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1、2.2动物细胞工程一. 动物细胞培养（原理：细胞增殖）1.概念：是指从动物体中取出相关的组织，将他们分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下让这些细胞生长和增殖的技术。2.动物细胞培养的条件液体培养基1) 营养条件 需要有糖类.氨基酸.无机盐.维生素等合成培养基通常还需加入血清等一些天然成分2) 无菌无毒的环境a.对培养液和所有的培养用具进行灭菌处理，并在无菌环境下操作b.定期更换培养液，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害3) 适宜的温度.PH.渗透压：温度36.50.5，PH=7.2-7.495%空气+5%二氧化碳4) 气体环境：氧气和二氧化碳 氧气是细胞代谢的必需品二氧化碳
2、的主要作用是：维持培养液的PH3.动物细胞的培养过程动物胚胎或组织块 剪碎用胰蛋白酶分解或胶原蛋白处理 分散成单个细胞 加入细胞培养液 制成细胞悬液装瓶 一类细胞悬浮在培养液中生长增殖（问题：密度过大有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏而分裂受阻）另一类贴壁生长（大多数）接触抑制用胰蛋白酶处理分瓶培养10-50代增殖缓慢以至于完全停止 CO2培养箱用离心法收集2次用胰蛋白酶少部分细胞获得不死性（等同于癌细胞，核型发生改变）概念 原代培养：动物组织消化后的初次培养传代培养：分屏后继续培养4.干细胞培养及其应用（1）干细胞：具有分裂和分化能力的细胞称为干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。存在于早期
3、胚胎.骨髓和脐带血等多种组织和器官中胚胎干细胞（简称ES细胞）：存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。ES细胞可以在体外分化成心肌细胞.神经元和造血干细胞等细胞（局限性：涉及伦理）成体干细胞：是成体组织或器官内的干细胞，包括造血干细胞.神经干细胞.精原干细胞等成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织不具有发育成完整个体的能力应用：医学上 造血干细胞移植：治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后造血免疫功能的障碍神经干细胞：治疗神经组织损失和神经系统退行性疾病.如帕金森病阿尔茨海默症作用：与组织.器官的发育.再生和修
4、复等密切相关（2）诱导多能干细胞（简称ips细胞）:是通过体外诱导小鼠成纤维细胞获得类似胚胎干细胞的 一种细胞并用ips细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。优点：ips细胞来自病人自身的体细胞，移植后理论上可避免免疫排斥反应，所以ips细胞的应用前景优于胚胎干细胞缺点：存在肿瘤细胞发生的风险二.动物细胞融合技术与单克隆抗体1.动物细胞融合技术 过程：不同来源的动物细胞两个或多个细胞结合形成一个细胞的技术原理：细胞膜的流动性诱导融合的方法：PEG融合法.电融合法.灭活病毒诱导法意义：该技术突破了有性生殖的局限，使远缘杂交成为可能。注：灭活p48（了解）：指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染的能力，但
5、并不破坏他们的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是:病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚细胞膜上的糖蛋白分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。2.单克隆抗体及其应用（1）传统抗体的获得 方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，从动物血清中分离所需抗体缺点：产量低，纯度低，特异性差（2）单克隆抗体的制备1)试验方案：把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞。2)制备过程诱导融合 多种杂交细胞未融合的细胞具有同种核的细胞选择培养基筛选杂交瘤细胞给小鼠注射特定抗原获得 多种B淋巴细胞培养骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞单克
6、隆抗体96孔板培养和筛选 产生特定抗体的杂交瘤细胞 体外培养（克隆化培养和抗体检测） 注射到小鼠腹腔内 3)单克隆抗体的优点 a.能准确地识别抗原的细微差别 b.与特定抗原发生特异性结合 c.可以大量制备4)单克隆抗体的应用 a.作为诊断试剂：如定位肿瘤.心血管畸形等疾病b.运载药物（抗体-药物偶联物 ADC由抗体.接头和药物组成）c.治疗疾病三.动物体细胞核移植技术和克隆动物1.动物体细胞核移植的过程p53 （需动物细胞培养技术和胚胎移植技术的支持（原理）4）将供体细胞注入去核的卵母细胞1）采集卵母细胞在体外培养至M期 2）通过显微操作去核 （注：也可采用梯度离心.紫外线短时间照射和化学物质
7、处理等方法，在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或DNA变性）3）取供体细胞进行细胞培养5)通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞形成重构胚 6）用物理法或化学法（如电刺激.Ca2+载体.乙醇.蛋白酶合成抑制剂等）激活重构胚使其完成细胞分裂和发育进程 7）将胚胎移入受体（代孕）母牛体内8）生出与供体遗传物质基本相同的犊牛注意：a.减数分裂中期（M期）卵母细胞的“核”其实是纺锤体染色体复合物M期的次级卵母细胞此时透明带内包含着第一极体在去核的同时连同第一极体一并去掉b.供体一般选用传代10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常二倍体核型c.受体选择M期卵母细胞的原因：细胞大.易操作.卵黄多.营养丰富细胞质中含有促使细胞核全能性表达的物种和营养条件 d.克隆动物遗传物质的来源 核内遗传物质：全部来自供体细胞细胞质中的遗传物质：一部分来自核供体细胞，另一部分来自受体卵母细胞。2.简答1）动物细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植的原因？动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难。2）非人灵长类动物体细胞核移植非常困难的主要原因是？供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，导致胚胎发育率低，另一方面对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。32.2动物细胞工程学科网（北京）股份有限公司