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1、第十章.基因功能的研究方法（一）一、计算机预测基因功能二、实验确认基因功能1基因失活是功能分析的主要手段1.11.1基因敲除基因敲除（Geneknock-outGeneknock-out）1.21.2基因敲除的技术路线基因敲除的技术路线1.31.3基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展1.41.4基因失活的表型效应有时不易分辨基因失活的表型效应有时不易分辨2转座子突变库的构建2.12.1插入序列插入序列2.22.2实验步骤实验步骤3内含子归巢突变4基因的超表达用于功能检测5.反义RNA5.15.1反义反义RNARNA的分类和作用机制的分类和作用机制5.2t
2、icRNA5.2ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)5.35.3反义反义RNARNA的功能的功能5.3.15.3.1调控细菌基因的表达调控细菌基因的表达5.3.25.3.2噬菌体溶菌噬菌体溶菌/溶源状态的控制溶源状态的控制 IS10IS10转位作用的抑制转位作用的抑制5.45.4人工合成构建反义人工合成构建反义RNARNA5.55.5使反义使反义RNARNA分子稳定的方法分子稳定的方法三、其他的基因功能研究方法噬菌体展示(phagedisplay)酵母双杂
3、交(yeasttwo-hybridization)2.12.1概念概念2.22.2实验步骤实验步骤2.32.3利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能2.42.4利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.52.5利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响之间相互作用的影响2.62.6利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(GenomeProtein(GenomeProteinLinkag
4、eMapLinkageMap）3.开放读框顺序标签(open-reading-framesequence(open-reading-framesequencetags,OSTstags,OSTs）u确认DNA顺序中的基因序列基因序列后，下一个问题就是探知其功能探知其功能，这是基因组研究的一个难度很大的领域。u一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们所了解的基因组内容基因组内容比真实的情况少的多。如大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前已经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突变鉴定，但实际上还有很多空白。大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知道的只
5、有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母，所知更少，仅为30%。一、计算机预测基因功能一、计算机预测基因功能计算机预测基因功能的依据仍然是同同源性比较源性比较。同源基因都有1个共同的祖先基因，他们之间有许多相似的顺序。同源基因可以分为2类：种种种种间间间间同源基因同源基因同源基因同源基因或或直系基因直系基因直系基因直系基因(orthologousgeneorthologousgene)这是这是指不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔指不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之前的同一祖先。之前的同一祖先。种种种种内内内内同源基因同源基因同源基因同源基因或或平行基因平行基因平行基因平行基因(pa
6、ralogousgeneparalogousgene)同一同一种生物内部的同源基因，它们常常是种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族多基因家族的不同成员的不同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种，其共同的祖先基因可能存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。形成之后，也可能出现于物种形成之前。同源基因同源基因同源基因同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因为这两个基因在出现后为这两个基因在出现后独立的发生随机突变独立的发生随机突变，但，但它们有它们有相似的顺序组成相似的顺序组成，大部分，大部分未未突变的核苷酸突变的核苷酸位置位置是相同的。是相同的。当
