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1、CD4TCD4T淋巴细胞检测标准及要求淋巴细胞检测标准及要求毛爱玲毛爱玲山西省性病艾滋病监测中心山西省性病艾滋病监测中心12021/7/19 星期一22021/7/19 星期一HIVHIV在人体内的复制在人体内的复制1.1.吸附及穿入：吸附及穿入：gp120+CCR5 GP41gp120+CCR5 GP41和膜融合和膜融合核衣壳核衣壳穿入宿主细胞穿入宿主细胞2.2.脱衣壳和逆转录：脱衣壳和逆转录：P24+P24+亲环素亲环素出壳出壳RNARNA依赖的依赖的DNADNA聚合酶聚合酶逆转录逆转录cDNAcDNA3.3.环化：环化：cDNA 双链环状双链环状DNADNA 4.4.整合：双股整合：双股
2、DNADNA整合入宿主细胞染色体整合入宿主细胞染色体DNADNA中中前病前病毒毒5.5.转录：前病毒转录：前病毒DNA RNA mRNA DNA RNA mRNA 6.6.翻译与装配：翻译与装配：GagGag蛋白与病毒的蛋白与病毒的RNARNA结合装配成核壳结合装配成核壳体。体。7.7.病毒成熟、出芽：芽生方式释放病毒成熟、出芽：芽生方式释放32021/7/19 星期一42021/7/19 星期一AIDS发病机理 HIV侵入人体后主要攻击的是一种带CD4抗原的淋巴细胞（T4淋巴细胞）。这种细胞是免疫系统的基本组成部分，HIV通过大量、不断地复制与释放，导致T4淋巴细胞进行性下降，感染者免疫功能
3、遭到严重破坏，造成免疫缺陷。临床表现为各种各样机会性感染与肿瘤。52021/7/19 星期一AIDS发病机理发病机理1.1.HIVHIV进入人体后能选择性地侵犯有进入人体后能选择性地侵犯有CD4CD4受体受体的淋巴细胞，当病毒颗粒释放出来后，继的淋巴细胞，当病毒颗粒释放出来后，继续攻击其他续攻击其他CD4TCD4T淋巴细胞。大量的淋巴细胞。大量的CD4+TCD4+T淋淋巴细胞被巴细胞被HIVHIV攻击后，首先引起细胞功能的攻击后，首先引起细胞功能的障碍。障碍。2.2.HIVHIV病毒在细胞内大量繁殖，导致细胞的溶病毒在细胞内大量繁殖，导致细胞的溶解和破裂。解和破裂。62021/7/19 星期一
4、AIDS发病机理发病机理3.HIV3.HIV在细胞内复制后，以芽生方式释出时可在细胞内复制后，以芽生方式释出时可引起细胞膜的损伤。由于引起细胞膜的损伤。由于HIVHIV可抑制细胞膜磷可抑制细胞膜磷脂的合成从而影响细胞膜的功能，导致细胞脂的合成从而影响细胞膜的功能，导致细胞病变。病变。4.HIV4.HIV还可以感染骨髓干细胞导致还可以感染骨髓干细胞导致CD4+TCD4+T淋巴细淋巴细胞减少。胞减少。72021/7/19 星期一AIDS发病机理发病机理5.5.当受当受HIVHIV感染的感染的CD4+TCD4+T淋巴细胞表面存在的淋巴细胞表面存在的gp120gp120发生表达后，它可以与未感染的发生
5、表达后，它可以与未感染的CD4+TCD4+T淋巴细胞淋巴细胞CD4CD4分子结合，形成融合细胞，从而改变细胞膜分子结合，形成融合细胞，从而改变细胞膜的通透性，引起细胞的溶解和破坏。的通透性，引起细胞的溶解和破坏。6.6.游离的游离的gp120gp120也可以与未感染的也可以与未感染的CD4+TCD4+T淋巴细胞淋巴细胞结合，作为抗体介导依赖性细胞毒作用的抗原，结合，作为抗体介导依赖性细胞毒作用的抗原，使使CD4+TCD4+T淋巴细胞成为靶细胞，受淋巴细胞成为靶细胞，受K K细胞攻击而损细胞攻击而损伤。伤。82021/7/19 星期一AIDS发病机理发病机理 HIV HIV感染后一般首先出现感染
6、后一般首先出现CD4TCD4T淋巴细胞轻度至淋巴细胞轻度至中度降低，该细胞总数可持续数年不变，反应中度降低，该细胞总数可持续数年不变，反应病毒为免疫应答所抑制。历经一段时间后，病毒为免疫应答所抑制。历经一段时间后，CD4+TCD4+T细胞逐渐进行性下降，表明病毒逐渐逃细胞逐渐进行性下降，表明病毒逐渐逃脱了免疫应答的控制。当脱了免疫应答的控制。当CD4+TCD4+T淋巴细胞一旦淋巴细胞一旦下降至下降至200200细胞细胞/l/l或更低时，则就可出现机或更低时，则就可出现机会性感染。会性感染。92021/7/19 星期一HIVHIV感染的三种结局感染的三种结局典型进展者：典型进展者：8-10年内免
