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1、实验七微生物大小和数量的测定张理珉 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望目的要求目的要求1、掌握用显微镜测微尺测量微生物大小的基、掌握用显微镜测微尺测量微生物大小的基本原理及方法。本原理及方法。2、利用血球计数器，进行微生物数量的直接、利用血球计数器，进行微生物数量的直接测定，并掌握其原理和传统方法。测定，并掌握其原理和传统方法。实验内容一实验内容一利用显微镜测微尺利用显微镜测微尺测量微生物大小测量微生物大小显微镜成像原理显微镜成像原理经过显微镜物镜和目
2、镜的经过显微镜物镜和目镜的二级放大，形成肉眼可见二级放大，形成肉眼可见的放大的物像（虚像）。的放大的物像（虚像）。构造及原理构造及原理目镜测微尺目镜测微尺安装于显微镜的目镜部位；安装于显微镜的目镜部位；镜台测微尺镜台测微尺校正时放置于显微镜的载物台校正时放置于显微镜的载物台上（样品处），测量时不需要；上（样品处），测量时不需要；利用镜台测微尺（已知刻度长度）校正目镜测利用镜台测微尺（已知刻度长度）校正目镜测微尺在不同物镜下代表的实际长度（微尺在不同物镜下代表的实际长度（m）。）。利用镜台测微尺校正目镜测微尺利用镜台测微尺校正目镜测微尺显微镜测微尺的组成显微镜测微尺的组成 目镜测微尺目镜测微尺肉
3、眼可见物像为一级放大（肉眼可见物像为一级放大（7 7种，根据测定的材料不同进行选择）。种，根据测定的材料不同进行选择）。镜台测微尺镜台测微尺肉眼可见物像为二级放大，肉眼可见物像为二级放大，和观察样品处于同一焦面。和观察样品处于同一焦面。不可能利用真正的尺子来进行测量（微小）；不可能利用真正的尺子来进行测量（微小）；不可能制成（或制作成本过高）不可能制成（或制作成本过高）不可能和所观察样品同时使用不可能和所观察样品同时使用只能用虚拟的尺子进行测量（物像）。只能用虚拟的尺子进行测量（物像）。标定。标定。镜台测微尺在镜台测微尺在4物镜下的情况物镜下的情况镜台测微尺在镜台测微尺在10物镜下的情况物镜下
4、的情况镜台测微尺在镜台测微尺在40物镜下的情况物镜下的情况目镜测微尺目镜测微尺镜台测微尺镜台测微尺4物镜下物镜下校正示意图校正示意图目镜测微尺目镜测微尺镜台测微尺镜台测微尺10物镜下物镜下校正示意图校正示意图目镜测微尺目镜测微尺镜台测微尺镜台测微尺40物镜下物镜下校正示意图校正示意图目镜测微尺目镜测微尺镜台测微尺镜台测微尺100物镜下物镜下校正示意图校正示意图说明：说明：镜台测微尺刻度距离的物像随物镜的变化而镜台测微尺刻度距离的物像随物镜的变化而变化（由小变大）；变化（由小变大）；目镜测微尺刻度距离的物像在目镜不变换的目镜测微尺刻度距离的物像在目镜不变换的情况下，是不随物镜的变化而变化。情况下
5、，是不随物镜的变化而变化。目镜测微尺校正（代表）尺寸随物镜放大倍目镜测微尺校正（代表）尺寸随物镜放大倍数增大成反比例减小。数增大成反比例减小。注意：注意：刻度的刻线会随物镜的放大倍数而变粗（物刻度的刻线会随物镜的放大倍数而变粗（物像）；像）；校正的目镜测微尺在不同物镜下代表的长度校正的目镜测微尺在不同物镜下代表的长度是和物镜的放大倍数成反比的；是和物镜的放大倍数成反比的；实际校正过程中，会因加工精度和刻度的放实际校正过程中，会因加工精度和刻度的放大出现微小误差。大出现微小误差。实验步骤实验步骤菌种：菌种：菌种：菌种：酿酒酵母（酿酒酵母（酿酒酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerev
6、isiae Saccharomyces cerevisiae）1 1、放置目镜测微尺（已放好，或直接使用测微目镜）、放置目镜测微尺（已放好，或直接使用测微目镜）、放置目镜测微尺（已放好，或直接使用测微目镜）、放置目镜测微尺（已放好，或直接使用测微目镜）2 2、放置镜台测微尺（、放置镜台测微尺（、放置镜台测微尺（、放置镜台测微尺（1 1毫米被毫米被毫米被毫米被100100等分，放于载物台上）等分，放于载物台上）等分，放于载物台上）等分，放于载物台上）3 3、校正目镜测微尺（不同物镜倍数）、校正目镜测微尺（不同物镜倍数）、校正目镜测微尺（不同物镜倍数）、校正目镜测微尺（不同物镜倍数）4 4、用校好
