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1、基因工程第二课时第1页，本讲稿共30页第二节 基因工程的原理和技术第2页，本讲稿共30页讨论讨论:怎样能够在大肠杆菌中产生人怎样能够在大肠杆菌中产生人的胰岛素的胰岛素?基因工程的基本原理基因工程的基本原理:让人们感兴趣让人们感兴趣 的基因在宿主细胞中稳定和高效表达的基因在宿主细胞中稳定和高效表达.第3页，本讲稿共30页基因工程的基本操作程序主要包括基因工程的基本操作程序主要包括五个基本步骤：五个基本步骤：1）获得目的基因）获得目的基因2）形成重组的）形成重组的DNA分子分子3）将重组）将重组DNA分子导入受分子导入受体细胞体细胞4）筛选含有目的基因的受体）筛选含有目的基因的受体细胞细胞细胞细胞
2、5）目的基因的表达）目的基因的表达第4页，本讲稿共30页1.第一步：获取目的基因第一步：获取目的基因（1）方法：）方法：从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 利用聚合酶链式反应利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因技术扩增目的基因 （目的基因的序列已知）（目的基因的序列已知）人工合成目的基因人工合成目的基因（目的基因的序列已知）（目的基因的序列已知）第5页，本讲稿共30页基因基因DNADNA文库的构建文库的构建 将将总总DNADNA经经过过酶酶解解，分分离离不不同同长长短短的的DNADNA片片段段。包包含含的的基基因因片片段段分分别别克克隆隆在在质质粒粒或或噬噬菌菌体体载载体
3、体上上，转转染染细细菌菌或或体体外外包包装装到到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因文库。噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因文库。第6页，本讲稿共30页利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。因。第7页，本讲稿共30页循环循环变性变性退火退火延伸延伸目的基因目的基因的扩增呈的扩增呈指数指数形式形式扩增（扩增（2n）第8页，本讲稿共30页人工合成基因的方法人工合成基因的方法反转录法反转录法反转录法反转录法根据已知的氨基酸序列合成根据
4、已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA 根据已知蛋白质的氨基根据已知蛋白质的氨基根据已知蛋白质的氨基根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使酸序列，推测出相应的信使酸序列，推测出相应的信使酸序列，推测出相应的信使RNARNA序列，然后按照碱基互序列，然后按照碱基互序列，然后按照碱基互序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构补配对原则，推测出它的结构补配对原则，推测出它的结构补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化基因的核苷酸序列，再通过化基因的核苷酸序列，再通过化基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合学方法，以单核苷
5、酸为原料合学方法，以单核苷酸为原料合学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。成目的基因。成目的基因。成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因目的基因第9页，本讲稿共30页实例 1：1、下列获取目的基因的方法中需要模板链、下列获取目的基因的方法中需要模板链是是 A.从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 B.利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 C.反转录法反转录法 D.通过通过DNA合成仪利用化学方法人工合成合成仪利用化学方法人工合成B、C第10页，本讲稿共
6、30页2 2、形成重组形成重组DNA分子分子 核心核心质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端第11页，本讲稿共30页目的基因与质粒的连接第12页，本讲稿共30页常用的受体细胞：常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。步骤
7、步骤3：将重组：将重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞第13页，本讲稿共30页1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术（最多、最有效）（最多、最有效）3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理，处理，以增加细菌细胞壁的通透性。以增加细菌细胞壁的通透性。、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞花粉管通道法花粉管通道法第14页，本讲稿共30页4.第四、五步：筛选含有目的基因的受体细胞和目第四、五步：筛选含有目的基因的受体细胞和目的基
8、因表达的基因表达（1）内容：）内容：检测转基因生物的染色体检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目上是否插入了目的基因（关键）的基因（关键）检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）（2）常用的技术：）常用的技术：DNA分子杂交技术分子杂交技术DNA与与DNA、mRNA杂交杂交蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交个体水平的鉴定个体水平的鉴定(根据性状如抗性根据性状如抗性)第15页，本讲稿共30页步骤四：筛选含有目的基因的受体细胞步骤四：筛选含有目的基因的受体细胞四环素四环素抗性基因抗