7、一个当一个新的基因序列被确认新的基因序列被确认后，根据同源性可从后，根据同源性可从数据库中数据库中查找已知顺序的同源基因查找已知顺序的同源基因。根据。根据进化的进化的相关性相关性可从可从已知的同源基因已知的同源基因推测新基因的功能。推测新基因的功能。推测新基因的功能。推测新基因的功能。根据同源性预测基因时必需注意以下几点根据同源性预测基因时必需注意以下几点：1.1.一般认为aa的一致性或相似性在25%以上以上可视为同源基因；2.2.同源性同源性与相似性相似性的含义不同，如aa顺序的80%的相似性不能称为同源性。3.3.一致性一致性常指同一位置同一同一位置同一aa在整个多肽序列中所占的比例，而相
8、似性相似性除一致性aa外还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的比例总是高于一致性aa。同源性分析可以给出整个基因或同源性分析可以给出整个基因或某一区段功能的信息某一区段功能的信息同源查询同源查询同源查询同源查询除了直接比较除了直接比较DNADNA顺序外，还可将顺序外，还可将DNADNA顺序顺序翻译为翻译为aaaa顺序顺序。由于组成蛋白质的。由于组成蛋白质的aaaa有有2020多多种，而种，而DNADNA核苷酸只有核苷酸只有4 4种，因此种，因此aaaa顺序的差异顺序的差异要要比比核苷酸的差异核苷酸的差异大的多大的多大的多大的多。以以以以aaaa顺序顺序顺序顺序进行同源性比较进行同源性比较进行
9、同源性比较进行同源性比较的结果的结果更为准确更为准确更为准确更为准确，也，也更更更更加可行加可行加可行加可行。已有许多软件可用于这项分析，常用的。已有许多软件可用于这项分析，常用的是是BLASTBLAST。研究者只要将资料以。研究者只要将资料以正确格式的电子正确格式的电子邮件邮件发送到发送到DNADNA资料库资料库BLASTBLAST服务站，很快就会服务站，很快就会得到回音。得到回音。有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出现局部相似的区段。这种情况表明，2个无亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相似的顺序是功能的核心区域功能的核心区域。虽然基因本身基因本身无共同的祖先，但其功能域其功能域却有共
10、同的起源。它们都是古老祖先的后裔，在进化中一方面发生独立突变独立突变，另一方面又因基因组重排基因组重排成为新基因的组成部分。例如信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基个基本的功能域本的功能域，即接受接受信号的功能域和传达传达信号的激酶域。二、实验确认基因功能二、实验确认基因功能 同源性分析并非万灵药方，对许多同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能新基因的功能分析分析还必需还必需依赖其他的实验手段依赖其他的实验手段进行补充，并将进行补充，并将同源性研究的结果进一步同源性研究的结果进一步外延外延。如何如何确定一个基因的功能确定一个基因的功能确定一个基因的功能确定一个基因的功能是是基因组计划基因
11、组计划基因组计划基因组计划中最困难中最困难的问题之一。的问题之一。大多数分子生物学家认为大多数分子生物学家认为现有的技术与策略现有的技术与策略对于对于从基因组测序所获得的大量从基因组测序所获得的大量未知基因未知基因的的功能研究功能研究是远远不够的。是远远不够的。基因的功能是一个过程，是从基因的功能是一个过程，是从基因到表型基因到表型的一系的一系列反应。列反应。传统的遗传分析传统的遗传分析传统的遗传分析传统的遗传分析是是从表型出发从表型出发从表型出发从表型出发最终到达最终到达基因基因基因基因；现在的基因功能研究现在的基因功能研究现在的基因功能研究现在的基因功能研究是是从基因出发从基因出发从基因出
