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1、疾病模型第1节 概述在动物身上复制人类疾病是促进医学科学发展的重要途径之一，无论在疾病的发生发展机制的探讨上或预防与治疗上，都起着不容忽视的作用药理学上：复制疾病模型属于实验治疗学范畴病理学或病生理学：复制疾病模型属于实验病理学范畴Lehman AJ说：药理学家的工作是具有独特性的，这就象多数科学家一样，他们不愿完全重复别人的技术，而是在应用过程中进行各种改造。然而在评价新药的安全性时，必须遵循基本的原理和技术 借用相关学科方法 早期：动物实验、临床观察和机遇此后：生物化学方法，如酶、受体及其亚型近来：分子生物学技术、培养哺乳动物细胞，受体和离子通道，避免了明显的种属差异，但增加了生理学和病理
2、学相关联的问题现在：基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢物组学、药物基因组学等思想和方法，基因芯片、蛋白质芯片技术、组合化学原理用于药物的高通量筛选 面临的挑战仍然是体外数据和整体作用的相互关联，海量数据的分析、挖掘和利用体外实验简单，体内实验确实培养组织中发现的作用经常不能代表对整体器官的作用用适当的模型发现治疗人类疾病的药物药理学模型必须具有关联性，即这些模型要能够表现出所欲得到的治疗指征如从某个药理学模型中证明的药物作用与人类疾病治疗结果相吻合，则这个药理学模型可认为是有关联性的或相关的H.Gerhard Vogel和Wolfgang H.Vogel提出模型必须符合某些基本要求：模型必须
3、对标准化合物有敏感的计量依赖性特征，标准化合物是具有治疗作用的物质已知作用的化合物在模型中表现的相关效能应该与其临床应用的相关效能相比较模型应该有选择性，即已知物质在该模型中的治疗指征要与药物对其他指征的作用有明显的区别。新化合物的阳性数据可反映对病人的治疗作用如果新的方法所适用的指征尚没有已知的药物作对照，就必须要有充足的证据证明该模型与所观察的适应症及病理状态有相关性只有整体动物才能够反映出人类疾病和生理反应的复杂性。但即使是以志愿人员进行实验，仍然是一种模型，是一种研究对病人治疗作用的高度相关性的模型各种实验方法的相关程度依下列顺序增加：游离分子模型(如受体和酶)、细胞器、器官、整体清醒
4、动物、自愿人员动物实验在新药发现和药物作用评价中是必须的，也只有在必须时和认真设计以后才能进行实验动物科学 实验病理学 比较病理学饲养条件(屏障设施、隔离器、超净层流架)(等级动物室)等级动物(无菌动物，germ free,GF；已知菌动物，gnotobiote,GB；无特定病原体动物,specific pathogen free,SPF；清洁动物,minimal disease animal,MD；普通动物,conventional,CV)育种：严格按照遗传学原理来设计育种方案，培育出近交系、远交系、同源系、杂交子1代、重组近交系、突变系等实验动物研究(营养、生态、疾病)，遗传监测、微生物监
5、测 1961年，NIH支持召开了比较病理学会议，(医学、兽医学和生物学专家)，强调加强实验动物病理模型的研究此后30年，美国实验生物学会联合会(FASEB)、美国国家研究委员会(NRC)、国际实验动物科学学会(ICLAS)等机构相继召开了以实验动物病理模型为专题的会议，出版论文集，设立研究基金1982年，美国Hegreberg 和Leathers发表了一部两卷的动物模型目录，第1卷自发的动物疾病模型1289篇文献，第2卷诱发的动物模型2707篇文献人类疾病的动物模型收载82个疾病模型复制方法药理实验方法学 一些动物模型病理生理学进展(四)介绍了一些自发性疾病模型药理学实验指南新药发现和药理学评
