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1、第六章 菌种复壮衰退及保藏第1页，本讲稿共44页性状稳定的菌种是微生物学工作性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。否则生产或科研都无法正常进行。第2页，本讲稿共44页 一、菌种的衰退与复壮一、菌种的衰退与复壮（一）（一）衰退衰退 1.1.定义定义 衰退衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果是指由于自发突变的结果，而是某物种原有一系列生物学性状发生量变或质而是某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。变的现象。菌种的衰退是发生菌种的衰退是发生在微生物细胞群中的一个由在微生物细胞群中的一个由量变到质变量变到质变的逐步演化
2、过程。的逐步演化过程。第3页，本讲稿共44页 菌种原有的典型性状变得不典型时就称菌种原有的典型性状变得不典型时就称菌种退化菌种退化，这，这种变异也称种变异也称负变负变（minus mutation）。影响微生物菌种稳定性的因素：影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；变异；b）污染；污染；c）死亡；死亡；第4页，本讲稿共44页例如，例如，微生物菌落形态或个体形态的变化；微生物菌落形态或个体形态的变化；生长速度缓慢，产孢子量减少；生长速度缓慢，产孢子量减少；色素产生情况的变化；色素产生情况的变化；研究菌种遗传标记的丢失，研究菌种遗传标记的丢失，生产菌种生产性状的劣化等。生产菌种生产性状的劣化等。第
3、5页，本讲稿共44页2.2.衰退的原因衰退的原因造成菌种退化的主要原因是造成菌种退化的主要原因是基因突变基因突变。误区误区生产工艺条件控制不当生产工艺条件控制不当杂菌污染杂菌污染造成生产性能造成生产性能下降下降饰变饰变第6页，本讲稿共44页3.3.衰退的防止衰退的防止（1）选育生产性能稳定的菌株作为生产菌株选育生产性能稳定的菌株作为生产菌株经诱变等处理后的菌种要连续传代、分离纯化，经诱变等处理后的菌种要连续传代、分离纯化，防止分离回复。防止分离回复。（2）控制传代次数控制传代次数尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的
4、几率。降低到最低限度，以减少自发突变的几率。第7页，本讲稿共44页（3）创造良好的培养条件创造良好的培养条件创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度上防止菌种衰退上防止菌种衰退；例如，给予营养缺陷型适当的营养必需成分，可例如，给予营养缺陷型适当的营养必需成分，可降低回复突变频率。降低回复突变频率。第8页，本讲稿共44页（4）利用不同类型的细胞进行接种传代利用不同类型的细胞进行接种传代 放线菌和霉菌一般用放线菌和霉菌一般用单核的孢子单核的孢子接种的，菌丝细接种的，菌丝细胞常含有几个细胞核，甚至是由异核体组成的，用胞常含有几个细胞核，甚至是由异核体组成的
5、，用于接种就易出现于接种就易出现离异离异（dissociation）或或衰退衰退。例如，构巢曲霉如用分生孢子接种易退化；例如，构巢曲霉如用分生孢子接种易退化；如用子囊孢子接种则不易退化。如用子囊孢子接种则不易退化。第9页，本讲稿共44页（5）采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。第10页，本讲稿共44页（二）（二）菌种的复壮菌种的复壮（rejuvenation）1.1.定义定义狭义的复壮：狭义的复壮：是指菌种已发生是指菌种已发生衰退后衰退后，通过，通过纯种分离纯种分离和和测定典型测定典型性状、生产
6、性能性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。的相应措施。是一种是一种消极消极的措施的措施第11页，本讲稿共44页广义的复壮：广义的复壮：在菌种的典型特征或生产性状尚未在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前衰退前，就经常，就经常有意识地采取有意识地采取纯种分离纯种分离和和生产性状的测定生产性状的测定工作，以工作，以期从中选择到自发的正变个体。期从中选择到自发的正变个体。是一项是一项积极积极的措施的措施第12页，本讲稿共44页 通过纯种分离把退化菌种的细胞群中仍保持原
7、通过纯种分离把退化菌种的细胞群中仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，扩大培养，就可有典型性状的单细胞分离出来，扩大培养，就可恢复正常。恢复正常。（1）纯种分离法纯种分离法（pure culture isolation）1.1.复壮的方法复壮的方法第13页，本讲稿共44页纯种分离的方法纯种分离的方法“菌落纯菌落纯”水平水平（pure culture in colony lever）“菌株纯菌株纯”水平水平（pure culture in strain lever）粗放粗放精细精细第14页，本讲稿共44页第15页，本讲稿共44页（2）通过宿主体复壮通过宿主体复壮针针 对对 病病 原原 菌菌从典型的
