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1、心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化作用 目的探讨三七总皂甙（PNS）抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化的作用及其可能的机制。方法通过反复感染柯萨奇病毒建立病毒性心肌炎慢性期小鼠模型，采纳HE和VG染色视察心肌病变和纤维增生状况，采纳病理检验方法对心肌胶原容积分数（CVF）和心肌血管四周胶原面积（PVCA）进行检测，并采纳免疫组化法及RT?PCR法检测心肌中TGF?1蛋白及其mRNA表达水平。结果病毒性心肌炎慢性期模型组小鼠心脏出现明显心肌纤维化，与正常组比较，CVF和PVCA均显著增加（P<0.01），模型组心肌中TGF?1蛋白及其mRNA表达水平均较正常组明显上升，与正常组比较，差异有显著性意
2、义（P<0.01）；三七总皂甙治疗组可以减轻心肌病变程度，CVF和PVCA示三七总皂甙各治疗组心脏中胶原比模型组均明显削减，并且三七总皂甙治疗组心肌中TGF?1蛋白及其mRNA表达水平较模型组下降。结论三七总皂甙能下调病毒性心肌炎慢性期TGF?1的表达，抑制心肌胶原的增生，提示其抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用可能部分通过抑制PDGF?BB过度表达有关。 三七总皂甙；心肌纤维化；转化生长因子；病毒性心肌炎病毒性心肌炎（viralmyocarditis，VMC）慢性期心肌纤维化（myocardialfibrosis，MF）的发病机理困难，目前尚未发觉针对性的治疗药物。现在较为确定的具有
3、抗心肌纤维化的药物有血管惊慌素转化酶抑制剂ACEI1?2,醛固酮拮抗剂3、钙拮抗剂等4，但是由于作用单一、不良反应及价格等因素影响了临床应用。因此许多学者起先广泛探讨中药对病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用，并取得了一些进展。三七总皂甙（Panaxnotoginsenosides，PNS）是五加科人参属植物三七根部提取的有效成分，现代探讨发觉PNS不但可以抑制组织纤维化的作用5?7，而且还具有爱护心肌8、抗心率失常9及调解免疫10等作用。上述作用剧烈提示PNS可能是治疗VMC慢性期心肌纤维化的志向药物，但目前还没有得到干脆的试验和临床支持，国内外也没有相应的文献报道。本试验将视察PNS对VMC
4、慢性期心肌纤维化的干预作用及对TGF?1表达的影响，探讨PNS抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用及其机制。1材料和方法1.2材料(1)病毒:柯萨奇B3病毒(Nancy株，Hep?2细胞上测定TCID50=10-5)，由复旦高校医学院附属中山医院病毒性心肌炎重点试验室供应。(2)动物雄性Balb/c小鼠，56周龄，体重1618g。购自中国科学院上海试验动物中心。(3)药物与试剂PNS由云南玉溪市维和制药有限公司供应；免疫组化检测试剂盒EnVisionTMTwo?StepHistostainingReagentLot:00002568101为丹麦DAKO公司的产品；TGF?1为Rabbit来源的
5、多克隆抗体，工作浓度均为150，为武汉博士德生物公司的产品；Trizol及逆转录试剂盒：购于上海Sangon生物工程技术公司；PCR试剂盒：购于大连宝生物工程有限公司；引物：上海Sangon生物工程技术公司合成。1.2方法1.2.1VMC慢性期心肌纤维化模型的建立、分组及给药雄性BALB/c小鼠88只，随机先分出正常比照组(N组)8只，腹腔注射无病毒EaglesMEM液0.1ml/只。其余80只腹腔接种含12000的100TCID50加CVB3的EaglesMEM液0.1ml只，以后每2周注射1次，共3次(每次病毒液浓度是前一次的2倍，注射液体量不变)，以建立病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的小鼠