7、疫功能逐渐下降，最后发展成为艾滋病。快速进展者：快速进展者：CD4+细胞计数在2-5年内迅速下降，抗HIV抗体水平很低，HIV感染后有较高的病毒载量。长期存活者（长期不进展者）长期存活者（长期不进展者）：感染后维持健康状态12年以上，且CD4+计数维持正常。102021/7/19 星期一 HIVinfectionJ.Coffin,XI International Conf.on AIDS,Vancouver,1996艾滋病的病程就象一列迫近艾滋病的病程就象一列迫近悬崖的火车悬崖的火车病毒载量病毒载量病毒载量病毒载量 =火车的速度火车的速度火车的速度火车的速度 CD4 CD4 计数计数计数计数
8、=离悬崖的距离离悬崖的距离离悬崖的距离离悬崖的距离112021/7/19 星期一122021/7/19 星期一从 HIV感染发展到艾滋病 HIV一旦进入人体，这个人就成为HIV感染者。经过急性感染期潜伏期，以后逐渐发展成艾滋病病人。处于潜伏期的感染者免疫功能没有受到严重破坏，因而没有明显的临床症状。从感染者到艾滋病病人这段潜伏期时间的长短与感染途径感染病毒的数量感染者的年龄、生活条件、心理、生理状况等多种因素有关，短则几年，长则20年。发达国家较长，发展中国家短些。资料表明，经输血传播的潜伏期较短，经性接触传播的潜伏期较长。132021/7/19 星期一检测检测CD4CD4、CD8TCD8T淋
9、巴细胞的意义淋巴细胞的意义淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一群细胞，在正常机体内各淋巴细胞亚群相互作用，维持机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致机体免疫功能紊乱并发生一系列病理变化。因此，T淋巴细胞亚群的免疫分型能够提供有关患者免疫状态的重要信息。AIDS是由HIV引起的一组综合症，HIV主要侵犯人CD4T淋巴细胞，导致其数量上的减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最终导致各种机会感染和肿瘤142021/7/19 星期一检测检测CD4CD4、CD8TCD8T淋巴细胞的意义淋巴细胞的意义(续续)CD4T淋巴细胞绝对值的检测在HIV感染和艾滋病病
10、人治疗以及病毒治疗疗效方面发挥了重要的作用1.了解机体的免役状态以确定疾病分期2.监测疾病进程3.评估疾病预后4.制定抗病毒治疗及机会性感染预防性治疗方案评估抗病毒药物疗效152021/7/19 星期一检测检测CD4CD4、CD8TCD8T淋巴细胞的意义淋巴细胞的意义(续续)因而，对HIV感染者和AIDS病人定期进行CD4、CD8T淋巴细胞检测具有十分重要的意义。美国疾病预防控制中心就是以此为基础制订了HIV感染者/AIDS病人的诊断和分类标准，目前国内外仍被采纳应用。162021/7/19 星期一规范的AIDS治疗 目目前前我我国国HIVHIV治治疗疗范范围围逐逐渐渐扩扩大大，国国家家示示范
11、范区区大大批批的的治治疗疗已已经经开开始始。我我省省也也于于20042004年年启启动动了了对对AIDSAIDS的的治治疗疗。但但是是由由于于检检测测费费用用昂昂贵贵，大大批批治治疗疗中中50%50%以以上上病病人人不不进进行行规规范范检检测测.一一旦旦出出现现耐耐药药病病人人，后后果果将将不不堪堪设设想想。所所以以规规范范的的实实验验室室检测是非常重要的一个环节。检测是非常重要的一个环节。172021/7/19 星期一实实 验验 室室 条条 件件 1.人员 进行HIV感染者和病人CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术
12、培训。182021/7/19 星期一实 验 室 条 件(续)设施和设备样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转震荡器、精确移液器（5ul50u1、20u1200u1、200u11000u1)。流式细胞仪检测区：流式细胞仪192021/7/19 星期一实 验 室 条 件(续)功能分区 实验室应分为样品处理区和流式细胞仪检测区，各区的功能是：样品处理区应达到生物安全级实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。202021/7/19 星期一方方 法法目前用于CD4和CD8T淋巴细胞计数的检测方法分为自动检测方法和手工操作法。自动检测方法包括流式细