12、发从基因出发直接推导直接推导表型表型表型表型。因此必须寻找一系列的实验方法来因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基鉴别与目标基因相关的因相关的表型表型表型表型。1基因失活是功能分析的主要手段基因失活是功能分析的主要手段传统的遗传分析主要借助突变型突变型研究表型变异的遗传基础，利用紫外线诱导及化学试剂处理可使生物群体产生突变个体，也可从自然的群体中发现突变体。经遗传分析将突变基因定位将突变基因定位，然后观察这一突变体是否与改变的表型对应。在此基础上采用分子生物学方法进一步分离与克隆目标基因。所谓定位克隆定位克隆就是根据与突变位点连锁连锁的分子标记，然后通过物理图寻找靶位点。上述传统遗传学分析
13、的原理同样可用来设计从基因到表型的研究。如果我们能找到某种方法，根据待测基因的顺序待测基因的顺序使生物体内该基因失活该基因失活，亦可鉴别由此产生的表型表型变异变异。1.1基因敲除基因敲除（Geneknock-out）概念：基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。即可以是用突变基因突变基因或其它基因其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。80年代初，胚胎干细胞胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定
14、了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。1.2基因敲除的技术路线基因敲除的技术路线如下：构建重组基因载体；用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内；用选择培养基筛选已击中的细胞；将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。Note:基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低，约为百万百万分之一分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来
15、是一件非常困难的工作。因此，同源重组的同源重组的筛选和检测筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题关键问题。目前已有多种筛选方法多种筛选方法，其中1988年犹它大学的Capecchi教授的研究组发展的正负双向正负双向选择系统选择系统适用范围宽且效率较高。1.3基因敲除主要应用领域及国内外研究基因敲除主要应用领域及国内外研究进展进展基因敲除的应用领域主要有：建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料；改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能；治疗遗传病；改造生物、培育新的生物品种。l lES细胞基因敲除途径细胞基因敲除途径建立转基因小鼠技术的成熟，首次使体外精细的基因操作与小鼠的整个
16、生长发育和生命过程得到了直接的结合结合，为探讨高等动物基因组结构和功能提供了有效的方法。l l由基因敲除技术产生出的特殊小鼠已经对哺乳类生物学的各领域，包括发育生物学、癌生物学、免疫学、神经生物学和人类遗传学产生了极大影响。l l理论上，基因敲除可适用于任何能产生ES细胞的物种，将来可在小鼠基因敲除成熟的基础上开展其它实验动物的基因敲除工作。建立人类疾病的建立人类疾病的转基因动物模型转基因动物模型，为医学，为医学研究提供材料研究提供材料基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分子基础及诊断治疗的重要实验材料。如1989年囊性纤维化病（CF）的致病基因（CFTR）被成功地克隆；1992年成功建立了CF
17、TR基因的基因敲除的CF小鼠模型，为CF基因治疗提供了很好的动物模型，得以顺利通过了基因治疗的动物试验；于1993年开始临床试验并获得成功。改造动物基因型，鉴定新基因和改造动物基因型，鉴定新基因和/或或其新功能，研究发育生物学其新功能，研究发育生物学深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现，可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用，为研究基因的功能和生物效应提供模式。例如，目前人类基因组研究人类基因组研究多由新基因序列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在小鼠上观察该基因缺失引起的表型变化。目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、LTD有缺陷的基因敲除动物，发现多种基因在学习、记忆的形成过程
