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1、毛细管电泳技术及应用毛细管电泳技术及应用电电 泳泳 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为象，称之为电泳电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。移速率不同，可实现分离。18081808年，年，ReussReuss（俄国）（俄国）首次首次发现电泳现象。发现电泳现象。1937 1937年，年，TiseliusTiselius（瑞典）（瑞典）用于用于人血清蛋白质混合液
2、的人血清蛋白质混合液的分离：分离：发现发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次第一次的的自由溶液电泳；自由溶液电泳；第一台电泳仪第一台电泳仪；1948年，年，获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖；经典电泳经典电泳 利用利用电泳电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。法和技术叫电泳法或电泳技术。按按形状分类形状分类：U U型管电泳、柱状电泳、板电泳；型管电泳、柱状电泳、板电泳；按按载体分类载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；自由
3、电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。法与其他分析相比。1981 1981年，年，JorgensonJorgenson和和LuckasLuckas，用，用7575m m内径石英毛细管内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达进行电泳分析，柱效高达4040万万/m/m，促进电泳技术发生了根本，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与变革，迅速发展成为可与GCGC、HPLCHPLC相媲美的崭新的分离分析相媲美的崭新的分离分析技术技术毛细管电泳毛细管电泳。毛细管电泳毛细管电泳（Capillary Electrophore
4、sis,CE）高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：1.1.采用了采用了25-10025-100m m内径的毛细管；内径的毛细管；2.2.采用了高达数千伏的电压。采用了高达数千伏的电压。3.3.毛毛细细管管的的采采用用使使产产生生的的热热量量能能够够较较快快散散发发，大大大大减减小小了了温度效应，使电场电压可以很高。温度效应，使电场电压可以很高。4.4.电电压压升升高高，电电场场推推动动力力大大，又又可可进进一一步步使使柱柱径径变变小小，柱柱长增加，长增加，5.5.毛毛细细管管电电泳泳的的柱柱效效远远高高于于HPLCHPLC，理理论论塔塔板板数数高
5、高达达几几十十万万块块/米，特殊柱子可以达到数百万。米，特殊柱子可以达到数百万。分离过程 电场作用下，毛细管柱中出现：电电泳泳现现象和电渗流现象象和电渗流现象。带电粒子的带电粒子的迁移速度迁移速度=电泳电泳+电渗流；电渗流；两种速度的矢量和两种速度的矢量和。阳离子阳离子：两种效应的运动方向一致，在两种效应的运动方向一致，在负极最先流出负极最先流出；中性粒子中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出在阳离子后流出；阴阴离离子子：两两种种效效应应的的运运动动方方向向相相反反。电电渗渗流流 电电泳泳时时,阴阴离子在负极最后流出离子在负极最后流出除除中中性性粒粒子子外外
6、,同同种种类类离离子子由由于于受受到到的的电电场场力力大大小小不不一一样样也也同时被相互分离。同时被相互分离。毛细管电泳的特点毛细管电泳的特点1.1.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在在3.13.1minmin内分离内分离3636种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4.1min4.1min内分内分离了离了2424种阳离子；种阳离子；3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行；进样量极少，水介质中进行；4.4.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生
7、物、中性分子；生物大分子等；有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；n一、一、CE基本原理基本原理n二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流electroosmotic flown三、影响电渗流的因素三、影响电渗流的因素n四、淌度四、淌度mobilityn五、五、CE中的参数与关系式中的参数与关系式n六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素毛细管电泳理论基础毛细管电泳理论基础毛细管电泳毛细管电泳(CE)(CE)基本原理基本原理 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有电泳是指带电离
8、子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：电场力：FE=qE 阻阻 力：力：F=f故：故：qE=fq离子所带的有效电荷；E 电场强度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数(对于球形离子：f=6；离子的表观液态动力学半径；介质的粘度；)所以，迁移速度：所以，迁移速度：（球形离子）物质离子在电场中物质离子在电场中差速迁移差速迁移是电泳分离的