13、胞仪（主要有多平台三级程序法和单平台一步法）和专门的细胞计数仪。手工操作法包括几种手工操纵试验，需要显微镜或酶联免疫试验设备。212021/7/19 星期一方方 法法检测CD4T淋巴细胞数的标准方法为流式细胞仪，可得出CD4,CD8等淋巴细胞及比值。为确保检测的准确性，应建立内部质量控制及参加国家室间评价。222021/7/19 星期一流式细胞仪流式细胞仪 (FACS Calibur,BD)232021/7/19 星期一简易流式细胞仪器（简易流式细胞仪器（FACSCount,BD)242021/7/19 星期一免疫指标的检测免疫指标的检测 CD4/CD3 CD8/CD3 CD3 CD4/CD8
14、252021/7/19 星期一全省CD4流氏细胞仪分布山西省艾滋病确证中心实验室运城市艾滋病确证实验室临汾市艾滋病确证实验室太原市艾滋病确证实验室大同市艾滋病确证实验室长治市艾滋病初筛中心实验室262021/7/19 星期一CD4CD4细胞样本采集细胞样本采集运送运送检测要求检测要求272021/7/19 星期一1.成成功功的的临临床床治治疗疗效效果果评评定定依依赖赖于于有有保保障障的的标标本本采采集集、保保存存、检检测测，以以及及数数据据处处理理等等等等。在在研研究究前前期期就就要要有有计计划划的的设设计计研研究究项项目目，确确定定所所需需要要的的标标本本类类型型。比比如如：所所有有的的血血
15、液液标标本本是是否否需需要要抗抗凝凝处处理理、是是否否需需要无菌等要无菌等 标标 本本 采采 集集 的的 要要 求求282021/7/19 星期一标本采集的要求标本采集的要求(续续)2.2.采采集集的的标标本本应应该该长长期期保保存存，至至少少要要求求保保存存至至此此项项目目完完成成。血血液液标标本本可可用用于于CD4TCD4T淋淋巴巴细细胞胞 、抗抗原原、抗抗体体检检测测，病病毒毒分分离离，PCRPCR检测检测.3.3.血血液液标标本本应应尽尽量量在在2424小小时时内内处处理理，尤尤其其是是CD4TCD4T淋淋巴巴细细胞胞检检测测、病病毒毒分分离离，PCRPCR检检测测.292021/7/
16、19 星期一标 本 的 采 集(续)选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。用于血液学检测的抗凝剂 K3EDTA（1.50.15mg/ml血液)。枸橼酸钠 (3)肝素 在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。用于流式细胞仪的抗凝剂主要是K3EDTA 302021/7/19 星期一标本的采集标本的采集312021/7/19 星期一 标标 本本 的的 采采 集集采集用品采集用品采血管采血管 真空、负压真空、负压 抗凝（抗凝（EDTAEDTA或枸橼酸钠）或枸橼酸钠）无菌无菌针头针头 蝶形针头蝶形针头322021/7/19 星期一采集
17、用品：采集用品：采集用品：采集用品：采血套管采血套管采血套管采血套管固定采血管位置，方便操作；保护操作者的安全固定采血管位置，方便操作；保护操作者的安全固定采血管位置，方便操作；保护操作者的安全固定采血管位置，方便操作；保护操作者的安全注意：切勿将采血针头的套管回套！注意：切勿将采血针头的套管回套！注意采血后器具的放置、消毒、处理注意采血后器具的放置、消毒、处理 标标 本本 的的 采采 集集(续续)332021/7/19 星期一标本的采集标本的采集(续续)采血后应立即握住试管两端，颠倒混匀多次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固。准备适当数量的样品管当同一样品的血球检测和流式细胞仪免疫表型检测在同
18、一实验室内进行时，用一个装有K3EDTA的试管即可。对所有样品编号，并写明日期和时间。342021/7/19 星期一 标标 本本 的的 运运 输输在在标标本本运运输输过过程程中中，应应确确保保标标本本能能够够及及时时、准准确确运运输输到到指指定定地地点点。要要求求提提前前与与对对方方联联系系，确确定定时时间间，对对方方应应提提前前做做好好相相关关实实验验的的准准备备工作，尽快进行标本处理工作，尽快进行标本处理运运输输的的所所有有标标本本都都应应有有送送检检单单给给接接受受样样品品的的实实验验室室。每每张张送送检检单单都都应应详详细细填填写写所所要要求求的内容的内容.352021/7/19 星期