18、中必不可少。治疗遗传病治疗遗传病这包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗的目的。改造生物、培育新的生物品种改造生物、培育新的生物品种细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着广阔的应用前景。1.4基因失活的表型效应有时不易分辨基因失活的表型效应有时不易分辨通过上述种种方法得到的通过上述种种方法得到的携带失活基因携带失活基因的品系与的品系与个体后，下一步工作就是个体后，下一步工作就是检测突变体表型检测突变体表型以便以便指指认认未知基因未知基因未知基因未知基因的的具体功能具体功能。这
19、一步也会遇到难题，。这一步也会遇到难题，生物表型范畴很广生物表型范畴很广。即使单细胞的即使单细胞的酵母酵母酵母酵母，要确认，要确认一个未知基因对表型一个未知基因对表型的贡献的贡献，也可列出很长的一串名单。，也可列出很长的一串名单。至于高等生物，因其至于高等生物，因其某些表型某些表型具有具有难以捉摸的综难以捉摸的综合性合性，区分其，区分其准确的功能准确的功能准确的功能准确的功能更加棘手。更加棘手。2转座子突变库构建转座子突变库构建转座子标签法又称基因标签基因标签(genetagging)，通过构建插入突变库系统构建插入突变库系统，分离与克隆功能基因与调控顺序功能基因与调控顺序。这一策略主要依据以
20、下技术：l植物体细胞全能性体细胞全能性；l已经建立了一套成熟的转基因系统转基因系统，使外源基因在转基因植株中成功表达。植物中有许多转座子系统，它们的转座机制已经清楚，通过转座子的随机插入可获得大量的突变型大量的突变型，根据插入的转座子序列转座子序列合成探针，可分离被破坏的位点，并分析它们的组成。转座子可以发生回复突变回复突变，从插入的座位脱离，使突变系重现野生型表型。目前应用的最成功的是玉米的Ac-Ds转座因转座因子子系统。基因标签突变库突变库的工作原理如下：玉米色粒调控元件玉米色粒调控元件Ac-Ds系统：第9染色体C基因：色素合成基因。Ac基因：自主自主移动的调节因子，4.5kb，5个exo
21、n，编码转座酶。Ds基因：非自主非自主移动的受体因子，0.54.0kb，与Ac有同源序列，插入引起色素不能合成。2.1插入序列插入序列(insertionsequence,IS)仅含有转座酶基因的简单转移序列。长度多在7001500bp左右。由末端反向重复序列(IR)，转座酶基因组成。插入基因组中时，在靶位上生成正向重复序列正向重复序列(DR)常见的IS结构。l lISIS长度长度末端末端IRIR靶位靶位DRDR插入选择插入选择IS1768239IS1768239随机随机IS213274195IS213274195热点热点IS4142818IS4142818（1212）AAAN20TTTAAA
22、N20TTTIS51195164IS51195164热点热点IS101329229TNAGCNIS101329229TNAGCNIS50153199IS50153199热点热点2.2实验步骤实验步骤l l将将AcAc因子因子转座酶的编码基因转座酶的编码基因与组成型启动子与组成型启动子如如35S35S构建成构建成嵌合基因表达载体嵌合基因表达载体嵌合基因表达载体嵌合基因表达载体，由于，由于除去了除去了除去了除去了转座因子两侧的反向重复顺序转座因子两侧的反向重复顺序，转座酶的编码，转座酶的编码基因不能自我转座。这一表达载体转化细胞获基因不能自我转座。这一表达载体转化细胞获得的得的再生植株为再生植株为
23、（sAcsAc）。l l外显子捕获载体外显子捕获载体构建：在转座子的构建：在转座子的边界顺序与边界顺序与标记基因之间标记基因之间插入插入内含子剪接受体顺序内含子剪接受体顺序内含子剪接受体顺序内含子剪接受体顺序，将它，将它们转化细胞获得再生植株们转化细胞获得再生植株B B。将植株和植株将植株和植株B B杂交，在转座酶的作用下来自植杂交，在转座酶的作用下来自植株株B B的转座子可以切离与转座。当它们插入到某一的转座子可以切离与转座。当它们插入到某一外显子中时，基因转录加工后可能获得含正确读外显子中时，基因转录加工后可能获得含正确读框的框的mRNAmRNA。根据。根据突变表型突变表型突变表型突变表型
24、与与标记基因标记基因标记基因标记基因的的共分离共分离共分离共分离筛选转化无性系筛选转化无性系，通过，通过自交自交自交自交可得到可得到纯合纯合纯合纯合的的不含转不含转不含转不含转座酶基因的插入突变系座酶基因的插入突变系座酶基因的插入突变系座酶基因的插入突变系。增强子捕获载体将增强子捕获载体将核心启动子核心启动子核心启动子核心启动子TATATATA盒框盒框盒框盒框与与标记基标记基标记基标记基因因因因编码顺序连接，然后在其编码顺序连接，然后在其两侧安装转座子边界两侧安装转座子边界，转化细胞获得转化细胞获得再生植株再生植株再生植株再生植株C C。将植株。将植株A A与植株与植株C C杂交，杂交，在转座