8、病灶部分分离到恢复原始独立的复壮菌株从典型的病灶部分分离到恢复原始独立的复壮菌株衰退的病原菌衰退的病原菌接种接种相应的昆虫或动、植物宿主体内相应的昆虫或动、植物宿主体内活的活的“选择性培养基选择性培养基”多次选择多次选择第16页，本讲稿共44页（3）淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体 S.microflavus“54065406”农用抗生菌的分生孢农用抗生菌的分生孢子，采用子，采用10103030的低温处理的低温处理5 57 7天，退天，退化的个体死亡，留下的化的个体死亡，留下的10102020个体是未退个体是未退化的。化的。第17页，本讲稿共44页二、菌种的保藏二、菌种的保藏菌种菌种（cult
9、ure，stock culture）是一种极其重要和珍贵的生物资源。是一种极其重要和珍贵的生物资源。菌种保藏菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）是一项十分重要的基础性工作。是一项十分重要的基础性工作。第18页，本讲稿共44页在一定时间内使菌种不死、不变、不乱在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本要求：用于长期保藏的原始菌种称为用于长期保藏的原始菌种称为保藏菌种或原种保藏菌种或原种（stoch culture）。第19页，本讲稿共44页任务：任务：广泛收集实验室和生产用菌种、菌株、病毒毒株广泛收集实验室和生产用菌种、菌株、病毒毒株（有时
10、还包括动、植物的细胞株和微生物质粒等），（有时还包括动、植物的细胞株和微生物质粒等），并将它们妥善保藏，使之不死、不衰、不乱，并将它们妥善保藏，使之不死、不衰、不乱，便于研究、交换和使用便于研究、交换和使用。国家设立专门的菌种保藏机构国家设立专门的菌种保藏机构第20页，本讲稿共44页1.1.菌种保藏的原理菌种保藏的原理首先，首先，要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体进行保藏。它们的休眠体进行保藏。其次，其次，创造一个使微生物代谢不活泼、生长受创造一个使微生物代谢不活泼、生长受抑制的环境条件。抑制的环境条件。再次，再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏
11、过添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中细胞受伤。程中细胞受伤。第21页，本讲稿共44页2.2.菌种保藏的方法菌种保藏的方法一种良好的菌种保藏方法一种良好的菌种保藏方法保持原菌的优良性状长期稳定保持原菌的优良性状长期稳定方法的通用性方法的通用性操作的简便性操作的简便性设备的普及性设备的普及性第22页，本讲稿共44页第23页，本讲稿共44页（1）定期移植保藏法定期移植保藏法操作方法：操作方法：将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生长完全后，置普通冰箱长完全后，置普通冰箱4保藏，湿度保藏，湿度5070以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。以下，棉塞换成不通气
12、橡皮塞更好。第24页，本讲稿共44页优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。缺点：时间短、传代多、易退化。缺点：时间短、传代多、易退化。低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条件，低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条件，一般一般46个月必须传代一次。个月必须传代一次。第25页，本讲稿共44页（2）液体石蜡法液体石蜡法操作方法：操作方法：生长完全的斜面上覆盖无菌的液体石蜡，生长完全的斜面上覆盖无菌的液体石蜡，液面高于斜面液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。普通冰箱保藏。第26页，本讲稿共44页加上石蜡可防止培养基水分蒸发，也可隔氧，加上石蜡可防止
13、培养基水分蒸发，也可隔氧，保藏时间保藏时间12年，除石油发酵微生物外，各类年，除石油发酵微生物外，各类微生物均可使用。微生物均可使用。注意：石蜡的纯度注意：石蜡的纯度第27页，本讲稿共44页（3）砂土保藏法砂土保藏法操作方法：操作方法：沙和土用酸浸泡去除其中的有机质，洗涤中和，沙和土用酸浸泡去除其中的有机质，洗涤中和，干燥，分装于安瓶管内，加塞灭菌，把健壮的孢干燥，分装于安瓶管内，加塞灭菌，把健壮的孢子悬液滴于砂土中搅拌均匀，真空干燥后封口，子悬液滴于砂土中搅拌均匀，真空干燥后封口，置于冰箱或干燥器中。置于冰箱或干燥器中。第28页，本讲稿共44页优点：低温、干燥、无氧、无营养，保藏效果好，优点
