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1、实验动物 豚鼠 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望豚豚 鼠鼠 学名学名Cavia porcellus,英文名英文名Guinea Pig属哺乳动物纲、啮齿目、豚鼠科、属哺乳动物纲、啮齿目、豚鼠科、豚鼠属。豚鼠属。实验豚鼠由野生豚鼠驯化而育成实验豚鼠由野生豚鼠驯化而育成。1780年，Laviser首次用豚鼠做热原实试验，之后在科学研究用动物中占有了突出地位。生物学特性生物学特性一般特性：1、生长发育特征：身体短粗，头大、身体短粗，头大、耳朵四肢短小，尾巴只
2、有残耳朵四肢短小，尾巴只有残 迹，毛色多样迹，毛色多样2、采食行为：草食性，需粗纤维，食量大草食性，需粗纤维，食量大3、居住习性：喜活动，爱群居，对外界刺喜活动，爱群居，对外界刺 激敏感激敏感 4、反应能力：听觉发达听觉发达5、抗生素敏感性：投药易引起死亡，对投药易引起死亡，对 青霉素敏感性为小鼠的青霉素敏感性为小鼠的1000倍倍生物学特性生物学特性生理学特点：1、生殖特点：性成熟早、母鼠怀孕期长，胚胎在母体性成熟早、母鼠怀孕期长，胚胎在母体 发育完全发育完全2、生长发育：寿命寿命45年，最长可达年，最长可达8年，生长发育快年，生长发育快3、体温调节：自动调节体温能力差，饲养最适温度自动调节体
3、温能力差，饲养最适温度 1822度度4、营养特点：体内不能合成维体内不能合成维C，饲料中必须添加，饲料中必须添加5、免疫学特点：易引起变态反应易引起变态反应品种和品系品种和品系近交品系豚鼠目前世界上有近交品系豚鼠目前世界上有12个。个。由于豚鼠妊娠期较长为由于豚鼠妊娠期较长为68（6272）天，一）天，一胎生得少，一般胎生得少，一般23只，培育一个近交品系只，培育一个近交品系需要需要2030年，所以近交品系较少。年，所以近交品系较少。用于医学科研的近交品系用于医学科研的近交品系纯系纯系2号号和和纯系纯系13号号。豚鼠在科学研究中的应用豚鼠在科学研究中的应用一、免疫学一、免疫学 血清中含有血清中
4、含有丰富的补体丰富的补体，是所有实验动物中补体，是所有实验动物中补体含量最多的一种动物，其补体非常稳定，免疫学含量最多的一种动物，其补体非常稳定，免疫学实验中所用的补体多来源于豚鼠血清。实验中所用的补体多来源于豚鼠血清。适合用于研究适合用于研究速发型过敏性呼吸道疾病速发型过敏性呼吸道疾病。豚鼠。豚鼠迟发性超敏反应与人类相似，如皮内迟发性超敏反应与人类相似，如皮内结结核菌素核菌素试试验验。二、传染病研究二、传染病研究 豚鼠对多种病原体敏感，常用于病原的分离豚鼠对多种病原体敏感，常用于病原的分离及诊断。及诊断。（如豚鼠对结核杆菌有高度敏感性，感染后的病变酷似人如豚鼠对结核杆菌有高度敏感性，感染后的
5、病变酷似人类的进行性结核病变，是结核菌分离、鉴别、诊断和各种类的进行性结核病变，是结核菌分离、鉴别、诊断和各种抗结核病药物的筛选以及病理研究最佳动物。）抗结核病药物的筛选以及病理研究最佳动物。）豚鼠在科学研究中的应用豚鼠在科学研究中的应用三、药物学三、药物学 豚鼠妊娠期长，胎儿发育完全，幼鼠形态功豚鼠妊娠期长，胎儿发育完全，幼鼠形态功能已成熟，能已成熟，适用于药物或毒物对胎儿后期发育影适用于药物或毒物对胎儿后期发育影响的试验。响的试验。豚鼠豚鼠对多种抗生素类药物非常敏感对多种抗生素类药物非常敏感，是研究，是研究抗生素如青霉素的专门动物。抗生素如青霉素的专门动物。四、营养学四、营养学 豚鼠豚鼠体