6、模型，60天后存活小鼠随机分组并起先给药。分组：模型比照组：M组；三七总皂甙高剂量治疗组：T1组；三七总皂甙中剂量治疗组：T2组；三七总皂甙低剂量治疗组：T3组。给药方式：N组和M组以蒸馏水0.2mL只灌胃作为劝慰用药，T1组每只小鼠以每天0.6gkg的剂量给药0.2ml，T2组以每只小鼠每天0.4gkg的剂量给药0.2ml，T3组以每只小鼠每天0.2gkg的剂量给药0.2ml。每日灌胃1次，用药45天后处死动物作检测。1.2.2标本采集脱颈椎处死小鼠后，马上取心脏分为两部分，第一部分：取心尖、右心室（预试验发觉右心室病变较左心室重）和室间隔部，放入预先消毒和DEPC处理过的冻存管中马上置于液
7、氮中，用作RT?PCR试验。其次部分：剩余部分心肌（保证有左右心室和室间隔）马上放在10%中性缓冲福尔马林（pH7.4）固定液中固定，做石蜡包埋和切片。1.2.3HE与VG染色及CVF、PVCA测定取右心室中段横断面心肌组织，常规固定、包埋和制片，进行HE染色和VG染色，以清楚显示心肌细胞和胶原组织，光镜下视察组织形态学变更。应用HPIAS1000型图象分析仪，在VG染色下测量心肌容积分数(CVF)和心肌血管四周胶原面积(PVCA)。通过灰度调整来区分胶原和非胶原成分。计算方法：CVF=胶原面积/总面积，其中胶原面积不包含血管四周胶原面积。随机分析5个视野，取其均值作为该部位的CVF。PVCA
8、=心室壁内小动脉管腔四周胶原面积/动脉管腔面积。每一标本取4根壁内小动脉横切面进行测量，取其均值作为该部位的PVCA。1.2.4心肌组织TGF?1的检测取石蜡切片常规脱蜡入水，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10分钟，PBS洗5分钟3次，滴加一抗，4过夜。TGF?1为Rabbit来源的多克隆抗体，工作浓度为150，为武汉博士德生物公司的产品；PBS冲洗，5分钟3次，滴加山羊抗兔IgG抗体?HRP多聚体，37孵育40min，PBS冲洗，5min3次，DAB显色液显色1-3min，显微镜下限制反应，自来水冲洗终止反应，Harris苏木素液复染细胞核1min，95%、100%乙醇脱水，二甲苯透亮，中
9、性树胶封片。利用武汉同济千屏影像工程公司HPIAS?1000病理图文分析系统采集图像，半定量分析TGF?1的表达状况。即对每张切片的心肌阳性细胞的着色强度采纳HPIAS?1000病理图文分析系统进行测量。每张切片随机采集5个视野（200倍），经过该系统自动分析获得该5个视野的5个平均光密度值，经计算机平均后代表该标本的染色强度，然后进行整理及统计分析。1.2.5心肌组织TGF?1mRNA含量测定Trizol一步法抽提总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见5S、18S和28S三条带,说明RNA完整没有降解，可作为逆转录反应的模板。通过逆转录合成cDNA。取RNA抽提液2L加98L无RNA酶去离子水混
10、匀，Du?640紫外分光光度仪测OD260/OD280，检测核酸浓度，计算核酸量。TGF?1上游引物为5?GAGGGGGAGGAGGAGTGGGA?3，下游引物为5?CCGGGTAGCGATCGAGTGTC?3，产物长度169bp；GAPDH上游5GAGGCCGGTGCTGAGTATGT3，下游5CTTCTGGGTGGCAGTGATGG3，产物长度294bp；TGF?1的反应条件：95，5分，预变性；94，30秒，变性；61，20秒，退火；72，20秒，延长；72，7分，终末延长；35个循环，4保温；GAPDH的反应条件：95，5分，预变性；94，30秒，变性；60，20秒，退火；72，30秒
11、，延长；72，7分，终末延长；35个循环，4保温。以基因GAPDH作为内参照，经1.5%琼脂糖凝胶（含EB）电泳，紫外光下拍照，电泳结果用Syngene成像分析系统（英国）进行扫描及灰度分析，对阳性电泳条带进行吸光度峰值下面积积分，每一样本以TGF?1和GAPDH条带吸光度积分的比值作为样本的表达的量。1.3统计学方法试验数据以均数标准差（xs）表示，应用SPSS11.5统计软件包进行统计分析处理，多组间比较采纳单因素方差分析，多组间两两比较方差齐性时采纳最小有意义差异法（LSD）检验，方差不齐时采纳DunnettsT3检验。2结果2.1一般结果首次感染柯萨奇病毒后的小鼠第三天起先出现耸毛、懒
12、动、拱背等状况，其次次，第三次感染柯萨奇病毒后，小鼠也出现耸毛、懒动、拱背等状况，但反应较前减轻，整个造模过程小鼠共死亡20只，死亡率25%。2.2各组小鼠心肌组织病理变更状况N组小鼠心肌细胞呈短圆柱状，细胞结构清楚，胞核卵圆形，清楚可见，肌纤维排列紧密有序，心肌横纹清楚，未见肌纤维溶解、单核细胞浸润及心肌细胞坏死；心肌胶原纤维主要分布在血管四周，心肌细胞间有少量的胶原纤维；M组心肌细胞排列紊乱，胞浆较正常色淡，心肌横纹不清，炎症细胞少许可见，可见钙化灶，病变以右心室明显；而且M组除血管四周有胶原纤维外，心肌细胞间有大量犬牙交错的胶原纤维，排列紊乱；各治疗组心肌细胞的病变要较模型比照组轻，且胶