14、：低温、干燥、无氧、无营养，保藏效果好，时间可达几年至数十年。时间可达几年至数十年。缺点：只适用于产孢子的微生物，不能用于保藏营缺点：只适用于产孢子的微生物，不能用于保藏营养细胞。养细胞。第29页，本讲稿共44页（4）冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法操作方法：操作方法：是将液体样品（含保护剂的菌悬液）在冻结状态是将液体样品（含保护剂的菌悬液）在冻结状态下升华其中水分，最后达到干燥。培养物用无菌下升华其中水分，最后达到干燥。培养物用无菌脱脂牛奶脱脂牛奶保护剂制成菌悬液，加入安瓶中，冷保护剂制成菌悬液，加入安瓶中，冷冻、抽真空、封口。冻、抽真空、封口。第30页，本讲稿共44页第31页，本讲稿共44页第
15、32页，本讲稿共44页优点：低温、干燥、无氧、有保护剂，可保藏优点：低温、干燥、无氧、有保护剂，可保藏各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前使用最广、最有效的保藏方法。一般专业机构使用最广、最有效的保藏方法。一般专业机构大都使用此法保藏。大都使用此法保藏。缺点：不能保藏真菌菌丝。缺点：不能保藏真菌菌丝。第33页，本讲稿共44页（5）液氮保藏法液氮保藏法操作方法：操作方法：液氮温度可达液氮温度可达196。把菌悬液密封于安瓶中，。把菌悬液密封于安瓶中，置液氮罐内保藏。置液氮罐内保藏。优点：保藏效果好。优点：保藏效果好。缺点：价格昂贵。缺点：价格昂贵。第34
16、页，本讲稿共44页（6）基因工程菌保藏基因工程菌保藏携带外源基因的重组质粒通常是不稳定的，容携带外源基因的重组质粒通常是不稳定的，容易丢失易丢失。一般情况，细胞丢失了质粒，生长会。一般情况，细胞丢失了质粒，生长会加快。加快。基因工程菌的保藏是利用在抗性培养基中只有基因工程菌的保藏是利用在抗性培养基中只有含重组质粒的细胞才能生长的原理含重组质粒的细胞才能生长的原理。第35页，本讲稿共44页例如，外源例如，外源DNA插入到质粒插入到质粒pBR322中，重组质中，重组质粒转化入粒转化入E.coli中，使其含有中，使其含有Ampr和和Tetr，因此因此在培养基中加入在培养基中加入Ampicillin（
17、氨苄青霉素）氨苄青霉素）和和Tetacyclin（四环素），即可选出含有质粒四环素），即可选出含有质粒pBR322的细胞。的细胞。第36页，本讲稿共44页由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的点及现有条件等进行综合考虑。对于
18、一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。第37页，本讲稿共44页第38页，本讲稿共44页 三、菌种保藏机构三、菌种保藏机构（一）（一）国内国内 1978年年7月，月，中国微生物菌种保藏管理委中国微生物菌种保藏管理委员会员会（CCCCM）在北京成立。在北京成立。第39页，本讲稿共44页下设六个全国性菌种保藏管理中心下设六个全国性菌种保藏管理中心1.普通微生物菌种保藏管理中心普通微生物菌种保藏管理中心中科院微生物研究所：细菌、真菌中科院微生物
19、研究所：细菌、真菌中科院武汉病毒研究所：病毒中科院武汉病毒研究所：病毒2.农业微生物菌种保藏管理中心农业微生物菌种保藏管理中心中国农科院中国农科院3.工业微生物菌种保藏管理中心工业微生物菌种保藏管理中心轻工部食品发酵工业科学研究所轻工部食品发酵工业科学研究所第40页，本讲稿共44页4.医学微生物菌种保藏管理中心医学微生物菌种保藏管理中心卫生部药品生物检定所：细菌卫生部药品生物检定所：细菌中国医学科学院皮肤病研究所：真菌中国医学科学院皮肤病研究所：真菌中国医学科学院病毒研究所：病毒中国医学科学院病毒研究所：病毒5.抗生素菌种保藏管理中心抗生素菌种保藏管理中心国家医药总局四川抗生素研究所：新抗生素
20、菌种国家医药总局四川抗生素研究所：新抗生素菌种华北制药厂抗生素研究所：生产用抗生素菌种华北制药厂抗生素研究所：生产用抗生素菌种6.兽医微生物菌种保藏管理中心兽医微生物菌种保藏管理中心农业部兽医药品监察所农业部兽医药品监察所第41页，本讲稿共44页（二）（二）国外国外1.国际性机构国际性机构世界菌种保藏联合会世界菌种保藏联合会（WFCC）2.美国美国美国典型菌种收藏馆美国典型菌种收藏馆（ATCC）农业研究服务处菌种收藏馆农业研究服务处菌种收藏馆（ARS）第42页，本讲稿共44页3.荷兰荷兰真菌中心保藏所真菌中心保藏所（CBS）4.英国英国国立典型菌种收藏馆国立典型菌种收藏馆（NCTC）英联邦真菌研究所英联邦真菌研究所（CMI）国立工业细菌收藏所国立工业细菌收藏所（NCIB）第43页，本讲稿共44页5.日本日本日本微生物菌种保藏联合会日本微生物菌种保藏联合会（JFCC）东京大学应用微生物研究所东京大学应用微生物研究所（TAM）大阪发酵研究所大阪发酵研究所（IFO）6.西德西德发酵工业研究所微生物收藏馆发酵工业研究所微生物收藏馆（MIC）第44页，本讲稿共44页