6、内不能合成维生素体内不能合成维生素C，对其缺乏十分，对其缺乏十分敏感，是研究实验性坏血病和维生素敏感，是研究实验性坏血病和维生素C生理功能生理功能的理想动物模型和维生素的理想动物模型和维生素C的生物学检测的标准的生物学检测的标准动物。动物。豚鼠在科学研究中的应用豚鼠在科学研究中的应用 五、耳科学五、耳科学 豚鼠豚鼠耳壳大耳壳大，存在明显的听觉耳动反射。，存在明显的听觉耳动反射。耳窝耳窝对声波极为敏感对声波极为敏感，特别是对，特别是对 700 2000周周/秒的纯音最敏感。所以豚鼠常用于听觉和内秒的纯音最敏感。所以豚鼠常用于听觉和内耳疾病的研究。如噪声对听力的影响、耳毒性耳疾病的研究。如噪声对听
7、力的影响、耳毒性抗生素的研究等。抗生素的研究等。六、悉生学六、悉生学 由于可准确查知豚鼠剖腹产时间，由于可准确查知豚鼠剖腹产时间，幼仔发幼仔发育完全，易成活育完全，易成活，所以经常用于，所以经常用于悉生生物学悉生生物学的的研究。研究。TitlTitl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究型灭活疫苗效力的研究口蹄疫口蹄疫 (foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒是由口蹄疫病毒 (foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的一引起的一种种急性急性 热性热性 高度接触性高度接触性传
8、染病。对各传染病。对各国的畜牧业有着巨大的危害。国的畜牧业有着巨大的危害。目前，目前，强制免疫口蹄疫灭活疫苗强制免疫口蹄疫灭活疫苗是我国用以防是我国用以防控口蹄疫疫病流行和暴发的主要手段。控口蹄疫疫病流行和暴发的主要手段。效力试验效力试验是检验疫苗效力的标准化方法，是检验疫苗效力的标准化方法，我国用疫苗我国用疫苗50%动物保护剂量动物保护剂量 (50%protective doses，PD50)法进行口蹄疫法进行口蹄疫灭活疫苗的效力检测。灭活疫苗的效力检测。建立一种建立一种可替代本动物进行口蹄疫灭活可替代本动物进行口蹄疫灭活疫苗效力检验疫苗效力检验的方法是国内外亟待解决的方法是国内外亟待解决的
9、一个问题的一个问题 。Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究传统方法传统方法动物来源不方便，需要大量的本动物，成本高成本高，试验周期长周期长，劳动强度大。口蹄疫血清学效力检测口蹄疫血清学效力检测替代方法替代方法体外中和抗原反应与体内免疫反应存在差差异异抗体不能准确反应免疫效果仍需使用非口蹄疫疫苗免疫本动物试验动物替代方法试验动物替代方法豚鼠测定的 PD50 与牛的具有很好的相关性相关性标准准容易确定适合规模化模化养殖Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究 豚鼠豚鼠效力效力试验血清学血清学试验综合评价综合评价FMD灭活疫苗灭活疫苗效力效
10、力预实验免疫免疫剂量量攻毒攻毒剂量量选择毒苗毒苗豚鼠，牛豚鼠，牛对6批疫苗批疫苗进行行PD50效力效力检验统计学分析（学分析（R=0.846，P=0.008）极具相关性）极具相关性Y=1.625x-0.704效力试验：效力试验：血清学试验：血清学试验：微量微量细胞中胞中和和试验测定定第第7,14,21,28天抗体效价天抗体效价抗体效价与抗体效价与免疫免疫剂量正量正相关相关Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究 建立模型建立模型细胞毒作为攻毒病毒细胞毒作为攻毒病毒（乳鼠毒攻击时毒价不均一）（乳鼠毒攻击时毒价不均一）预实验预实验豚鼠测毒豚鼠测毒（细胞毒）10-310-