7、的目镜微尺测定酵母菌大小（、用校好的目镜微尺测定酵母菌大小（、用校好的目镜微尺测定酵母菌大小（、用校好的目镜微尺测定酵母菌大小（1010个细胞，同个细胞，同个细胞，同个细胞，同时观察酵母菌形态），计算平均值时观察酵母菌形态），计算平均值时观察酵母菌形态），计算平均值时观察酵母菌形态），计算平均值5 5、微生物的大小表述：宽、微生物的大小表述：宽、微生物的大小表述：宽、微生物的大小表述：宽 长（长（长（长（mm）说明：说明：说明：说明：微生物（其它生物也有类似的情况）的大小是微生物（其它生物也有类似的情况）的大小是微生物（其它生物也有类似的情况）的大小是微生物（其它生物也有类似的情况）的大小是有
8、一定范围的，实际表述为有一定范围的，实际表述为有一定范围的，实际表述为有一定范围的，实际表述为0.51.04.0 7.0m0.51.04.0 7.0m（举（举（举（举例）例）例）例）目镜测微尺校正结果目镜测微尺校正结果接物镜接物镜接物镜接物镜接物镜接物镜接物镜接物镜倍数倍数倍数倍数目镜测微目镜测微目镜测微目镜测微尺格数尺格数尺格数尺格数镜台测微镜台测微镜台测微镜台测微尺格数尺格数尺格数尺格数目镜测微尺每格代表目镜测微尺每格代表目镜测微尺每格代表目镜测微尺每格代表的长度（的长度（的长度（的长度（mm）搜索物镜搜索物镜搜索物镜搜索物镜低倍镜低倍镜低倍镜低倍镜高倍镜高倍镜高倍镜高倍镜油镜油镜油镜油镜
9、接目镜放大倍数：接目镜放大倍数：微生物大小测定结果微生物大小测定结果微生物细胞微生物细胞微生物细胞微生物细胞编号编号编号编号目镜测微尺每格代目镜测微尺每格代目镜测微尺每格代目镜测微尺每格代表的长度（表的长度（表的长度（表的长度（mm）宽宽宽宽长长长长目镜测微尺格数目镜测微尺格数目镜测微尺格数目镜测微尺格数计算实际宽度计算实际宽度计算实际宽度计算实际宽度（mm）目镜测微尺格数目镜测微尺格数目镜测微尺格数目镜测微尺格数计算实际宽度计算实际宽度计算实际宽度计算实际宽度（mm）1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010平均宽、长（平均宽、长（平均宽、长（平均宽、长（mm）菌体大小范
10、围（菌体大小范围（菌体大小范围（菌体大小范围（mm）实验用微生物名称：实验用微生物名称：实验内容二实验内容二利用血球计数板测定利用血球计数板测定酵母细胞数酵母细胞数显微镜直接计数法是将待测样品的悬浮液置显微镜直接计数法是将待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计数器），于显微镜下直接计数的上（又称计数器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。一种简便、快速、直观的方法。国内常用的计数器有血球（血细胞）计数板、国内常用的计数器有血球（血细胞）计数板、Petroff-Hausser计菌器及计菌器及Hawksley计菌器。计
11、菌器。血球（血细胞）计数板是一块特制的载玻片，血球（血细胞）计数板是一块特制的载玻片，由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边的平台各刻有一被一短槽隔成两半，每一边的平台各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。中间的大方格即为计数室。血球计数板俯视图血球计数板俯视图血球计数板剖面图血球计数板剖面图不同规格血球计数板的计数室不同规格血球计数板的计数室（a）麦氏血球计数板；（b）希里格氏血球计数板血血球球计计数数板板的的大大方方格格显显微微照照片片血血球球计计数数板板的的