9、基础。是电泳分离的基础。淌度淌度：单位电场强度下的平均电泳速度。：单位电场强度下的平均电泳速度。q离子所带的有效电荷；离子所带的有效电荷；E 电场强度；电场强度；离子的表观液态动力学半径离子的表观液态动力学半径 介质的粘度；介质的粘度；电渗现象与电渗流电渗现象与电渗流 electroosmosis and electroosmotic flow1.1.电渗流现象电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面就会发生液体相
10、对于固体表面的移动，这种液体相对于固体的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫表面的移动的现象叫电渗现象电渗现象。电渗现象中整体移动着的电渗现象中整体移动着的液体叫液体叫电渗流电渗流（electroosmotic flow，简称，简称EOF）。）。2.2.HPCE中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流 石英毛细管柱，内充液石英毛细管柱，内充液pH3pH3时，表面电离成时，表面电离成-SiO-SiO-,管内管内壁带负电荷，形成双电层。壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的
11、，故将引起柱中极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度的溶液整体向负极移动，速度电渗流电渗流。3.3.CE中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向 电渗流的大小用电渗流速度电渗流的大小用电渗流速度电渗流电渗流表示，取决于电渗淌表示，取决于电渗淌度度和电场强度和电场强度E E。即。即 电渗流电渗流=E E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的电渗淌度取决于电泳介质及双电层的ZetaZeta电势，即电势，即 =0 00 0真空介电常数；真空介电常数；介电常数；介电常数；毛细管壁的毛细管壁的ZetaZeta电势。电势。电渗流电渗流=0 0 E E实际电泳分析，可在实验
12、测定相应参数后，按下式计算实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 电渗流电渗流=L Lefef/t/teoeoL Lef ef 毛细管有效长度；毛细管有效长度；t teoeo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。CE中电渗流的方向中电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向负极；内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向负极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向正极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向正极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；
13、石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法：（1 1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团；（2 2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向正极。4.4.CE中电渗流的流形中电渗流的流形 电荷均匀分布，整体移动，电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流电渗流的流动为平流，塞式塞式流动流动（谱带展宽很小）；（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型抛物线流型，管壁处流，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的速为零，管中心处
14、的速度为平均速度的2 2倍（引起谱带展宽倍（引起谱带展宽较大）。较大）。5.5.CE中电渗流的作用中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 57 7倍；倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流电渗流+ef +ef 阳离子运动方向与电渗流阳离子运动方向与电渗流一致一致；-=电渗流电渗流-ef -ef 阴离子运动方向与电渗流阴离子运动方向与电渗流相反相反；0 0=电渗流电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；中性粒子运动方向与电渗流一致；（1 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；）可一次完成
15、阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2 2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变改变LCLC中的流速；中的流速；（3 3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在在CECE中，控制电渗流非常重要中，控制电渗流非常重要。CE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素1.1.电场强度的影响电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。电渗流速度正比于工作电压。2.2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 不同材料毛细管