11、8GPID50为为105.67/0.25ml1豚鼠免疫剂量豚鼠免疫剂量1.5ml、1.0ml、0.5ml最适免疫剂量为最适免疫剂量为1.00mlFMD灭活疫灭活疫苗效力试验苗效力试验鼠免疫攻毒试验鼠免疫攻毒试验豚鼠豚鼠PD50牛免疫攻毒试验牛免疫攻毒试验牛牛PD50线性回归分线性回归分析析鼠鼠血清学血清学试试验验免疫第免疫第7、14、21、28天天测抗体效价测抗体效价抗体效价与抗原抗体效价与抗原量呈正相关量呈正相关Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究1、材料与方法1.1 疫苗1.2 病毒1.3 实验动物1.4 豚鼠发病模型的建立8只 分两组，4只/组FMDV乳鼠
12、毒，0.2 mL/只FMDV细胞毒，0.2 mL/只肢趾部皮内注射观察10 d，记录豚鼠人工感染后的临床症状，仔细观察2 种病毒引起豚鼠发病的情况有无明显差异Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究1.5 豚鼠测毒试验（根据发病情况用 Reed-muech 法计算 FMDV 细胞毒对豚鼠的半数感染量 GPID50）1.6 豚鼠免疫剂量试验共40只，十只/组，1组为对照，其它3组为免疫组对照1.5ml1.0ml0.5ml免疫剂量左后肢股内肌肉注射，免疫28天103GPID50/0.2 mL 的FMD细胞毒（0.2ml/只）左后肢趾部皮内注射观察10d,根据免疫攻毒结果
13、，确定最适免疫剂量Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究1.7 口蹄疫灭活疫苗效力试验6批口蹄疫灭活疫苗批口蹄疫灭活疫苗豚鼠免疫攻毒试验豚鼠免疫攻毒试验牛免疫攻毒试验牛免疫攻毒试验40只，只，10只只/组，共组，共4组组A1.0mlB0.5mlC0.25mlD0.125ml免疫剂量免疫剂量28天后，连同天后，连同5只对照只对照用用FMDV细胞毒攻毒细胞毒攻毒 2.0ml/只只观察观察10d，用，用Reed-munch法计算法计算PD5015只，只，5只只/组，共组，共3组组a2.0mlb0.67mlc0.22ml21天后，连同天后，连同5只对照用牛用只对照用牛用F
14、MDV细胞毒攻毒细胞毒攻毒 2.0ml/只只Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究1.9 豚鼠与牛 PD50 线性回归模型的建立豚鼠与牛 Asia-1 型 PD50 的测定结果SPSS 软件对二者进行相关性和回归分析建立豚鼠 PD50(x)预测牛 PD50(y)的回归分析方程:y=a+bxt 检验和 F检验对建立的线性回归模型进行检验结果表明豚鼠果表明豚鼠 PD50与牛与牛 PD50存在极存在极显著的著的线性关系性关系 Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究1.8 豚鼠血清学实验7d14d21d28d免疫时间每个免疫组随机选取每个免疫
15、组随机选取5只，对照组选只，对照组选2只，进行心脏采血只，进行心脏采血分离血清分离血清中和实验测定中和实验测定FMDV抗体效价抗体效价Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究2 结果与分析FMDV乳鼠毒和细胞毒均全部出现规律、典型的临床症状乳鼠毒症状更明显，细胞毒更稳定细胞毒的半数感染量10(5.67)/0.2 mL(表1)2.1 豚鼠发病模型建立1.00 mL 和1.50 mL剂量组都能使豚鼠100%保护，1.00 mL 为豚鼠最适免疫剂量2.2豚鼠测毒试验2.3豚鼠免疫剂量试验Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究两批疫苗的豚鼠重复