25、酶的作用下在转座酶的作用下来自植株来自植株C C的转座子的转座子可以转移到可以转移到增强子下游启动标记基因表达。采取类似增强子下游启动标记基因表达。采取类似4 4的方法的方法分离纯合的插入突变系，进一步检测增强子的组分离纯合的插入突变系，进一步检测增强子的组织特异性表达场所。织特异性表达场所。l l上述方法用于拟南芥的基因打靶(genetargeting)取得了很好的效果，并已应用于水稻，玉米等作物的功能基因分离。但它们也有2点不利之处：插入突变往往是隐性隐性的，必须建立自交的F2代群体才能找到突变株系；植物基因组有大量的冗沉基因冗沉基因，它们可取代突变基因的功能，很多突变的效果不易鉴定。改进
26、方法为采用功能增益突变路线功能增益突变路线，即在转座子边界内部加入强启动子强启动子。3内含子归巢突变内含子归巢突变什么是内含子归巢什么是内含子归巢?在在I I类类II II类的某些内含子中含有类的某些内含子中含有开放读框开放读框，可产生具有三种功能的蛋白。，可产生具有三种功能的蛋白。这些蛋白可使内含子这些蛋白可使内含子（或以其原来的（或以其原来的DNADNA形式，形式，或作为或作为RNARNA的的DNADNA拷贝）拷贝）移动移动移动移动(mobile)(mobile)，使，使内含内含子可插到一个新的靶位点子可插到一个新的靶位点，这个现象叫做，这个现象叫做归巢归巢归巢归巢（hominghomin
27、g）。）。I I组和组和II II组内含子分布很广，在真核和原核细胞中组内含子分布很广，在真核和原核细胞中都有发现。都有发现。在这些内含子的开放读框中编码具有三种三种功能的蛋白功能的蛋白，这些蛋白与DNA或RNA的代谢有关。核酸内切酶：在DNA的靶位点剪切，使内含子得以插入；反转录酶：涉及将内含子RNA变成DNA拷贝；成熟酶：从前体的RNA中切掉内含子的部分。第第I组内含子组内含子具有编码核酸内切酶的开放读框；有时成熟酶的活性和此蛋白有关。第第II类内含子类内含子具有编码核酸内切酶和反转录酶的序列，另外成熟酶的活性也与此蛋白有关。在有些情况下还具有与其它酶活性相关联的成熟酶功能的遗传信息，成熟
28、酶成熟酶主要功能主要功能是使内含子的构象稳定，这于剪接来说是很必要的。现已知道有些第第I组内含子组内含子编码核酸内切酶，它们的作用是帮助内含子在杂交中能插入到其不同等位基因的座位中。在真菌的线粒体中普遍存在着内含子的多态性或者缺乏内含子，有种观点认为内含子来源于基因的插入基因的插入。通过分析酵母线粒体的大的rRNA基因在杂交中的重组，另一种观点认为以上的现象是基因的丢失基因的丢失。u在第第I组内含子组内含子中含有编码序列。这些内含子存在于“+”的酵母酵母品系中，但另一品系“-”中缺乏此内含子，将+和-进行杂交杂交其后代通常都是+。如果我们将如果我们将+品系品系看作看作供体供体供体供体，将，将-
29、品系品系前成前成受受受受体体体体，我们从，我们从+-杂交中会发现杂交中会发现-基因组中产生基因组中产生了了内含子的新拷贝内含子的新拷贝内含子的新拷贝内含子的新拷贝，结果使全部后代都表现为，结果使全部后代都表现为+。在两个在两个亲本任何一个亲本任何一个亲本任何一个亲本任何一个都可发生都可发生突变突变突变突变而抑制以上而抑制以上的的归巢归巢归巢归巢。突变突变突变突变的结果的结果使杂交后代中出现了使杂交后代中出现了正常分离正常分离，即，即+和和-的后代中出现了正常分离，即的后代中出现了正常分离，即+和和-的后代的后代数相等。这种突变表明了这个过程的性质。数相等。这种突变表明了这个过程的性质。在在+的
30、品系中的品系中突变突变突变突变发生在发生在紧靠着内含子紧靠着内含子将要将要插入插入的位点的位点。在。在-品系中品系中突变突变突变突变发生在内含子的开放读发生在内含子的开放读框框中，从而阻止了蛋白质的合成。这表明在中，从而阻止了蛋白质的合成。这表明在+品品系中的内含子编码的蛋白识别系中的内含子编码的蛋白识别-品系的靶位点品系的靶位点，将其切开，并将内含子的一个新拷贝插入切开的将其切开，并将内含子的一个新拷贝插入切开的靶位点中，使之变成靶位点中，使之变成+品系，而且能稳定地遗传。品系，而且能稳定地遗传。l l这种蛋白的作用是什么呢？这种蛋白的作用是什么呢？内含子内含子内含子内含子的产物是一种的产物