16、的表面电不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大荷特性不同，产生的电渗流大小不同；小不同；3.3.电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响（1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液对于石英毛细管，溶液pHpH增高时，表面电离多，电荷密增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁度增加，管壁zetazeta电势增大，电渗流增大，电势增大，电渗流增大，pH=7pH=7，达到最大，达到最大；pH3pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持时，采用缓冲溶液来保持pHpH稳定。稳定。（2 2）阴离子的
17、影响）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。渗流下降。4.4.温度的影响温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于温度变化来自于“焦耳热焦耳热”；焦耳热：焦耳热：
18、毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；CE CE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化度成正比。温度每变化1 1，将引起背景电解质溶液黏度变化，将引起背景电解质溶液黏度变化2%2%3%3%；5.5.添加剂的影响添加剂的影响（1 1）加入浓度较大的中性盐，如）加入浓度较大的中性盐，如K K2 2SOSO4 4，溶液离子强度增大，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2 2）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。使电
19、渗流增大。（3 3）加入表面活性剂，可改变电）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；渗流的大小和方向；加入阴离子表面活性剂，如十加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（二烷基硫酸钠（SDSSDS），可以使壁），可以使壁表面负电荷增加，表面负电荷增加，zetazeta电势增大，电势增大，电渗流增大；电渗流增大；加入不同阳离子表面活性剂来加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。控制电渗流。淌度淌度 Mobility 淌度淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。淌度不同是电泳分离的基础。1.1.绝对淌度绝对淌度(absolute mobil
20、ity)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.2.有效淌度有效淌度(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度实际溶液中的淌度(实验中测定的实验中测定的)。efef=a ai ii i a ai i 溶质溶质i i 的解离度的解离度；i i 溶质溶质i i 在解离状态下的绝对淌度在解离状态下的绝对淌度CE中的参数与关系式中的参数与关系式 1.1.迁移时间（保留时间）迁移时间（保留时间）CECE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也兼具
21、有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。适用。V V外加电压；外加电压；L L毛细管总长度毛细管总长度；2.2.分离效率（塔板数）分离效率（塔板数）在在CECE中，仅存在纵向扩散，中，仅存在纵向扩散，2 2=2=2DtDt 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。物大分子的依据。3.3.分离度分离度 影响分离度的主要因素；工作电压影响分离度的主要因素；工作电压V V；毛细管有效长度；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：影响分离
22、效率的因素影响分离效率的因素区带展宽区带展宽1.1.纵向扩散的影响纵向扩散的影响 在在HPCEHPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：中，纵向扩散引起的峰展宽：2 2=2=2DtDt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.2.进样的影响进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24D t)1/2
23、实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%1%2%2%。3.3.焦耳热与温度梯度的影响焦耳热与温度梯度的影响 电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：m m电解质溶液的摩尔电导；电解质溶液的摩尔电导；I I工作电流：工作电流：c cm m电解质浓度；电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：改善方法：（1 1）减小毛细管内径；）减小毛细管内径；（2 2）控制散热；）控制散热；4.4.溶质与