16、试验结果相差不大试验具有较好的稳定性和重复性第7天抗体出现，第28天达到最高，对照组为阴性。2.4 PD50效力试验抗体水平与攻毒保护率成正比，但无明显临界值。2.5.1 豚鼠血清学试验2.5.2豚鼠抗体效价与攻毒保护率关系Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究2.6 口蹄疫疫苗豚鼠 PD50 与牛 PD50 相关性分析结果果SPSS软件件进行行相关性分析和相关性分析和回回归分析分析R=0.846，P=0.008豚鼠豚鼠 PD50 与牛与牛 之之间存在极存在极显著著的正相关关系的正相关关系y=1.625x0.704F 检验结果果和和 t 检验结果一致果一致结果表明
17、豚鼠果表明豚鼠 PD50与牛与牛 PD50存在极存在极显著的著的线性关系性关系(y 为牛 PD50结果，x 为豚鼠 PD50结果）Titl豚鼠动物模型评价牛口蹄疫 Asia-1 型灭活疫苗效力的研究3 讨论讨论 豚鼠豚鼠效力效力试验血清学血清学试验综合评价综合评价FMD灭活疫苗灭活疫苗效力效力预实验免疫免疫剂量量攻毒攻毒剂量量选择毒苗毒苗豚鼠，牛豚鼠，牛对6批疫苗批疫苗进行行PD50效力效力检验统计学分析（学分析（R=0.846，P=0.008）极具相关性）极具相关性Y=1.625x-0.704效力试验：效力试验：血清学试验：血清学试验：微量微量细胞中胞中和和试验测定定第第7,14,21,28
18、天抗体效价天抗体效价抗体效价与抗体效价与免疫免疫剂量正量正相关相关为什么选择替代动物为什么选择替代动物？因需要大量的因需要大量的非免疫非免疫本动物，存本动物，存在着动物在着动物来源困难来源困难，试验，试验成本高成本高，周期长周期长等问题等问题为什么不用小鼠？为什么不用小鼠？上世纪上世纪80 年代初，年代初，Sutmoller 等用等用小鼠作为模型动物分析免疫小鼠小鼠作为模型动物分析免疫小鼠的血清抗体滴度和牛抗攻击病毒的血清抗体滴度和牛抗攻击病毒感染免疫力之间的相互关系。成感染免疫力之间的相互关系。成年年 BALB/c 小鼠对小鼠对 FMDV 敏感，敏感，能产生特异性中和抗体，能产生特异性中和抗
19、体，但不能但不能产生明显的临床症状，易产生耐产生明显的临床症状，易产生耐过性过性;不超过不超过 5 日龄的乳鼠易产生日龄的乳鼠易产生FMD 临床症状并发生死亡临床症状并发生死亡。血清学试验不需要在动物舍内进行有毒性的操作，减少了血清学试验不需要在动物舍内进行有毒性的操作，减少了病毒向外界散播的危险病毒向外界散播的危险;不需要对动物进行攻毒，消除了攻毒试验给动物带来的损不需要对动物进行攻毒，消除了攻毒试验给动物带来的损害害;还省去了攻毒后的观察期，缩短了试验周期还省去了攻毒后的观察期，缩短了试验周期 抗体滴度测抗体滴度测定使试验从定性定使试验从定性 (死亡或出现临床症状死亡或出现临床症状)走向了
20、定量，排走向了定量，排除了人为判定误差或试验动物健康状况影响试验结果除了人为判定误差或试验动物健康状况影响试验结果;与攻毒程序相比，血清学试验可以对试验样品进行保存，与攻毒程序相比，血清学试验可以对试验样品进行保存，当产品上市出现问题或管理机构要对疫苗进行复检时可应当产品上市出现问题或管理机构要对疫苗进行复检时可应用保存的样品进行重复试验。用保存的样品进行重复试验。为什么不用血清学检验？为什么不用血清学检验？1、有的动物有很、有的动物有很高的抗体梯度，但攻毒后仍然发病高的抗体梯度，但攻毒后仍然发病;有的有的动物几乎检测不到抗体，但却受到了保护，这些现象表明动物几乎检测不到抗体，但却受到了保护，
