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1、基因工程 第三章第1页，本讲稿共55页载体定义载体定义 分子克隆载体是一类可供外源分子克隆载体是一类可供外源DNADNA插入并携带重组插入并携带重组DNADNA分子进入适当分子进入适当宿主细胞的宿主细胞的DNADNA分子。分子。第2页，本讲稿共55页载体特点载体特点 1.1.1.1.至少有一个复制起点，因而至少可在至少有一个复制起点，因而至少可在至少有一个复制起点，因而至少可在至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。一种生物体中自主复制。一种生物体中自主复制。一种生物体中自主复制。2.2.2.2.至少应有一个克隆位点，以供外源至少应有一个克隆位点，以供外源至少应有一个克隆位点，以
2、供外源至少应有一个克隆位点，以供外源DNADNADNADNA插入。插入。插入。插入。3.3.3.3.至少应有一个遗传标记基因，以指示载至少应有一个遗传标记基因，以指示载至少应有一个遗传标记基因，以指示载至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组体或重组体或重组体或重组DNADNADNADNA分子是否进入宿主细胞分子是否进入宿主细胞分子是否进入宿主细胞分子是否进入宿主细胞第3页，本讲稿共55页载体种类载体种类质粒载体（plasmid)噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物柯斯质粒（cosmid)单链单链DNADNA噬菌体噬菌体M13动物病毒第4页，本讲稿共55页 第一节 质粒载体一、质粒载体的一般生物学特
3、征染色体DNA质粒DNA大肠杆菌细胞第5页，本讲稿共55页1.定义:质粒是染色体外能够自主复制的双链质粒是染色体外能够自主复制的双链闭合环状闭合环状DNADNA分子。广泛存在于细菌细胞中，在蓝藻、霉广泛存在于细菌细胞中，在蓝藻、霉菌、酵母甚至真菌细胞中都发现有质粒分菌、酵母甚至真菌细胞中都发现有质粒分子的存在。子的存在。第6页，本讲稿共55页2.质粒DNADNA的一般生物学特性（1 1）分子特性）分子特性 a a 构型构型 三种三种 SC型 超螺旋L型 线型 OC型 开环b 分子量 1-200kb第7页，本讲稿共55页（2）质粒的复制类型 根据质粒根据质粒DNADNA复制与宿主之间的关系或质粒
4、在宿主复制与宿主之间的关系或质粒在宿主细胞中拷贝数的多少将质粒分为两种类型：细胞中拷贝数的多少将质粒分为两种类型：严紧型严紧型 1-31-3个拷贝个拷贝 松弛型松弛型 10-20010-200个拷贝个拷贝 第8页，本讲稿共55页（3）质粒的不亲和性 所谓质粒的不亲和性（不相容性）是指在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能在同一个宿主细胞系中稳定地的共存的现象。第9页，本讲稿共55页（4 4）质粒的转移性 质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。另一个细胞的特性。结合型：可自我转移，大多为严紧型质粒结合型：可自我转移，大多为严紧型质粒 非结合型
5、：不可自我转移，安全，为基因工程中非结合型：不可自我转移，安全，为基因工程中常用。大多为松弛型质粒常用。大多为松弛型质粒第10页，本讲稿共55页二、理想质粒载体的必备条件二、理想质粒载体的必备条件1.1.天然质粒用作载体的局限性天然质粒用作载体的局限性 天然质粒是指没有经过体外修饰改造的质粒天然质粒是指没有经过体外修饰改造的质粒 具有分子量大，克隆能力低，拷贝数低，提取难度具有分子量大，克隆能力低，拷贝数低，提取难度大，克隆位点有限，编码基因具免疫筛选等不足之处。大，克隆位点有限，编码基因具免疫筛选等不足之处。第11页，本讲稿共55页2.理想质粒载体的必备条件：（1 1）分子量尽量小，分子量尽