24、管壁间的相互作用溶质与管壁间的相互作用 存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负两性离
25、子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的电中心作用，浓度约为溶质的100-1000100-1000倍时，抑制对蛋白质倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。5.5.其他影响因素其他影响因素 （1 1）电分散作用对谱带展宽的影响）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2 2）“层流层流”现象对谱带展宽的影响现象对谱带展宽的影响 一般情况下，CE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因产
26、生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。n一、高效毛细管电泳仪一、高效毛细管电泳仪n二、流程与主要部件二、流程与主要部件n三、进样方式三、进样方式n四、检测器四、检测器毛细管电泳仪毛细管电泳仪仪器流程与主要部件仪器流程与主要部件 电压：电压：0 030kV30kV；分离柱不涂敷任何固定液；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：（可检测到：1010-19-191010-21-21 mol/L mol/L）1.高压电源（1 1）0 03030 kV kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源；
27、（2 2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3 3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统；（4 4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%0.1%；（5 5）电源极性易转换；）电源极性易转换；2.2.毛细管柱毛细管柱（1 1）材料：石英：各项）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机性能好；玻璃：光学、机械性能差；械性能差；（2 2）规格：内径）规格：内径20207575mm，外径，外径350350400m400m；长度；长度=1m电泳电泳时时,阴离子在阴离子在负极最后流出负极最后流出,在这种情况下在这种情况下,不但不但可以按类分离可以按类分离,同种类离子由于同种类
28、离子由于差差速迁移速迁移被相互分离。被相互分离。最基本、应用广的分离模式；最基本、应用广的分离模式；二、毛细管凝胶电泳二、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis，CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、蛋白质、DNADNA等的电荷等的电荷/质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，CZECZE模模式很难分
29、离，采用式很难分离，采用CGECGE能获得良好分离，能获得良好分离，DANDAN排序的重要手段。排序的重要手段。特点特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。1.1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。三、三、胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（MEKC）Mice
30、llar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 在电场力的作在电场力的作用下，胶束在柱中用下，胶束在柱中移动。移动。2.2.电泳流和电渗流的方向相反，且电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流电渗流 电泳电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动；负电胶束以较慢的速度向负极移动；5.5.色谱与电泳分离模式色谱与电泳分离模式的结合。的结合。3.3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电
31、泳的应用可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围范围；1.1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6 68V8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pHpH梯度；梯度；3.3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pHpH有关，有关，在酸性溶液中带
32、正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；电中性，淌度为零；四、毛细管等电聚焦四、毛细管等电聚焦 Capillary isoelectric focusing，CIEF 4.4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点迁移，分别到达满足其等电点pHpH的位置时，呈电中性，停止的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；移动，形成窄溶质带而相互分离；5.5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOHNaOH溶液；溶液；