31、是一种核酸内切酶核酸内切酶，它能，它能识别识别-基因基因并将它作为靶点并将它作为靶点切开切开其双链其双链。这种核酸内切酶识别。这种核酸内切酶识别18bp18bp的靶序列，此含的靶序列，此含有内含子插入位点。靶序列的剪切是在每条链插入有内含子插入位点。靶序列的剪切是在每条链插入位点的位点的33端这一侧端这一侧2 2个碱基处个碱基处交错切，这样剪切位交错切，这样剪切位点占点占4 4个个bpbp，产生了凸出的单链末端。，产生了凸出的单链末端。l l这种类型的剪切是和这种类型的剪切是和转座子移到新位点转座子移到新位点的机制有关。的机制有关。双链的断裂双链的断裂起始了基因的转变起始了基因的转变起始了基因
32、的转变起始了基因的转变，在转变中，在转变中+基因序基因序列产生了一个新拷贝取代列产生了一个新拷贝取代-基因，这个过程涉及基因，这个过程涉及通通过过复制机制复制机制复制机制复制机制进行转座进行转座，且仅在，且仅在DNADNA水平水平上发生或以上发生或以DNADNA取代取代的方式，或以的方式，或以模板转换模板转换的方式（与的方式（与重组修重组修复复相类似）来完成。要注意相类似）来完成。要注意内含子的插入内含子的插入中断了内中断了内切酶对这个序列的识别切酶对这个序列的识别，这样使其稳定。，这样使其稳定。l l其它含有开放读框的第第I类内含子类内含子也可以移动。内含子永久存在的机制内含子永久存在的机制
33、是相同的：内含子编码的核酸内切酶剪切内含子将之插入特殊的靶位点。l l插入的细节是有不同的。例如T4噬菌体td内含子所编码的核酸内切酶就是在靶位点上游24bp处剪切，然后内含子本身插入这个位点，而不是其新产生的拷贝。l l虽然内含子移动的机制是共同的，但虽然内含子移动的机制是共同的，但靶位点的序列靶位点的序列和和内含子编码区域内含子编码区域之间并之间并无同源性无同源性无同源性无同源性。据推测内含子。据推测内含子有一个共同的进化区域，但很明显它们有很大的有一个共同的进化区域，但很明显它们有很大的歧歧歧歧化化化化。靶位点是在各种靶序列中。靶位点是在各种靶序列中最长的最长的最长的最长的，对于核酸内，
34、对于核酸内切酶来说也是切酶来说也是最特异最特异最特异最特异的。结果的。结果内含子永久性地插入内含子永久性地插入到单个的靶位点中到单个的靶位点中，而且不插入基因组的任何其他，而且不插入基因组的任何其他地方，此就称为地方，此就称为内含子归巢内含子归巢内含子归巢内含子归巢(intronhoming)(intronhoming)。l l含有编码核酸内切酶序列的内含子在不同细菌和低含有编码核酸内切酶序列的内含子在不同细菌和低等真核生物中都有所发现。由此产生一种等真核生物中都有所发现。由此产生一种游离的因游离的因游离的因游离的因子子子子，其编码的功能涉及到，其编码的功能涉及到RNARNA的剪接的剪接的剪接
35、的剪接或者或者DNADNA分子分子分子分子之间的移动之间的移动之间的移动之间的移动。与此相关的观点认为。与此相关的观点认为内含子编码区域内含子编码区域中密码子的用法与外显子稍有不同中密码子的用法与外显子稍有不同。l l在在第第第第类内含子类内含子类内含子类内含子中大部分开放读框都具有中大部分开放读框都具有一个与反转一个与反转录转座子相关的区域录转座子相关的区域（除（除核酸内切酶编码区核酸内切酶编码区之外）。之外）。这种类型的内含子在这种类型的内含子在低等真核生物低等真核生物低等真核生物低等真核生物和和某些细菌某些细菌某些细菌某些细菌中都中都有发现。有发现。反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶对于内
36、含子来说是对于内含子来说是特异的特异的，而且，而且和归巢有关和归巢有关。反转录酶以初始。反转录酶以初始mRNAmRNA为模板合成内为模板合成内含子的含子的DNADNA拷贝，通过采用与反转录病毒相似的机拷贝，通过采用与反转录病毒相似的机制使内含子插入到靶位点中。和这种情况有关的此制使内含子插入到靶位点中。和这种情况有关的此种类型的反转录转座子与种类型的反转录转座子与失去失去LTRsLTRs的一组反转录子的一组反转录子是相似的。在靶位点产生是相似的。在靶位点产生缺口缺口缺口缺口，形成的，形成的3-OH3-OH对于引对于引发来说是需要的。发来说是需要的。l l第第类内含子类内含子归巢的例子与前面介绍
37、的反转反转录转座子录转座子转座的机制相似，内切酶在靶位点的双链DNA上切一切口，在缺口上产生了3末端为反转录酶提供了引物引物。内含子RNA为cDNA的合成的合成提供了模板。由于此RNA含有内含子两侧的外显子的序列，所以此cDNA要比内含子本身长，它能跨越双链切口，结果是使内含子插入到靶位点。l l将一种核糖核蛋白和DNA底物的一道温育在体内可产生移动系统。这个核糖核蛋白含有一个带有第第II组内含子组内含子的RNA和它的蛋白产物。它具有核酸内切酶活性，在恰当的靶位点交错切割双链。核糖核蛋白的RNA和蛋白两种成份对于剪切都是需要的。在催化中二者可能都有作用。l l可移动的内含子似乎是被插入到先前存