6、量小，（2 2）应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的）应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的 单一酶切位点，单一酶切位点，（3 3）具两种以上的选择标记基因）具两种以上的选择标记基因 ；（4 4）缺失）缺失mobmob基因基因 （5 5）重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。）重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。第12页，本讲稿共55页二、普通型载体二、普通型载体二、普通型载体二、普通型载体pBR322pBR322的质粒图的质粒图第13页，本讲稿共55页pBR322的构建过程的构建过程1.PBR322质粒载体的构建第14页，本讲稿共55页1.PBR3221.PBR322的一般生物学特性的一
7、般生物学特性 a PBR322 a PBR322 大小为大小为4.363kb 4.363kb 为松弛型质粒，为松弛型质粒，复制起始点来源于复制起始点来源于pMB1 pMB1 b b 四环素抗性基因（四环素抗性基因（TetTet r r)来源于来源于pSC101pSC101 c c 氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（AmpAmp r r）来源于）来源于pSF2124 pSF2124 d 12 d 12 种限制性内切酶的单一识别位点。分别种限制性内切酶的单一识别位点。分别位于位于TetTet r r 和和AmpAmp r r中中第15页，本讲稿共55页2.PBR3222.PBR322的优点的
8、优点 a a 分子量小分子量小 4363bp 4363bp 统一规定记数从统一规定记数从EcoRIEcoRI识别位点识别位点GAATTCGAATTC的第一个的第一个T T为为1 1 b b 两种抗生素抗性基因，可作为重组体的选择标记，便于筛选重组体。两种抗生素抗性基因，可作为重组体的选择标记，便于筛选重组体。TetTetr r 基因内有基因内有7 7个酶切位点，个酶切位点，AmpAmpr r 基因内有基因内有3 3 个酶切位点，个酶切位点，OriOri内有内有2 2个酶切位点个酶切位点 插入失活：因插入外源插入失活：因插入外源DNA DNA 片段而使基因失活的现象片段而使基因失活的现象c c
9、具有较高的拷贝数具有较高的拷贝数 1000-3000/1000-3000/细胞细胞 第16页，本讲稿共55页用Hea消化PBR322使其缺失Hea的B和G片段，缺失了迁移蛋白基因（mob），增加了安全性3.PBR322的改良第17页，本讲稿共55页 为了克服为了克服EcoR IEcoR I位点不具备插入失活效应这一缺位点不具备插入失活效应这一缺点，引入具有点，引入具有EcoR IEcoR I单一酶切位点的单一酶切位点的CmlCmlr r基因，得到基因，得到新质粒新质粒pBR325pBR325.第18页，本讲稿共55页三、常用质粒载体类型三、常用质粒载体类型（一）（一）克隆质粒载体克隆质粒载体
10、克隆质粒载体是指专用于基因或克隆质粒载体是指专用于基因或DNADNA片段片段无性繁殖的质粒载体。目前常用的克隆无性繁殖的质粒载体。目前常用的克隆质粒载体有质粒载体有pBR322pBR322、pUCpUC及其派生质粒载及其派生质粒载体。体。第19页，本讲稿共55页1.pBR322及其派生的质粒载体及其派生的质粒载体 pAT153 pBR325 2.pUC2.pUC系列的质粒载体 一种典型的一种典型的pUCpUC系列的质粒载体包括如下系列的质粒载体包括如下4 4个组成部分个组成部分:(1)pBR322 (1)pBR322的复制起始点的复制起始点 (2)(2)氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因()
11、acZacZ 基因基因 ()半乳糖苷酶的氨基端半乳糖苷酶的氨基端第20页，本讲稿共55页第21页，本讲稿共55页pUCpUC质粒载体的特点质粒载体的特点:1.1.具有更小的分子量具有更小的分子量 pUC8/pUC9 2750bp pUC8/pUC9 2750bp pUC/18 pUC19 2686bp pUC/18 pUC19 2686bp 2.2.利用组织化学法筛选重组体利用组织化学法筛选重组体 3.3.具有多克隆位点具有多克隆位点 4.4.具有更高的拷贝数具有更高的拷贝数第22页，本讲稿共55页（二）表达质粒载体 表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达表达质粒载体是指专用于在宿主细胞
