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1、实验七 实验注意事项第1页，本讲稿共10页实验原理实验原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。脯氨酸的测定脯氨酸的测定第2页，本讲稿共10页脯氨酸的测定脯氨酸的测定（一）材料及试剂（一）材料及试剂1.材料：材料：植物叶片。2.试剂及配制：试剂及配制：2.5酸性茚三酮溶液配制：酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20
2、ml 6molL1磷酸中，搅拌加热（70）溶解，贮于冰箱中。(配置的酸性茚三酮溶液仅在24 h内稳定，因此最好现用现配。)3磺基水杨酸配配制：磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。100gmL-1脯氨酸标准母液配制：脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100gmL1脯氨酸母液）。冰醋酸；甲苯。第3页，本讲稿共10页（二）实验步骤（二）实验步骤1.脯氨酸标准曲线的制作脯氨酸标准曲线的制作 用用100gmL1脯氨酸母液配制成脯氨酸母液配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10g
3、/mL的标准溶液。取标准溶液的标准溶液。取标准溶液2mL，然后向各管分别，然后向各管分别加入加入2ml3的磺基水杨酸溶液，加入的磺基水杨酸溶液，加入2ml冰醋酸及冰醋酸及4mL2.5酸酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热性茚三酮试剂，在沸水浴中加热1h，溶液即呈红色。冷却后加入，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液秒钟，静置片刻，取上层液，以甲苯溶液为，以甲苯溶液为空白对照，在空白对照，在520nm波长处测定吸光度（波长处测定吸光度（A）值。）值。OD值为纵坐标，脯氨酸浓度（值为纵坐标，脯氨酸浓度（g/mL）为横坐标绘制标准曲线。）为横坐标绘制标准曲线。回归
4、方程式回归方程式第4页，本讲稿共10页2.样品的测定样品的测定2.1脯氨酸的提取脯氨酸的提取 称取不同处理的植物称取不同处理的植物叶片叶片各各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分，分别置大试管中，然后向各管分别加入别加入5mL3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取（提取过程中要经常摇动），冷却后过程中要经常摇动），冷却后3000r/min离心离心10min。取上清液待。取上清液待测。测。2.2测定测定吸取吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入提取液于带玻塞试管中，加入2mL去离子水去离子水，2mL冰醋酸及冰醋酸及4mL2.5酸性茚三酮试剂，在沸水浴中
5、加热酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热1h，溶液即，溶液即呈红色。冷却后加入呈红色。冷却后加入4mL甲苯，摇荡甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻。秒钟，静置片刻。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（波长处测定吸光度（A）值。）值。第5页，本讲稿共10页从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：X提取液总量（提取液总量（mL）脯氨酸含量（脯氨酸含量（gg1Fw）样品鲜重（
6、样品鲜重（g）测定时提取液用量（测定时提取液用量（mL）公式中：公式中：X从标准曲线中查得的脯氨酸含量（从标准曲线中查得的脯氨酸含量（g/mL）（三）计算结果（三）计算结果依据依据回归方程式回归方程式计算得到脯氨酸含量（计算得到脯氨酸含量（g/mL）第6页，本讲稿共10页相对电导率测定相对电导率测定取根系或植物叶片取根系或植物叶片，自来水洗净，蒸馏水冲洗干净，吸干表面水分。，自来水洗净，蒸馏水冲洗干净，吸干表面水分。秤取秤取1g，剪成长约剪成长约1cm小段小段。将材料装到将材料装到30ml指形管内，加入去离子水指形管内，加入去离子水15ml，抽真空至材料，抽真空至材料下沉，室温放置下沉，室温放
7、置12h。测电导率。测电导率R1。（用根系时可以不用抽。（用根系时可以不用抽真空）真空）将指形管沸水浴将指形管沸水浴1520min（注意加盖防止水分蒸发注意加盖防止水分蒸发），以充分杀死），以充分杀死植物组织，取出放入自来水中冷却至室温，测电导率植物组织，取出放入自来水中冷却至室温，测电导率R2。相对电导率相对电导率=R1R2100%第7页，本讲稿共10页植物含水量的测定植物含水量的测定1、取成熟植物叶片，、取成熟植物叶片，剪成适当大小剪成适当大小，迅速称量鲜重，迅速称量鲜重Wf（1g）。）。2、将植物材料浸入蒸馏水并、将植物材料浸入蒸馏水并置于置于4冰箱冰箱中数小时至恒重（因中数小时至恒重（
8、因植物材料而异）植物材料而异）。3、将材料从水中取出，用吸水纸迅速吸去材料表面水分，称取、将材料从水中取出，用吸水纸迅速吸去材料表面水分，称取其饱和鲜重其饱和鲜重Wfs。（12h以上）以上）4、将上述材料放入一信封内，放入烘箱中，、将上述材料放入一信封内，放入烘箱中，在在105下杀青下杀青30min，然后将温度调到，然后将温度调到80烘至恒重。烘至恒重。5、称取材料干重、称取材料干重Wd。第8页，本讲稿共10页自然含水量自然含水量=100100相相对含水量（含水量（Relative Water Content，RWC）植物组织含水量的指标植物组织含水量的指标 RWC=自然鲜重-干重水饱和鲜重-
9、干重=100100植物含水量的测定植物含水量的测定组织饱和含水量有较好的重复性，而组织的鲜重、干重不太稳定（鲜重常随时组织饱和含水量有较好的重复性，而组织的鲜重、干重不太稳定（鲜重常随时间及处理条件而有变化）。间及处理条件而有变化）。第9页，本讲稿共10页蒽酮试剂：称取蒽酮试剂：称取1.0g蒽酮，溶于蒽酮，溶于80%浓硫酸（将浓硫酸（将98%浓硫浓硫酸稀释，把酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中）1000mL中，冷却中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用23周。周。可溶性总糖的测定可溶性总糖的测定 第10页，本讲稿共10页