12、中中方方格格及及小小方方格格显显微微照照片片实验步骤实验步骤菌种：菌种：菌种：菌种：酿酒酵母（酿酒酵母（酿酒酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae）稀释稀释镜检计数室（熟悉计数室结构）镜检计数室（熟悉计数室结构）盖上盖玻片盖上盖玻片加样品（不能有气泡）加样品（不能有气泡）静静止止5分钟左右分钟左右显微镜计数（显微镜计数（5个中方格）个中方格）清洗血球计数板清洗血球计数板利用吸水纸擦拭干净。利用吸水纸擦拭干净。注意观察出芽情况，计算总菌数、出芽率。注意观察出芽情况，计算总菌数、出芽率。计算公式：（计算公式：（B=100）
13、将结果记录于下表中将结果记录于下表中A表示五个中方格中的总菌数；表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。表示菌液稀释倍数。计数室计数室计数室计数室各中方格中菌数各中方格中菌数AB二室二室平均平均值值菌数菌数/ml12345第一室第一室第二室第二室注意：注意：位于格线上的菌体一般只计入上方和右边线位于格线上的菌体一般只计入上方和右边线上的细胞；上的细胞；对于酵母菌来说，出芽生殖的芽体大小达到对于酵母菌来说，出芽生殖的芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体（细胞）母细胞的一半时，即作为两个菌体（细胞）计数，反之，计为一个；计数，反之，计为一个；血球计数板只适用于计数单细胞生物；血球计数板
14、只适用于计数单细胞生物；细菌等原核生物因需要在油镜下观察，一般细菌等原核生物因需要在油镜下观察，一般血球计数板不能使用，而采用血球计数板不能使用，而采用Petroff-Hausser计数板（进口购买，其计数室有效计数板（进口购买，其计数室有效空间高度为空间高度为0.02mm）。）。附：活菌染色附：活菌染色美兰法美兰法在显微镜下区分死活菌观察活菌的方法在显微镜下区分死活菌观察活菌的方法？注意死活菌的区分，分别计数，计算？注意死活菌的区分，分别计数，计算成活率。成活率。原理：原理：活菌细胞新陈代谢中有大量脱氢作用，活菌细胞新陈代谢中有大量脱氢作用，具有较强的还原性，可以使美兰褪色变具有较强的还原性
15、，可以使美兰褪色变成无色，活细胞不能染上颜色，死细胞成无色，活细胞不能染上颜色，死细胞被染上蓝色。被染上蓝色。实验步骤实验步骤菌种：菌种：酿酒酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）操作步骤：取操作步骤：取1mL细胞悬液放入一支小试细胞悬液放入一支小试管中，加入管中，加入1mL 0.5%美兰溶液，混匀后美兰溶液，混匀后立即制片观察（水封片），或利用血球计立即制片观察（水封片），或利用血球计数板制片计数（可以区分死活细胞，计算数板制片计数（可以区分死活细胞，计算出细胞的成活率）。出细胞的成活率）。操作要求：动作要快，否则活细胞接触美操作要求：动作要快，否则活细胞接触美兰
16、染料过长也会死，一般要求在兰染料过长也会死，一般要求在510分钟分钟内完成计数。内完成计数。思考题思考题1、记录实验结果、记录实验结果，计算出菌悬液中酵母菌的，计算出菌悬液中酵母菌的大小、数量、出芽率大小、数量、出芽率和存活率和存活率。2、试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计、试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用？数法的优缺点及应用？3、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体的大小时，放大倍数的物镜来测定同一菌体的大小时，其测定结果是否相同？为什么？其测定结果是否相同？为什么？4、注意观察酵母菌的细胞形态，并绘图标注。、注意观察酵母菌的细胞形态，并绘图标注。下周实验内容下周实验内容生长谱法测定大肠杆菌对碳源的需求生长谱法测定大肠杆菌对碳源的需求要点：要点：1、测定方法的原理和应用、测定方法的原理和应用2、培养基的要求、培养基的要求3、具体操作步骤（包括相关方法）、具体操作步骤（包括相关方法）