12、中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。外源蛋白质的质粒载体。据所表达的蛋白是否分泌到细胞外可分为：据所表达的蛋白是否分泌到细胞外可分为：非分泌型表达载体（胞内表达载体）非分泌型表达载体（胞内表达载体）分泌型表达载体分泌型表达载体 据所用的受体细胞不同：据所用的受体细胞不同：原核细胞表达载体原核细胞表达载体 真核细胞表达载体真核细胞表达载体第23页，本讲稿共55页（二）表达质粒载体表达质粒载体与克隆质粒载体的区别在于表达载体必须含有：1.强启动子，强启动子，2.在启动子下游区和起始密码子上游区有一个好的在启动子下游区和起始密码子上游区有一个好的S-D序列3.3.在插入序列的下游区要有一个强转录终止序
13、列，第24页，本讲稿共55页三三种种表表达达型型载载体体结结构构图图第25页，本讲稿共55页（三）穿梭质粒载体 所谓穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而右在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。常见的穿梭质粒有大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体。酿酒酵母穿梭质粒载体。第26页，本讲稿共55页大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体第27页，本讲稿共55页第28页，本讲稿共55页（四）多功能质粒载体 这类载体具有多种功能，它可以根据需这类
14、载体具有多种功能，它可以根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。方面的基因操作。pGEMpGEM系列质粒载体就系列质粒载体就是一类多功能载体，如是一类多功能载体，如pGEM-3pGEM-3、pGEM-4pGEM-4、pGEM-3Z pGEM-3Z、pGEM-4zpGEM-4z、pGEM 3zfpGEM 3zf等。都等。都是由是由pUCpUC系列质粒载体派生而来的。系列质粒载体派生而来的。第29页，本讲稿共55页第二节 噬菌体载体 细菌质粒载体为基因克隆提供了快速、简便的方法，但克隆能力在10kb左右。不能满足构建文库等的要求。为此人们把
15、 噬菌体发展成为一种优良的克隆载体。噬菌体是迄今为止研究最为详尽的一种大肠杆菌双链噬菌体。第30页，本讲稿共55页一、噬菌体的生物学特性（一）噬菌体的生活周期 噬菌体是一种中等大小的大肠杆菌噬体，噬菌体是一种中等大小的大肠杆菌噬体，由一个包裹着由一个包裹着DNADNA的正二十面体蛋白质头部和一个中空管状的蛋白质尾部组成，属温和噬菌体。第31页，本讲稿共55页 噬菌体是迄今为止研究最为详尽的一种大肠杆噬菌体是迄今为止研究最为详尽的一种大肠杆菌双链噬菌体，噬菌体菌双链噬菌体，噬菌体DNADNA进入细菌细胞后，可有两进入细菌细胞后，可有两种生活周期：裂解周期和溶源周期。环状分子整合种生活周期：裂解周
16、期和溶源周期。环状分子整合到大肠杆菌染色体上，与染色体一起复制即溶源化到大肠杆菌染色体上，与染色体一起复制即溶源化的过程的过程 噬菌体垄断寄主的生化合成机制，产生噬菌体垄断寄主的生化合成机制，产生大量双链大量双链DNADNA分子并包装进入分子并包装进入Pro.Pro.外壳导致寄主外壳导致寄主细胞裂解。三个基因细胞裂解。三个基因CC、CC、CroCro产物间的平衡产物间的平衡，来决定溶源和裂解，来决定溶源和裂解。第32页，本讲稿共55页溶源和裂解 基因表达分为早、中、晚期，早期产物用于和溶源化竟争而确立裂解周期，中期DNA复制和重组，晚期与包装DNADNA的蛋白有关。C编码的阻遏物形成产生溶源化
17、现象，竟争过程中若CC阻遏物形成受阻，而Cro Cro 编码的阻遏物形成进入裂解周期。C、C对溶源化的建立是必不可少的，但对维持溶源化不是必需。第33页，本讲稿共55页（二）（二）噬菌体的基因组结构和功能 噬菌体噬菌体DNADNA为环状双链分子，长度为为环状双链分子，长度为4.85kb,4.85kb,两端有两端有12bp12bp的单链互补的粘性末端的单链互补的粘性末端 左边为左边为5 5-GGGCGGCGACCT-3-GGGCGGCGACCT-3.右边为右边为3 3-CCCGCCGCTGGA-5-CCCGCCGCTGGA-5，可结合形成双链区段（可结合形成双链区段（COSCOS位点）是包装的必