33、6.6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.7.电渗流在电渗流在CIEFCIEF中不利，应消除或减小。中不利，应消除或减小。1.1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满充满毛细管毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。并以同一速度移动。2.2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐离子的。所有试样都按前导
34、离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。五、毛细管等速电泳五、毛细管等速电泳 Capillary isotachophoresis，CITP 3.3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=EE)，淌度大的离子区带电场强度小；，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序沿出口到进口，将不同区带依次排序1 1、2 2、3 3、4 4 电场强度依次增大。假设电场强度依次增大。假设“2”“2”号中离子扩散到号中离子扩散到“3”“3”号，号，该区电场
35、强度大，离子被加速，返回到该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”“2”区；当区；当“2”“2”号号中离子跑到中离子跑到“1”“1”号区，离子被减速使之归队；号区，离子被减速使之归队；4.4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；特点：界面明显，富集、浓缩作用；capillary isotachophoresis，CITP 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以“电渗泵电渗泵”取代机械泵，试样组分在两相间的分配为分离机理取代机械泵，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。的电动色谱过程。六、毛细管电动色谱六、毛细管电动色谱 Capilla
36、ry electrokinetic chromatography，CEC七、毛细管微乳电动色谱七、毛细管微乳电动色谱(Microemulsion electrokinetic chromatography,MEEKC)Watern-Octanen-OctaneSO3-SO3-OH OHOH OH OHNa+Na+WaterNa+SO3-WaterButan-1-olSDSSodium ionOHCE相关技术相关技术1.毛细管电泳柱技术毛细管电泳柱技术 毛毛细细管管是是CE的的核核心心部部件件之之一一早早期期研研究究集集中中在在毛毛细细管管直直径径、长长度度、形形状状和和材材料料方方面面，目目前
37、前集集中中在在管管壁壁的的改改性性和和各种柱的制备。各种柱的制备。1)动态修饰毛细管内壁动态修饰毛细管内壁 管壁改性主要是消除吸附和控制电渗流，通常采用管壁改性主要是消除吸附和控制电渗流，通常采用动态修饰和表面涂层两类方法。动态修饰采用在运行缓动态修饰和表面涂层两类方法。动态修饰采用在运行缓冲液中加入添加剂，如加入阳离子表面活性剂十四烷基冲液中加入添加剂，如加入阳离子表面活性剂十四烷基三甲基溴化铵三甲基溴化铵(TTAB)，能在内壁形成物理吸附层，使，能在内壁形成物理吸附层，使EOF反向添加剂还有聚胺、聚乙烯亚胺反向添加剂还有聚胺、聚乙烯亚胺(PEI)等，甲等，甲基纤维素基纤维素(MC)可形成一
38、中性亲水性覆盖层。可形成一中性亲水性覆盖层。2)毛细管内壁表面涂层毛细管内壁表面涂层 涂涂层层方方法法有有很很多多种种，包包括括物物理理涂涂布布、化化学学涂涂层层。最最常常用用的的方方法法是是采采用用双双官官能能团团的的偶偶联联剂剂，如如各各种种有有机机硅硅烷烷，第第一一个个官官能能团团(如如甲甲氧氧基基)与与管管壁壁上上的的游游离离羟羟基基进进行行反反应应，使使其其与与管管壁壁进进行行共共价价结结合合，再再用用第第二二个个官官能能团团(如如乙乙烯烯基基)与与涂涂渍渍物物(如如聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺)进进行行反反应应，形形成成一一稳稳定定的的涂涂层层此此外外还还有有将将纤纤维维素素、PEI和和聚
39、聚醚醚组组成成多多层层涂涂层层，亲亲水水性性的的绒毛涂层绒毛涂层(fuzzy)和联锁聚醚涂层。和联锁聚醚涂层。化学键合物理吸附3)凝胶柱和无胶筛分凝胶柱和无胶筛分 CGE的的关关键键是是毛毛细细管管凝凝胶胶柱柱的的制制备备，常常用用聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶栓栓来来进进行行DNA片片段段分分析析和和测测序序。测测定定蛋蛋白白质质和和肽肽的的分分子子量量常常用用十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺电电泳泳(SDS-LPAGE)。如如将将聚聚丙丙烯烯胺胺单单体体溶溶液液中中的的交交联联剂剂甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺(Bis)浓浓度度降降为为零零，得得到到线线性性非非交交联联的的亲亲
40、水水性性聚聚合合物物用用作作操操作作溶溶液液，仍仍有有按按分分子子大大小小分分离离的的作作用用，称称无无胶胶筛筛分分。此此法法简简单单，使使用用方方便，分离能力比便，分离能力比CGE差。差。4)CEC的毛细管柱制备的毛细管柱制备 包括开管和填充柱包括开管和填充柱 开开管管柱柱：键键合合色色谱谱涂涂层层毛毛细细管管柱柱，例例如如：将将核核糖糖核核酸酸酶酶、己己糖糖激激酶酶、腺腺苷苷脱脱氨氨酶酶等等固固定定到到毛毛细细管管表表面面，构构成成一一开开管管反反应应器器，再再和和CE连连接接，可可进进行行核核酸酸选选择择性性检测、微量在线合成和分离寡核昔酸等工作。检测、微量在线合成和分离寡核昔酸等工作。