38、在的基因中。它们可能进化为核内前体-mRNA内含子。具有自我剪切的能力的内含子显示了剪接进化的重要作用。例如它们能移动到核中并成为snRNA的祖先。l l内含子归巢突变内含子归巢突变内含子归巢突变内含子归巢突变就是利用归巢特性，将它们插到就是利用归巢特性，将它们插到大肠杆菌的质粒载体中，另外再将人类大肠杆菌的质粒载体中，另外再将人类HIVHIV病毒病毒和和CCR5CCR5基因靶位基因靶位DNADNA构建到另一载体中。当这构建到另一载体中。当这2 2类载体在大肠杆菌或人类体外培养细胞中相遇，类载体在大肠杆菌或人类体外培养细胞中相遇，内含子内含子RNARNA可以逆剪切方式插入到可以逆剪切方式插入到
39、HIVHIV和和CCR5CCR5DNADNA靶位中，而且表现为某种随机性。当内含子靶位中，而且表现为某种随机性。当内含子反向插入基因内部时，由于不表达反向插入基因内部时，由于不表达IEPIEP，成为永久，成为永久整合。当内含子插入方向与整合。当内含子插入方向与IEPIEP转录方向一致时，转录方向一致时，内含子可以继续转移破坏其他位点。这一系统可内含子可以继续转移破坏其他位点。这一系统可望用于望用于缺少同源重组系统生物的功能基因组研究缺少同源重组系统生物的功能基因组研究缺少同源重组系统生物的功能基因组研究缺少同源重组系统生物的功能基因组研究。4基因的超表达用于功能检测基因的超表达用于功能检测 l
40、 l基因功能的检测除了使其失活外还可让其过量表达，基因产物的不足与过量都会破坏这种平衡，表现生长与发育的异常异常。l l基因的超表达基因的超表达有两种技术：1.增加基因的拷贝数；2.采用强启动子促使基因表达 5.反义反义RNA反义反义RNA(antisenseRNA)RNA(antisenseRNA)是指是指mRNAmRNA互补的互补的RNARNA分分子。这种反义子。这种反义RNARNA能与能与mRNAmRNA分子特异性地互补结分子特异性地互补结合，从而抑制该合，从而抑制该mRNAmRNA的加工与翻译的加工与翻译，是，是原核细胞原核细胞原核细胞原核细胞中基因表达的调控的一种方式。然而，许多实验
41、证中基因表达的调控的一种方式。然而，许多实验证明，在明，在真核细胞真核细胞真核细胞真核细胞中亦存在反义中亦存在反义RNARNA，但其功能尚，但其功能尚未全部明了。未全部明了。最近几年来通过人工合成反义最近几年来通过人工合成反义RNARNA的基因，并将之的基因，并将之导入细胞内，转录出反义导入细胞内，转录出反义RNARNA，即能，即能抑制特定基抑制特定基因的表达因的表达，阻断该基因的功能阻断该基因的功能，有助于了解该基因，有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。同时也暗示了该方法对细胞生长和分化的作用。同时也暗示了该方法对对肿瘤实施基因治疗肿瘤实施基因治疗的可能性。的可能性。5.1反义反义RNA
42、的分类和作用机制的分类和作用机制下表总结了原核细胞内天然存在的11种反义RNA。这些反义RNA按其作用机制可经分为三大类三大类。类类：这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列序列和/或编码区编码区，引起翻译的直接抑制(A类类)或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶酶的敏感性增加，使其降解降解(B类类)。类类：这类反义RNA与mRNA的SD序列的序列的上游上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚，可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。类类：这类反义RNA可直接抑制靶m
43、RNA的转录转录。5.2 ticRNAtranscriptioninhibitorycomplementaryRNAticRNA是大肠杆菌中CAP蛋白(cAMP结合蛋白)的mRNA的反义RNA。ticRNA的基因的启动子可被cAMP-CAP复合物所激活，从CAPmRNA的转录起始位点上游3个核苷酸处开始，以CAPmRNA的模板DNA链的互补链为模板，合成ticRNA。ticRNAticRNA具体长度不清楚，但是它是具体长度不清楚，但是它是55端一段端一段端一段端一段正好和正好和CAPmRNACAPmRNA的的55端端有有不完全的互补不完全的互补，可以形成双链，可以形成双链的的RNARNA杂交体