13、原纤维的量也少于模型比照组，其中以T1组病变程度减轻最为明显。2.3CVF与PVCA的测定结果各组CVF与PVCA的测定结果显示，模型组心肌胶原容积分数(CVF)和心肌血管四周胶原面积(PVCA)与正常组比较均明显上升，统计学分析差异有显著性，三七总皂甙高、中剂量治疗组CVF和PVCA和模型组比较均有明显降低，统计学分析差异有显著性，三七总皂甙低剂量组CVF和PVCA和模型组比较降低，统计学分析差异无显著性（表1）。表1各组CVF和PVCA测定值的比较（略）与正常组比较,*P<0.01；与模型组比较,P<0.052.4各组小鼠心肌组织TGF?1表达的改变TGF?1在心肌细胞的胞浆及
14、间质内表达，在N组小鼠的心肌胞浆可见较少量黄色颗粒物质，TGF?1表达呈弱阳性（图1）；M组小鼠心肌细胞胞浆内布满棕黄色颗粒状物质，TGF?1呈高表达（图2），各治疗组TGF?1表达较M组表达均明显削减，统计学分析差异显著性，其半定量分析结果见表2（图3、4、5）。2.5各组小鼠心肌组织TGF?1mRNA表达的改变：N组TGF?1mRNA表达低；M组TGF?1mRNA表达较N组明显增高（P<0.01）；三七总皂甙各治疗组TGF?1mRNA表达与M组比表达降低，但统计学分析差异无显著性(见表2、图6)。表2各组小鼠心肌组织TGF?1表达的改变（略）与正常组比较,*P<0.01；与模型
15、组比较,P<0.05；与模型组比较,P>0.05图1正常组TGF?1免疫组化结果（200）（略）图2模型组TGF?1免疫组化结果（200）（略）图3PNS高剂量治疗组TGF?1结果（200）（略）图4PNS中剂量治疗组TGF?1免疫组化结果（200）（略）图5PNS低剂量治疗组TGF?1免疫组化结果（200）（略）图6心肌组织TGF?1mRNA的表达（略）3探讨病毒性心肌炎慢性期的主要病理改变为心肌纤维化11，心肌纤维化是指心肌间质中胶原浓度显著上升或胶原容积分数(CVF)显著高于正常值。而胶原的过度沉积对心脏的功能会产生一系列的影响，可引起心脏僵硬度增加，舒张功能障碍及心肌电传导
16、异样等病理改变，是出现心力衰竭、心律失常、心脏性猝死等并发症以及由心肌炎发展到心肌病的主要缘由。因此预防及限制心脏间质胶原增生是病毒性心肌炎慢性期治疗的重要环节。本探讨利用反复注射CVB的方法复制病毒性心肌炎小鼠心肌纤维化的模型，用PNS进行治疗。发觉用药45天后，模型比照组小鼠心脏组织中胶原积累明显增加，而三七总皂甙能明显减轻心脏组织中胶原的沉积，提示三七总皂甙具有抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用。心肌中胶原的过度沉积是由于胶原的生成大于降解的结果，胶原的生成和降解之间的动态平衡涉及一系列的调控因素，其中TGF?1是一种细胞外间质的重要调整因子，可以促进间质胶原的合成，抑制胶原的降解。心
17、肌中TGF?1的分泌，主要由心肌细胞和心肌成纤维细胞分泌。现代探讨发觉TGF?1以旁分泌/自分泌方式在心肌纤维化过程中起重要作用，其可刺激心脏成纤维细胞中、型胶原基因的表达，也可调整其胶原酶活性，削减胶原降解12。并且有探讨发觉病毒性心肌炎慢性期胶原的沉积增多与TGF?1的持续高表达有着亲密的关系13。韩福生等也证明病毒性心肌炎慢性期TGF?1可通过上调TIMP?1mRNA的表达，使TIMPMMP比值增加，从而导致胶原在代谢中降解不足，使心肌间质胶原纤维含量增加发生过度沉积。因此可见抑制病毒性心肌炎慢性期心肌中TGF?1的持续高表达是治疗病毒性心肌炎慢性期心脏间质纤维化的重要途径之一14。此次试验结果显示，模型组TGF?1的表达水平均高于正常组，提示病毒性心肌炎慢性期心肌中TGF?1的高表达可能是病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌中间质过度沉积的缘由之一，而三七总皂甙治疗组TGF?1的表达水平明显低于模型组，提示三七总皂甙可以在肯定程度上通过下调小鼠心肌组织中TGF?1的表达来抑制VMC慢性期心肌胶原的增生，并且这种作用有随着剂量递增而增加的倾向。但三七总皂甙详细经什么途径抑制TGF?1的表达，目前尚不清晰，有待于进一步深化探讨。