18、需位点）是包装的必需DNADNA序列。序列。第34页，本讲稿共55页COS位点的结构位点的结构第35页，本讲稿共55页（二）噬菌体的基因组结构和功能 DNA DNA上至少定位了上至少定位了6161个基因形成四个基因簇个基因形成四个基因簇 与基因表达调节有关的与基因表达调节有关的调节基因簇调节基因簇、与与DNADNA重组及整合删除有关的重组及整合删除有关的重组基因簇重组基因簇、与复制有关的与复制有关的复制基因簇复制基因簇、与头尾蛋白质合成及组装和裂解有关的与头尾蛋白质合成及组装和裂解有关的结构结构 基因簇基因簇第36页，本讲稿共55页人为将其基因组分为三个区：人为将其基因组分为三个区：左侧区：左
19、侧区：包含外壳蛋白的全部编码基因包含外壳蛋白的全部编码基因 中间区：非必需区，被外源中间区：非必需区，被外源DNADNA片段取代后，片段取代后，不影响不影响 噬菌体的生命活动噬菌体的生命活动 右侧区：包含全部的主要调节基因及复制基右侧区：包含全部的主要调节基因及复制基 因和裂解基因因和裂解基因第37页，本讲稿共55页二、噬菌体载体的构建 野生型的不直接适用于做基因克隆载体野生型的不直接适用于做基因克隆载体 ：1.DNA1.DNA基因组在而且复杂。其中具有常用基因组在而且复杂。其中具有常用RERE的多个的多个识别位点（识别位点（5 5个个BamHBamH，5 5 个个EcoR,7 EcoR,7
20、个个HindHind等）等）2.2.存在包装限制，其只能容纳大小为存在包装限制，其只能容纳大小为 正常野生型总量的正常野生型总量的7575 105 105 的的DNADNA分子。分子。第38页，本讲稿共55页其改造有以下几个方面切除切除DNADNA的非必需区段，扩大其克隆容量的非必需区段，扩大其克隆容量切除必需的的切除必需的的RERE识别位点，在非必需区引入合适识别位点，在非必需区引入合适 的的RERE识别位点识别位点引入适当的选择标记基因以便重组子的筛选引入适当的选择标记基因以便重组子的筛选 通过在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体，通过在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体，
21、以利于生物学防护。以利于生物学防护。第39页，本讲稿共55页第三节 单链噬菌体载体 M13、f1f1、fd是一类亲缘关系密切的丝状大肠杆菌噬菌体，它们都含有大小 为6.4kb、彼此具有很高同源性的单链环状DNA分子单链噬菌体载体主要是由分子单链噬菌体载体主要是由M13噬菌体发展起来的一类载体。第40页，本讲稿共55页.优越性a RF DNAa RF DNA（复制型双链（复制型双链M13 DNAM13 DNA）如同质粒）如同质粒DNADNA可体外可体外纯化和操作纯化和操作b RF DNA b RF DNA、SS DNA SS DNA 都能转染寄主，并依实验方法，产都能转染寄主，并依实验方法，产生
22、噬菌斑或菌落生噬菌斑或菌落c c单链单链DNADNA噬菌体颗粒的大小受噬菌体颗粒的大小受DNADNA多寡制约，因此对它多寡制约，因此对它们来说不存在包装限制问题，即可以克隆大片段们来说不存在包装限制问题，即可以克隆大片段（6 6倍倍M13)M13)d d 应用单链应用单链DNADNA噬菌体可以测定出外噬菌体可以测定出外DNADNA的插入方向的插入方向e e 可插入单链可插入单链DNADNA分子，可应用分子，可应用SangerSanger测序，及寡核苷测序，及寡核苷酸的定点突变。酸的定点突变。第41页，本讲稿共55页一一、M13噬菌体载体1.1.生物学特性生物学特性 单链环状单链环状DNADNA
23、分子分子 大小为大小为6.4kb,6.4kb,通过性须或通过性须或转染将转染将DNADNA（+）注入雄性）注入雄性大肠杆菌中，它不裂解寄大肠杆菌中，它不裂解寄主，受感染的细胞可继续主，受感染的细胞可继续释放大量新的释放大量新的M13M13。第42页，本讲稿共55页过程 单链单链DNADNA即（即（+）链按基因）链按基因基因基因方向转录形成（方向转录形成（-）链）链DNA,DNA,转变成双转变成双链复制型（链复制型（RF)RF)，RF DNARF DNA可从细胞中分可从细胞中分离提取出来，用作克隆的载体，当每个离提取出来，用作克隆的载体，当每个细胞内了细胞内了100-200100-200拷贝的拷
