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1、人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的RP-HPLC测定法 目的:建立一种测定人血浆中非对称性二甲基精氨酸(AsymmetricDimethylarginine，ADMA)浓度的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。方法:采纳WaterssymmetryC18柱(5μm，3.90mm×150mm)，以0.05mmol/L乙酸钠(pH6.8)为流淌相A，甲醇为流淌相B，线性梯度洗脱：14%15min，31%25min，45%5min(V/V/V)，流速1.0ml/min，荧光检测，激发波长330nm，放射波长450nm，邻苯二甲醛(OPA)进行柱前衍生，室温下检测。结果:ADMA在0
2、.055μg/ml范围内有良好线性关系，最小检出量为0.05μg/ml，平均相对回收率为(93.76±2.57)%，日内、日间平均变异系数分别为(3.25±1.59)%、(4.60±1.37)%。结论:本方法精确、简便、快速，适用于科学探讨和临床检测。非对称性二甲基精氨酸、色谱法、反相高效液相血浆中非对称性二甲基精氨酸(Asymmetricaldimethylarginine，ADMA)浓度改变与心血管疾病发生发展亲密相关，近年来探讨显示ADMA上升是一种新的心血管病危急因素1。关于血浆中ADMA浓度的检测方法，国外虽已有报道2，3，但操作
3、繁琐，干扰因素多。国内曾有采纳正相色谱法的报道4。本探讨在国内外同类探讨的基础上适当改进，采纳反相色谱法，用一元线性梯度洗脱，建立一套精确、简便、快速的高效液相色谱法检测人血浆中ADMA浓度的方法，报告如下。1材料1.1试剂AMDA标准品、衍生剂OPA、3-巯基丙酸均购自Sigma公司，HPLC分析纯度>99.99%;甲醇为一级色谱纯，购自天津市四友生物医药科技有限公司;硼酸为一级色谱纯，购自上海试剂总厂;乙酸钠、冰乙酸、氢氧化钾、5-磺基水杨酸为分析纯，购自上海试剂总厂。超纯水(18.25MΩ?cm)。1.2仪器与设备高效液相色谱仪为Agilent1100系列，包括G132
4、2在线脱气机、G1311A四元泵、G1316A柱温箱、G1321AFLD荧光检测器;自动进样器;Agilent化学工作站(RevA.08.03.847)。高速离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器厂出品);漩涡混合器(XW-80A,上海医科高校仪器厂生产);电子分析天平(AB204-A，上海梅特勒-托利多仪器公司灵敏度0.1mg);超纯水制备机(杭州永洁达净化科技有限公司生产)。1.3AMDA工作液配制精确称取ADMA标准品10mg于100ml容量瓶中，用超纯水溶解并定容，得浓度为100μg/mlADMA储备液。再用超纯水依次稀释为1μg/ml、2μg/ml、4μg/
5、ml、8μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的ADMA工作液，贮存于4备用。1.4流淌相A配制精密称取乙酸钠4.1g，用重蒸水溶解后，在1000ml容量瓶中定容，用2mol/L冰乙酸调整pH值到6.8，即得浓度为0.05μmol/L，pH6.8的乙酸钠溶液，然后用0.45μm滤膜过滤，超声脱气。1.5OPA衍生剂配制精确称取OPA20mg，加400μl的甲醇，0.2mol/L硼酸3.6ml(pH=9.5)，3-巯基丙酸20μl，混匀避光(现配，现用)。2方法和结果2.1色谱条件色谱柱：WatersSymmetryC18柱(5
6、μm，3.9mm×150mm)，爱护柱：WatersSymmetryC18爱护柱(5μm，3.9mm×20mm);流淌相：A为0.05μmmol/L乙酸钠(pH6.8)，B为甲醇，按B14%15min，31%25min，45%5min(V/V/V)梯度洗脱;进样量20μl;流速1.0ml/min;柱温40;荧光检测波长：激发波长330nm，放射波长450nm。2.2血浆样品处理方法于1.5ml离心管(EP管)中精密加入待测血浆1.0ml，加入20mg5-磺基水杨酸，漩涡混匀5min，冰浴15min，于12000r/min离心10min，吸取上清液
7、。2.3样本柱前衍生取2.1中上清液100μl，加OPA衍生剂100μl，漩涡混匀避光2min后，上机，自动进样检测，色谱图见图1，可见血浆中ADMA峰形良好，分别完全，无杂质峰干扰。2.4标准曲线的制备于7支1.5ml离心管中依次加入不同量的不同浓度的AMDA工作液，再各加入人空白血浆，配成终浓度依次为0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml的血浆标准品溶液系列。再按血浆样本处理方法处理后分别测定，并记录色谱图，以峰面积为纵坐标，ADMA浓度为横坐标进行
8、线性回来，得直线回来方程Area=60.90027848×Amt+3.5852958，r=0.99973，最小检出量0.05μg/ml，其含量在0.055.0μg/ml之间有良好的线性关系。2.5精密度试验按2.3项分别配制浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的血浆标准品溶液。按血浆样本处理方法处理后，日内衍生5次，隔日再衍生5次，分别计算日内变异和日间变异。结果见表1。2.6回收率试验(相对回收率)按2.3项分别配制浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的血浆标准品溶液。再按血浆样本处理方法
9、处理后测其浓度，以实测浓度与配制浓度之比乘以100%计算ADMA的相对回收率，重复试验5次。结果见表2。3探讨本探讨方法在国内外同类探讨的基础上进行了适当改进，采纳线性梯度洗脱。线性梯度洗脱能缩短分析时间，提高分别度，改善峰形，提高检测灵敏度等。本探讨中ADMA出峰干净，形态良好、对称，但出峰时间较其他文献报道3,4却有所延长。这同血浆样本处理方式有很大的关系，国外同类探讨对血浆样本采纳固相萃取分别，因此出峰可不考虑血浆中其他杂质影响，而国内同类探讨受试验条件的限制，对血浆样本仅采纳血浆蛋白沉淀法，因此需解除血浆中其他杂质的影响。本探讨采纳5-磺基水杨酸血浆蛋白沉淀法，血浆蛋白沉淀较完全，但一起先杂质峰仍较多，因此采纳线性梯度洗脱，调整出峰时间至1920min，以削减杂质峰的干扰，结果显示ADMA目标峰出峰良好，形态对称。本探讨建立的血浆ADMA浓度RP-HPLC检测方法，采纳OPA柱前衍生、线性梯度洗脱，具有快速、简便、色谱峰形佳，结果精确牢靠等优点，血浆中ADMA最低检测浓度为0.05μg/ml，精密度和相对回收率均符合生物等效性指导原则的要求，而文献报道称健康人血浆ADMA水平是(1±0.1)μmol/L(0.275±0.028μg/ml)5，因此本方法适用于科研试验探讨和临床检测。