21、这些现象表明仅靠抗体水平衡量动物是否被保护是欠妥的仅靠抗体水平衡量动物是否被保护是欠妥的 。2、测定与保护性反应就不存在相关性，这样的体外替代、测定与保护性反应就不存在相关性，这样的体外替代方法很难完全替代本动物的效力检验。方法很难完全替代本动物的效力检验。3、由于不同试验室所用的检测方法、由于不同试验室所用的检测方法 试剂以及判断试剂以及判断标准标准等等方面方面难以统一难以统一，以至这类研究结果应用于实际生产中存在，以至这类研究结果应用于实际生产中存在困难困难 4、另外，检测免疫血清抗体效价须用非口蹄疫疫苗免疫、另外，检测免疫血清抗体效价须用非口蹄疫疫苗免疫动物，动物，无法从根本上取代本动物
22、的使用无法从根本上取代本动物的使用，动物的选择仍存，动物的选择仍存在困难。在困难。替代试验动物可以模拟疫苗免疫接种后抗原在体内通过网替代试验动物可以模拟疫苗免疫接种后抗原在体内通过网状内皮系统呈递的过程状内皮系统呈递的过程 、细胞介导的免疫反应、细胞介导的免疫反应、疫苗佐疫苗佐剂产生的效应和靶组织的特异性等体外试验无法测定的过剂产生的效应和靶组织的特异性等体外试验无法测定的过程。程。为什么用豚鼠？为什么用豚鼠？20 世纪世纪20 年代，研究发现豚鼠感染口蹄疫病毒后年代，研究发现豚鼠感染口蹄疫病毒后具有和具有和牛相似的临床症状牛相似的临床症状，在趾部和舌面出现水泡等组织病变，在趾部和舌面出现水泡
23、等组织病变，从此豚鼠成为口蹄疫病毒研究的一种模型动物。从此豚鼠成为口蹄疫病毒研究的一种模型动物。病毒后能产生病毒后能产生特异性的体液免疫和细胞免疫。特异性的体液免疫和细胞免疫。2004年，年，郎洪武用豚鼠对口蹄疫病毒进行测毒试验，结果表明口蹄郎洪武用豚鼠对口蹄疫病毒进行测毒试验，结果表明口蹄疫病毒可引起豚鼠疫病毒可引起豚鼠出现规律性出现规律性 典型性发病。典型性发病。2008 年，高旭东用豚鼠模型评价牛口蹄疫灭活疫苗的效力，年，高旭东用豚鼠模型评价牛口蹄疫灭活疫苗的效力，也证明豚鼠测定的也证明豚鼠测定的 PD50 与牛测定的与牛测定的 PD50具有很好的相具有很好的相关性关性 。从替代性试验动
24、物的选择来看，使用标准容易确定，适合从替代性试验动物的选择来看，使用标准容易确定，适合规模养殖，均一性容易控制规模养殖，均一性容易控制 。总结总结伴随全世界减少或取消动物试验的需求，攻毒试验给发病伴随全世界减少或取消动物试验的需求，攻毒试验给发病动物带来的动物带来的痛苦痛苦也违反了实验动物也违反了实验动物3R 3R 原则原则在科学研究中在科学研究中的应用的应用!我们可大批量的终产品检验可以通过体外试验数据来进行我们可大批量的终产品检验可以通过体外试验数据来进行检验，从而减少试验的数量检验，从而减少试验的数量;在终产品的组分发生改变时在终产品的组分发生改变时用动物进行效力检验，以探索一种有较好重复性用动物进行效力检验，以探索一种有较好重复性 可靠性可靠性和易于标准化的替代方法！和易于标准化的替代方法！动物福利动物福利动物福利概念由五个基本要素组成：动物福利概念由五个基本要素组成：生理福利，即无饥渴之忧虑；生理福利，即无饥渴之忧虑；环境福利，也就是要让动物有适当的居所；环境福利，也就是要让动物有适当的居所；卫生福利卫生福利，主要是减少动物的伤病；，主要是减少动物的伤病；行为福利，应保证动物表达天性的自由；行为福利，应保证动物表达天性的自由；心理福利心理福利，即减少动物恐惧和焦虑的心情。，即减少动物恐惧和焦虑的心情。谢谢！谢谢！制药制药1001