24、贝的RF DNARF DNA后，变后，变为不对称的只产生（为不对称的只产生（+）。这些）。这些+链与细链与细胞内积累的胞内积累的DNADNA结合蛋白结合形成噬菌结合蛋白结合形成噬菌体颗粒体颗粒。第43页，本讲稿共55页2.-2.-互补互补 a a 半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ lacZ 和和lacZlacZ）半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs1021 AAs，基因产物不，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：分为两部分：链和链和链。前者负责四聚体装配，链。前者负责四聚体装配，后者具后者具半乳糖苷酶
25、活性；只有当两者都存在时，半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这互补作用。这两个部分可独立存在，两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为链编码的基因称之为lacZlacZ(编码编码146 AAs)146 AAs)。这两个。这两个基因（基因（LacZLacZ和和LacZLacZ）均可作为标记基因。）均可作为标记基因。第44页，本讲稿共55页b b x-gal 是一种无色的化合物，-半乳糖苷半乳糖苷酶能将酶能将x-gal 切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯靛蓝。因此x-gal可作
26、为-半乳糖苷酶的一种指示剂。第45页，本讲稿共55页 c 在在M13 M13 的的IS IS区插入一个大肠杆菌的区插入一个大肠杆菌的laclac操纵子片段，它包括操纵子片段，它包括基因和基因和 起动子起动子半乳糖苷酶基因的一部分（半乳糖苷酶基因的一部分（lacZlacZ）以及）以及操纵基因和启动子区域。操纵基因和启动子区域。lacZlacZ 编码编码半乳糖苷酶基因前面半乳糖苷酶基因前面的的146146个氨基酸，称为个氨基酸，称为 多肽。它能与部分缺失多肽。它能与部分缺失lacZlacZ基因的大基因的大肠杆菌突变株（肠杆菌突变株（JM101JM101细胞）进行细胞）进行互补，产生完整的互补，产生
27、完整的半半乳糖苷酶。可进行蓝白斑筛选。乳糖苷酶。可进行蓝白斑筛选。JM101遗传组成(Lac pro.)Lac Iq lac POLac zlac P OLac zM13pFF染 色 体受体供体第46页，本讲稿共55页利利用用菌菌落落颜颜色色筛筛选选重重组组子子第47页，本讲稿共55页3.M13的改造 在在M13M13非编码区域引进非编码区域引进laclac启动子（启动子（P P）、操纵）、操纵子基因（子基因（O O）和）和-gal-gal含有含有-供体的编码序列，此供体的编码序列，此外还有限制性酶的识别序列（即多克隆位点外还有限制性酶的识别序列（即多克隆位点MCSMCS）这）这种引入由于片段
28、短小，对噬菌体生活力及供体的互补种引入由于片段短小，对噬菌体生活力及供体的互补能力毫无影响。能力毫无影响。M13M13系统包括系统包括M13M13噬菌体和受体菌。噬菌体和受体菌。第48页，本讲稿共55页第49页，本讲稿共55页3.噬菌粒载体M13噬菌体载体也存在明显的不足：插入的外源片段不稳定，越大，越容插入的外源片段不稳定，越大，越容易发生缺失和重排；理论上有两种插入易发生缺失和重排；理论上有两种插入方向，但实际方向，但实际 按一种主要方向插入。按一种主要方向插入。第50页，本讲稿共55页在质粒载体中插入一段在质粒载体中插入一段M13M13或或或或fdfd的的复制起点，其插入方向决定在噬菌复
29、制起点，其插入方向决定在噬菌体颗粒中形成正链还是负链体颗粒中形成正链还是负链体颗粒中形成正链还是负链体颗粒中形成正链还是负链优点优点优点优点:1.分子较小 3kb 2.具质粒和M13两个复制起始点 3.具有多种功能第51页，本讲稿共55页噬菌粒载体噬菌粒载体pGEMpGEM结构结构 第52页，本讲稿共55页第三节 粘粒载体粘粒载体(comsid vector)是人工构建的含有噬菌体的COS序列的质粒载体又称柯斯质料载体。第53页，本讲稿共55页黏粒黏粒载体结构图载体结构图 第54页，本讲稿共55页基本特点：具有 噬菌体的体外包装、高效感染等特性具有与同源序列的质粒进行重组的能力具有高容量的克隆能力具有高容量的克隆能力具有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性第55页，本讲稿共55页