41、填填充充柱柱：可可将将HPLC中中众众多多的的固固定定相相微微粒粒填填充充到到毛毛细细管中。管中。2.毛细管电泳检测技术毛细管电泳检测技术 CE对对检检测测器器灵灵敏敏度度要要求求相相当当高高，故故检检测测是是CE中中的的关关键键问问题题。迄迄今今为为止止除除了了原原子子吸吸收收光光谱谱与与红红外外光光谱谱末末用用于于CE外外，其其它它检检测测手手段段均均已已用用于于CE。现现选选择择重重要要的的几几类类检检测器介绍其最新进展。测器介绍其最新进展。1)紫外检测器紫外检测器(UV)在合适位置除去涂层，将透明部分对准光路。在合适位置除去涂层，将透明部分对准光路。UV检检测测器器集集中中在在提提高高
42、灵灵敏敏度度，可可采采用用毛毛细细管管弯弯折折、吹吹泡泡技技术术扩扩大大光光路路。或或采采用用平平面面积积分分检检测测池池，这这种种设设计计可可使使检检测测光光路路增增加加到到1cm。也也有有用用光光散散射射二二极极管管(LEDS)作作光光源源，其其线线性性范范围围和和信信噪噪比比优优于于汞汞灯。总体来说进展不大。灯。总体来说进展不大。2)激光诱导荧光检测激光诱导荧光检测LIF LIF是是CE最最灵灵敏敏的的检检测测器器之之一一，极极大大地地拓拓展展了了CE的的应应用用，DNA测测序序就就须须用用LIF，单单细细胞胞和和单单分分子子检检测测也也离离不不开开LIF。利利用用CE-LIF技技术术可
43、可检检出出染染色色的的单单个个DNA分分子子，有有望望用用于于癌癌症症的的早早期期诊诊断断及及临临床床酶酶和和免免疫疫学学检检测测等等。CELIF和和微微透透析析结结合合可可测测定定脑脑中中神神经经肽肽。采采用用波波长长分分辨辨荧荧光光检检测测器器可可提提供供有有关关蛋蛋白白和和DNA序序列列的的一一些些结结构构和和动动态态信信息息。一一些些适适用用于于二二极极管管激激光光器器的的荧荧光光标标记记试试剂剂如如CY5等等，正正在不断开发和应用。在不断开发和应用。CE/LIF向向三三个个方方向向发发展展：在在原原有有氦氦镉镉激激光光器器(325nm)和和氩氩离离子子激激光光器器(488nm)之之外
44、外，发发展展价价廉廉、长长波波长长的的二二极极管管激激光光器器；发发展展更更多多的的荧荧光光标标记记试试剂剂来来扩扩展展应应用用面面；开开展展更更多多的的应应用用研研究究。LIF不但提高了灵敏度，也可增不但提高了灵敏度，也可增加选择性，加选择性，缺点缺点在于被测物须用荧光在于被测物须用荧光试剂标记成染色。试剂标记成染色。3).CE/MS联用联用 CE/MS联联用用,弥弥补补了了CE定定性性鉴鉴定定的的不不足足，故故发发展展特特别别快快。CE/MS联联用用主主要要在在两两方方面面发发展展：一一是是各各种种CE模模式式和和MS联联用用，二二是是CE和和各各种种MS联联用用。关关键键是是解解决决接接
45、口口装装置置。最最早早报报道道CE/MS联联用用是是采采用用单单级级四四极极杆杆质质谱谱，现现已已发发展展到到三三级级四四极极质质谱谱、离离子子阱阱质质谱谱等等。CE/MS联联用用特特别别适适合合于于复复杂杂生生物物体体系系的的分分离离鉴鉴定定。因因所所需需样样品品少少，目目前前大大部部分分工工作作集集中中在在基基因因工工程程产产品品和和蛋蛋白白样样品品，CE/MS联联用用现现在在已已成成为为CE研究中的热点。研究中的热点。4)电化学检测器（电化学检测器（EC）EC可可避避免免光光学学类类检检测测器器遇遇到到的的光光程程太太短短的的问问题题，故故和和LIF同同为为CE中中灵灵敏敏度度最最高高的
46、的检检测测器器。报报道道最最多多的的是是电电化化学学伏伏安安检检测测器器，常常用用碳碳纤纤维维微微电电极极进进行行单单细细胞胞极极微微量量神神经经递递质质(如如多多巴巴胺胺等等)的的测测定定。可可用用脉脉冲冲伏伏安安法法测测定定糖糖、糖糖肽肽及及金金属属离离子子，也也可可用用循循环环伏伏安安法法，另另一一类类常常用用的的EC为为电电导导检检测测器器，Li的检测限达的检测限达10-7mol/L(10-15mol)。5)化学发光检测器化学发光检测器(CL)CL具有结构简单、灵敏度高的特点，具有结构简单、灵敏度高的特点，近年来引起重视。用近年来引起重视。用CECL检测血红蛋白，检测血红蛋白，其检测限
47、比其检测限比CEUV低约低约4个数量级。应用个数量级。应用最多的仍是最多的仍是鲁米那鲁米那(luminol)体系体系，因为该，因为该体系对多数待测物如一些金属离子、氨基酸体系对多数待测物如一些金属离子、氨基酸及其衍生物的检测灵敏度很高，且反应在水及其衍生物的检测灵敏度很高，且反应在水相进行。电致化学发光相进行。电致化学发光(ECL)也已成功地用也已成功地用作作CE检测。检测。6)其它检测器其它检测器 采采用用激激光光作作激激励励源源的的除除LIF外外，还还有有激激光光热热透透镜镜检检测测、激激光光光光热热检检测测和和激激光光拉拉曼曼检检测测等等。普普通通荧荧光光检检测测器器研研究究集集中中在在
48、开开发发新新的的荧荧光光染染料料，以以提提高高灵灵敏敏度度。同同位位素素检检测测器器具具有有高高选选择择性性和和高高灵灵敏敏度度可可达达10-9加加mol/L，但但测测定定时时需需经经同同位位素素标标记记步步骤，故应用受到限制。骤，故应用受到限制。总总之之，检检测测器器是是CE中中具具有有挑挑战战性性的的研研究究工工作作。CE/MS联联用用是是最最有有应应用用价价值值的的检检测测器器，但但价价格格昂昂贵贵，不不易易推推广广。发发展展新新型型检检测测器器、提提高高UV等等检检测测器器灵灵敏敏度度，以以及及发发展展CE和和其其它它分分离离方方法法、检检测测方方法法的的联联用用是是CE研研究重点之一。究重点之一。Light source(-)(+)-bufferbuffer毛细管电泳毛细管电泳间接紫外检测法间接紫外检测法测定植物中的低分子量有机酸测定植物中的低分子量有机酸-+EOF-+-苋菜根、茎、叶样品溶液电泳图苋菜根、茎、叶样品溶液电泳图1 甲酸甲酸2 苹果酸苹果酸3 柠檬酸柠檬酸4 琥珀酸琥珀酸5 戊二酸戊二酸6 未知峰未知峰7 乙酸乙酸