19、一样 品 的 运 输 运 送(续)尽可能快地将样品送至免疫表型检测实验室。如需运送样品到其它地点时，应将装样品的试管放于一个防漏的容器中，并将此容器放于一个装有吸水性物质的指罐中，以防止震动并可吸收所有试管破裂漏出的血液。盖紧指罐，用橡皮带系紧。应选择特定的方案，并且安排合适的时间和运输样品。362021/7/19 星期一样样 品品 的的 接接 收收 样品到达以后立即检查试管及其所装的血样。不可检测溶血或结冰样品。不可检测凝血和乳糜的样品。如果样品的采集时间已超过48H，不于接收.372021/7/19 星期一 标标 本本 的的 处处 理理一般采集一般采集HIV-1HIV-1感染者全血感染者全
20、血10-20ml10-20ml 血浆（含有血小板）血浆（含有血小板）淋巴细胞层淋巴细胞层红细胞层红细胞层1 抗抗 凝凝 2 无无 菌菌3 室室 温温4 24h内处理内处理382021/7/19 星期一实现实现 CD4,CD8,CD3 绝对计数绝对计数FACSCount结果可信度：结果可信度：绝对计数绝对计数质控质控内置错误自动报警内置错误自动报警392021/7/19 星期一FACSCount内置微处理器实现数据自动分析自动打印质控与病人的检测结果简单易用的系统控制面板配套的样本制备工作台样本制备方法简捷，避免细胞损失402021/7/19 星期一FACSCount 试剂与对照试剂与对照FAC
21、SCount 工作台工作台FACSCount 完善的系统完善的系统412021/7/19 星期一每管加入 50ml 全血加入，混匀，室温避光孵育1h无需溶血1每管加入 50ml 固定液，混 匀，室 温 避 光 孵 育30min无需离心洗涤2FACSCount上机检测.无需血球计数仪，直接得到绝对值结果33步测定步测定CD4,CD8，CD3 绝对计数绝对计数422021/7/19 星期一预配试剂预配试剂FACSCount 完善的系统完善的系统432021/7/19 星期一FACSCount 完善的系统完善的系统检测试剂盒组成（50人份/盒）荧光试剂2个组合/人份CD4PE/CD3PE-CY5CD
22、8PE/CD3PE-CY5固定液效期 28 0C储存6个月442021/7/19 星期一FACSCount 完善的系统完善的系统质控试剂盒（50人份/盒）零，低，中，高 4种靶值微球效期 28 0C储存1个月452021/7/19 星期一FACSCount3步测定步测定CD4,CD8，CD3 绝对计数绝对计数462021/7/19 星期一每管加入 50ml 全血加入，混匀，室温避光孵育1h无需溶血1FACSCount472021/7/19 星期一FACSCount每管加入 50ml 固定液，混匀，室温避光孵育30min无需离心洗涤2482021/7/19 星期一FACSCount上机检测.无需
23、血球计数仪，直接得到绝对值结果3FACSCount492021/7/19 星期一打印结果打印结果 对照对照 病人标本病人标本FACSCount 分析分析502021/7/19 星期一实验资料的记录实验资料的记录实验应及时、准确地记录结果。实验记录中应包括以下内容：日期、操作者、所有样品、实验内容、过程（步骤）、结果及有无事故等。整个实验室的实验资料要统一有专人负责，按固定格式记录在案。计算机生成的实验结果，存档备案：定期拷贝计算机结果文档，备案保存。512021/7/19 星期一HIV/AIDS CD4HIV/AIDS CD4检测时间检测时间一经抗-HIV确证的HIV/AIDS，应立即进行CD
24、4细胞检测。（基线）CD4细胞数200个/UL,每半年进行CD4细胞计数检测。CD4细胞数200个/UL，立即进入治疗。进入治疗的AIDS,严格按照3月、6月、12月、18月、24月时间来进行采血检测。522021/7/19 星期一CD4细胞检测报告时间经CD4流式细胞仪细胞检测后，一周内将结果反馈送检单位532021/7/19 星期一CD4细胞检测注意事项注意事项3.运送样本要求，春、秋季室温（18C23C），夏季冷藏，冬季保温。4.样本量应按负压管的要求采集。5.溶血、乳糜和凝血的样本不于接收。6.送检表和样本不得放在同一容器内。542021/7/19 星期一谢谢各位谢谢各位552021/7/19 星期一