9、性基因氨苄青霉氨苄青霉素抗性基因素抗性基因第16页，本讲稿共30页用棉铃饲喂棉铃虫，用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。入了抗虫基因并得到表达。想通过基因工程得到抗虫棉，想通过基因工程得到抗虫棉，怎样证明抗虫基因已经在棉怎样证明抗虫基因已经在棉花细胞中表达了？花细胞中表达了？第17页，本讲稿共30页 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。才能说明目的
10、基因完成了表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因分子后就说明目的基因完成了表达吗？完成了表达吗？若不能表达，若不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行修饰。再进行修饰。步骤四：目的基因的表达步骤四：目的基因的表达第18页，本讲稿共30页人们人们实现不同生物之间的基因转移，从而对生物进行实现不同生物之间的基因转移，从而对生物进行定向改造，但为什么目的基因离开原来的生物，在新定向改造，但为什么目的基因离开原来的生物，在新的细胞或生物体内能够表达出相同的性状？的细胞或生物体内能够表达出相同的性状？基因工程的理论基础：基因工程的理论基础：1 1、基因是控制性状的基本单位、基因是控制性
11、状的基本单位2 2、基因是、基因是DNADNA片段，片段，DNADNA是生物的遗传物质是生物的遗传物质3 3、基因在不同在生物中的表达规则是相同的、基因在不同在生物中的表达规则是相同的思考：第19页，本讲稿共30页山东卷山东卷26-(4).26-(4).转基因技术可以使某基因在植物体内过量表达，转基因技术可以使某基因在植物体内过量表达，也可以抑制某基因表达。假设也可以抑制某基因表达。假设A A基因通过控制赤霉素合基因通过控制赤霉素合成来控制番茄的株高，请完成如下实验设计，以验证成来控制番茄的株高，请完成如下实验设计，以验证假设是否成立。假设是否成立。实验设计：实验设计：(借助转基因技术，但不要
12、求转基因的具借助转基因技术，但不要求转基因的具体步骤体步骤)a.a.分别测定正常和矮生植株的赤霉素含量和株高分别测定正常和矮生植株的赤霉素含量和株高b._b._；c._c._。支持上述假设的预期结果：支持上述假设的预期结果：_。若假设成立，据此说明基因控制性状的方式：若假设成立，据此说明基因控制性状的方式：_。第20页，本讲稿共30页（4）答案一：答案一：b 通过转基因技术，一是抑制正常植株通过转基因技术，一是抑制正常植株A基因的表达，二是使基因的表达，二是使A基因在矮生植株过量表达。基因在矮生植株过量表达。c 测定两个实验组植株的赤霉素含量和植株。测定两个实验组植株的赤霉素含量和植株。答案二
13、：答案二：b 通过转基因技术，抑制正常植株通过转基因技术，抑制正常植株A基因的表达，基因的表达，测定其赤霉素含量和株高。测定其赤霉素含量和株高。c 通过转基因技术，使通过转基因技术，使A基因在矮生植株过量表达，测定基因在矮生植株过量表达，测定其赤霉素含量和株高。其赤霉素含量和株高。（答案二中（答案二中b和和c次序不做要求）次序不做要求）与对照比较，正常植株在与对照比较，正常植株在A基因表达被抑制后，赤霉素基因表达被抑制后，赤霉素含量降低，株高降低；与对照比较，含量降低，株高降低；与对照比较，A基因在矮生植株基因在矮生植株中过量表达后，该植株赤霉素含量增加，株高增加。中过量表达后，该植株赤霉素含
14、量增加，株高增加。基因通过控制酶的合成来控制代谢途径，进而基因通过控制酶的合成来控制代谢途径，进而控制生物性控制生物性状。状。第21页，本讲稿共30页（08山东卷山东卷35）为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河）为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内分子所用的限制性内切酶作用于图中的切酶作用于图中的 处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a
15、”或或“b”）（2）将重组将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和菌转化法和 法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术。该技术的核心是技术。该技术的核心是 和和 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。第22页，本讲稿共30页（08山东卷山东卷35）为扩
16、大可耕地面积，增加粮食产量，黄河）为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内分子所用的限制性内切酶作用于图中的切酶作用于图中的 处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a”或或“b”）（2）将重组将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和菌转化法和 法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植
17、株需要利用）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术。该技术的核心是技术。该技术的核心是 和和 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，作探针进行分子杂交检测，又要用又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。a a 基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）植物组织植物组织培养培养脱分化脱分化 和和 再分化再分化耐盐基因（目的基因）耐盐基因（目的基因）一定浓度的盐水浇灌（移植到盐碱地中）一定浓度的盐水浇灌（移植到盐碱地中）第23
18、页，本讲稿共30页（08广东卷广东卷39）(现代生物科技专题，现代生物科技专题，10分分)天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵原料的淀天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转人酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌中获取淀粉酶基因并转人酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题：菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题：（1）将淀粉酶基因切割下来所用的工具是）将淀粉酶基因切割下来所用的工具是 ，用，用 将淀粉酶基因与载体
