平末末端端的的DNA片片段段(如如Sma:5-CCCGGG-3)；有有的的切切割割位位点点在在对对称称轴轴一一侧侧，产产生生带带有有单单链链突突出出末末端端的的DNA片片段段称称粘粘性性末末端端，如如EcoR切切割割识识
3、别别序序列列后后产产生生两两个个互互补补的的粘粘性性末端。末端。5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 第4页，本讲稿共11页实验材料和试剂实验材料：实验材料：玉米基因组玉米基因组DNA实验试剂：实验试剂：lBamH I 酶及其酶切缓冲液：购买成品。酶及其酶切缓冲液：购买成品。lSalI酶及其酶切缓冲液：购买成品。酶及其酶切缓冲液：购买成品。l琼脂糖琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。糖均可。第5页，本讲稿共11页实验仪器恒温水浴锅恒温水浴锅第6页，本讲稿共11页用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底用手
4、指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底混匀反应体系后，混匀反应体系后，37水浴保温水浴保温2-3h 电泳检测电泳检测EP管编号管编号实验步骤实验步骤反应体系反应体系 20L酶液酶液 DNA 15L BamH 1L Sal 1L 10BufferT 3L第7页，本讲稿共11页对质粒DNA酶切反应 限限制制性性内内切切酶酶用用量量可可按按标标准准体体系系1g DNA加加1单单位位酶酶,消消化化1-2h。但但要要完完全全酶酶解解则则必必须须增增加加酶酶的的用用量量，一一般般增增加加2-3倍倍，甚甚至更多，反应时间也要适当延长。至更多，反应时间也要适当延长。第8页，本讲稿共11页电泳检测示例第9页，本
5、讲稿共11页实验注意事项1.限限制制性性内内切切酶酶用用量量可可按按标标准准体体系系1g DNA加加1单单位位酶酶，消消化化1-2h。但但要要完完全全酶酶解解则则必必须须增增加加酶酶的的用用量量，一一般般增增加加2-3倍倍，甚甚至至更更多多，反反应应时时间间也也要适当延长。要适当延长。2.酶酶切切时时所所加加的的DNA溶溶液液体体积积不不能能太太大大，否否则则DNA溶溶液液中中其其他他成成分分会会干干扰扰酶反应。酶反应。3.许许多多实实验验制制备备的的DNA不不易易于于降降解解，需需适适当当增增加加酶酶的的使使用用量量。反反应应液液中中加加入入过过量量的的酶酶是是不不合合适适的的，除除考考虑虑
6、成成本本外外，酶酶液液中中的的微微量量杂杂质质可可能能干干扰扰随随后后的的反应。反应。4.市市场场销销售售的的酶酶一一般般浓浓度度很很大大，为为节节约约起起见见，使使用用时时可可事事先先用用酶酶反反应应缓缓冲冲液液（1）进进行行稀稀释释。另另外外，酶酶通通常常保保存存在在50%的的甘甘油油中中，实实验验中中，应应将将反应液中甘油浓度控制在反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响。之下，否则酶活性将受影响。第10页，本讲稿共11页思考题 如如果果一一个个DNA酶酶解解液液在在电电泳泳后后发发现现DNA未未被被酶酶切切或或者者酶酶切切不不完完全全,你你认认为为可可能能是是什什么么原原因因？第11页，本讲稿共11页