44、。而在杂交体。而在CAPmRNACAPmRNA上紧随杂交区之后上紧随杂交区之后的是一段约长的是一段约长11bp11bp的的A A，U U丰富区。这样的结构十丰富区。这样的结构十分类似于分类似于 不依赖性的转录终止子的结构不依赖性的转录终止子的结构，从而，从而CAPmRNACAPmRNA的转录的转录刚刚开始不久后即迅速终止。从刚刚开始不久后即迅速终止。从这个例子中我们可以看到这个例子中我们可以看到CAPCAP蛋白合成的自我调节蛋白合成的自我调节作用作用。当。当CAPCAP合成达一定量合成达一定量后，即可与后，即可与cAMPcAMP结合结合成成cAMP-CAPcAMP-CAP复合物。再复合物。再激
45、活激活激活激活ticRNAticRNA的启动子的启动子的启动子的启动子转录转录出出ticRNAticRNA，反过来反过来抑制抑制抑制抑制CAP-mRNACAP-mRNA的合成的合成。5.3反义反义RNA的功能的功能u在原核生物中反义RNA具有多种功能，例如调控质粒的复制及其接合转移，抑制某些转位因子的转位，对某些噬菌体溶菌-溶源状态的控制等。u下文仅举数例：5.3.1调控细菌基因的表达调控细菌基因的表达反义反义RNARNA对编码对编码CAPCAP基因的调控作用已如前述。基因的调控作用已如前述。这里再介绍一下这里再介绍一下micFRNAmicFRNA对对ompFompF基因的表达的基因的表达的调
46、控。调控。ompFompF蛋白质是大肠杆菌的蛋白质是大肠杆菌的外膜蛋白外膜蛋白的主要的主要成分这一。成分这一。micFRNAmicFRNA是从另一基因是从另一基因(ompCompC基因基因)附附近的近的DNADNA序列转录而来，和序列转录而来，和ompFmRNAompFmRNA的的55端有端有70%70%的序列互补，因此在体外的序列互补，因此在体外micFRNAmicFRNA可以抑制可以抑制ompFmRNAompFmRNA的翻译。的翻译。但是这种抑制作用在体内是否重要尚有疑问，因但是这种抑制作用在体内是否重要尚有疑问，因为缺失为缺失micFmicF基因的菌株其基因的菌株其ompFompF蛋白的
47、表达只受到蛋白的表达只受到轻微的影响。轻微的影响。5.3.2噬菌体溶菌噬菌体溶菌/溶源状态的控制溶源状态的控制反义反义反义反义RNARNA也参与了也参与了 和和P22P22噬菌体的噬菌体的溶菌溶菌/溶源状态溶源状态的的控制。控制。P22P22噬菌体编码一种噬菌体编码一种抗阻遏蛋白抗阻遏蛋白AntAnt，它可以，它可以抑制许多抑制许多 样噬菌体的阻遏蛋白与样噬菌体的阻遏蛋白与DNADNA的结合的结合。这对。这对于刚刚感染细胞的于刚刚感染细胞的P22P22建立建立 样样原噬菌体原噬菌体原噬菌体原噬菌体(prophageprophage)是有益的。是有益的。但是但是AntAnt必须在严格的控制下，否
48、则必须在严格的控制下，否则AntAnt的过分表达的过分表达的过分表达的过分表达必将必将阻止溶源状态的建立阻止溶源状态的建立，而成为，而成为溶菌性溶菌性溶菌性溶菌性的噬菌体。的噬菌体。AntAnt蛋白质表达的控制是利用反义蛋白质表达的控制是利用反义RNA(RNA(sarRNAsarRNA)能能与与antmRNAantmRNA的翻译起源区互补结合，从而的翻译起源区互补结合，从而抑制抑制antantmRNAmRNA翻译成翻译成AntAnt蛋白蛋白。在在 噬菌体中噬菌体中cc蛋白蛋白蛋白蛋白控制着控制着溶菌或溶源状态的选择溶菌或溶源状态的选择。cc蛋白可以激活蛋白可以激活PrePre启动子启动子启动子
49、启动子，该启动子控制的基因，该启动子控制的基因是是 噬菌体噬菌体整合作用整合作用整合作用整合作用所必须的，且同时能所必须的，且同时能抑制抑制 噬菌噬菌体的体的复制复制复制复制。cc蛋白蛋白的另一功能是的另一功能是延缓延缓 晚期基因的表达晚期基因的表达，其作，其作用机制是用机制是cc蛋白蛋白激活激活PaQPaQ的启动子的启动子的启动子的启动子，转录出，转录出PaQRNAPaQRNA。PaQRAPaQRA是编码是编码Q Q蛋白的蛋白的mRNAmRNA的反义的反义RNARNA。因此，。因此，PaQRNAPaQRNA能与能与QmRNAQmRNA配对杂交而抑配对杂交而抑制其翻译，而制其翻译，而QQ蛋白蛋
50、白蛋白蛋白早已知道是早已知道是晚期基因表达的激晚期基因表达的激活蛋白活蛋白。cc基因本身的表达基因本身的表达基因本身的表达基因本身的表达还受到称为还受到称为oopRNAoopRNA的反义的反义RNARNA的调控。的调控。oopRNAoopRNA与与cc基因的基因的3 3端互补，但其具体作端互补，但其具体作用机制尚不清楚。用机制尚不清楚。IS10转位作用的抑制转位作用的抑制outRNA是一种反义RNA，可以和IS10编码的转位酶mRNA(INRNA)5端结合而抑制其翻译，当细胞内只有一个拷贝IS10时，只能生成很少量的outRNA，故转位酶仍可生成。但当IS10的拷贝数增多时，outRNA愈来愈