19、拼接成新的将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子，下一步将该分子，下一步将该DNA分子分子 ，以完成工程菌的构建。，以完成工程菌的构建。（2）若要鉴定淀粉酶基因是否插人酿酒酵母菌，可采用的检）若要鉴定淀粉酶基因是否插人酿酒酵母菌，可采用的检测方法是测方法是 ；若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，；若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，可采用可采用 检测。将该工程菌接种在含淀粉的固体平检测。将该工程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上，培养一定时间后，加入碘液，工程菌周围出现透板培养基上，培养一定时间后，加入碘液，工程菌周围出现透明圈，请解释该现象发生的原因。明圈，请解释该现象发生的原因。（3）如何进
20、一步鉴定不同的转基因工程菌菌株利用淀粉能力）如何进一步鉴定不同的转基因工程菌菌株利用淀粉能力的大小的大小?（4）微生物在基因工程领域中有哪些重要作用）微生物在基因工程领域中有哪些重要作用?限制酶限制酶(限制限制性核酸内切性核酸内切酶酶)1DNA连连接酶接酶 导入受体细胞导入受体细胞DNA分子杂交技术分子杂交技术抗原抗体杂交或淀抗原抗体杂交或淀粉酶活性粉酶活性工具酶主要来自微生物；最重要的目的基因供体库之一；目的工具酶主要来自微生物；最重要的目的基因供体库之一；目的基因的载体之一；作为受体细胞；提供用于发酵的工程菌。基因的载体之一；作为受体细胞；提供用于发酵的工程菌。测定相同培养条件下不同工程菌
21、菌株的淀粉酶活性或酒精产量测定相同培养条件下不同工程菌菌株的淀粉酶活性或酒精产量第24页，本讲稿共30页08江苏卷32）（8分）将动物致病菌的抗原基因导入将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。第25页，本讲稿共30页第26页，本讲稿共30页请根据以上图表回答下列问题。请根据以上图表回答下列问题。（1）在采用常规）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合聚合酶不同于一般生物体
22、内的酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是聚合酶，其最主要的特点是耐高温耐高温（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表定。表1根据模板设计的两对引物序列，图根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？。（3）图）图1步骤步骤3所用的所用的DNA连接酶对所连接的连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有两端碱基序列是否有专一性要求？专一性要求？（4）为将外源基因转入马铃薯，图）为将外源
23、基因转入马铃薯，图1步骤步骤6转基因所用的细菌转基因所用的细菌B通常为通常为。（5）对符合设计要求的重组质粒）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，假设所用的酶均可将识别位进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。下酶切结果作出判断。采用采用EcoRI和和PstI酶切，得到酶切，得到种种DNA片断。片断。采用采用EcoRI和和SmaI酶切，得到酶切，得到种种DNA片段。片段。引物对引物对B。否否农杆菌农杆菌21第27页，本讲稿共30页【0808海南】海南】图为某
24、种质粒表到载体简图，小箭头图为某种质粒表到载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶所指分别为限制性内切酶EcoRIEcoRI、BamHIBamHI的酶切的酶切位点，位点，ampampR R为青霉素抗性基因，为青霉素抗性基因，tcttctR R 为四环素抗为四环素抗性基因，性基因，P P启动子，启动子，T T为终止子，为终止子，oriori为复制原点。为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括已知目的基因的两端分别有包括EcoRIEcoRI、BamHIBamHI在内的多种酶的酶切位点。在内的多种酶的酶切位点。据图回答：据图回答：（1 1）将含有目的基因的）将含有目的基因的DNADNA与质粒该表达载体
25、分别用与质粒该表达载体分别用EcoRIEcoRI酶切，酶切，酶切产物用连接酶进行连接后，其中由两个酶切产物用连接酶进行连接后，其中由两个DNADNA片段之间片段之间连接形成的产物有连接形成的产物有 、三种三种 。若要。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。（2 2）用上述）用上述3 3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是能生长
26、的原核宿主细胞所含有的连接产物是 若接种到若接种到含含含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是产物是；第28页，本讲稿共30页（3）在上述实验中，为了防止目的基因和基因）在上述实验中，为了防止目的基因和基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是连接，酶切时应选用的酶是 。（。（4）目）目的基因表达时，的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点聚合酶识别和结合的位点是是 ，其合成的产物是其合成的产物是()第29页，本讲稿共30页 讨论：质粒是讨论：质粒是DNA分子，如何保证含目的基因的分子，如何保证含目的基因的重组质粒能顺利进入受体细胞？重组质粒能顺利进入受体细胞？讨论：如何知道受体细胞接纳了重组质粒？讨论：如何知道受体细胞接纳了重组质粒？第30页，本讲稿共30页