6、价(Vogel HG,Vogel WH)载近400种体内模型，部分为疾病模型第2节 动物模型的分类和产生、保种方法实验动物的病理模型按其产生原因，可分为诱发的和自发的两大类诱发的模型是指研究者通过使用物理的、化学的和生物的致病因素人工地诱发动物发生特定的疾病自发的模型指不加任何人工的手段而动物自然发生的疾病，如中国仓鼠自发的糖尿病、山羊的家族性甲状腺肿和小鼠自发性肿瘤诱发的动物病理模型优点：能根据研究者的需要在短时间内复制出大量疾病模型，为近代研究所常用，特别是药物筛选多用诱发的动物模型不足：诱发的病理模型和自然产生的疾病毕竟在某些方面有所不同(如诱发的肿瘤和自发的肿瘤对药物的敏感性有差别，动
7、物酒精性肝纤维化不如人类酒精性肝纤维化程度重)，有些人类的疾病至今尚不能用人工的方法在动物身上诱发近来十分重视对自发的动物病理模型的研究自发的动物病理模型优点：自然条件下产生的疾病，有较大的理论和实际意义不足：往往是散发的，不易被人们检出并加以利用；甚至被人们当作不健康的动物而丢弃各国都重视实验动物模型的开发后，才注意保存和利用Jezyk的实验室曾对6000只狗和猫进行检查，以期发现先天性代谢缺陷病模型发现动物自发的遗传病后，如欲把病理模型保存下来，并培育成具有一定遗传特征的突变系，必须以近代遗传学知识为基础，制定出一套育种的方法人为地引起某种基因缺失，如knock-out小鼠、大鼠；或人工导
8、入某种基因，诱发某种疾病状态，用于药物作用的确证和作用机理研究第3节 自发的动物病理模型(一)心血管系统1.动脉粥样硬化 以高脂高胆固醇饮食诱发家兔动脉粥样硬化：仅在血脂极度增高的情况下才产生动脉粥样硬化；局部病理变化与人不同(人动脉内膜损伤和中层增生；人的动脉病变在大动脉的远侧端)；兔是草食动物。猪、狗、大鼠、鸡、鸽、猴等都能产生自发或诱发的动脉粥样硬化：小型猪发生的AS与人类很相似；某些老龄猪饲以残羹剩饭后，能产生大动脉、冠状动脉和脑血管的粥样硬化病变。鸽AS与人很相似，甚至冠状动脉狭窄和心肌梗死非人灵长类的动物模型有很大的优越性：分类学地位、杂食特性、解剖结构、代谢特点、局部组织病理、临
9、床特征均与人类近似。如猕猴的食饵性粥样硬化，病变广泛(大动脉、冠脉、脑、肾动脉)，甚至肾性高血压，病变和年龄的关系十分明显(主动脉病损范围幼猴为0.25%,老龄猴7.5%)。猴自发性AS随增龄而发病率增加。食蟹猴是研究冠状动脉梗塞和心肌梗塞的良好模型动物。黑猴可用于研究粥样硬化和糖尿病之间的关系。松鼠猴常用于研究与遗传有关的发病因素。非人灵长类是研究人类动脉粥样硬化最好的动物模型2.高血压 大鼠、小鼠、兔、狗、猴均可发生自发性高血压。已培育成突变系的高血压大鼠：日本的SHR大鼠、美国的Dahl大鼠、法国的Lyon大鼠和意大利的Milan大鼠，以SHR大鼠应用最广。SHR系，在出生后几个月内几乎
10、100%发生自发性高血压，可达200mmHg以上，与人类原发性高血压相似，并可发生脑血栓形成、梗死、出血、肾硬化、心肌梗塞和纤维化。以SHR为基础的2个亚系：易发生脑卒中的亚系(stroke-prone SHR,SHRSP)，迅速发生严重高血压，90%以上出现脑出血和脑栓塞；抗脑卒中的自发性高血压大鼠(stroke-resistant SHR,SHRSR)，不易发生脑卒中；自发性血栓形成大鼠和心肌缺血大鼠高血压模型高血压模型（SHR大鼠）大鼠）肥胖模型肥胖模型（Zucker大鼠）大鼠）糖尿病模型糖尿病模型GK大鼠大鼠肥胖并糖尿病肥胖并糖尿病模型模型（db/db小鼠）小鼠）3.心肌病 可见于猫、
11、狗、仓鼠、火鸡多见于成年的猫和狗(突然起病，呼吸困难、收缩期杂音伴奔马律、心脏扩大、肺水肿、EKG异常、左室舒张期末压力高)半数病猫发生主动脉血栓栓塞金黄仓鼠的心肌病呈常染色体隐性遗传，为一种自发的肌肉病变和心肌衰竭模型(病变早期见心肌组织溶解，晚期有单核细胞浸润和心肌内纤维组织增生，最后死于心力衰竭)，寿命仅正常者1/3火鸡中发现的心肌病损与猫和人的缩窄性心肌病相似(左心室肥大、扩张、心内膜纤维化，类似C型病毒的颗粒)(二)呼吸系统1.慢性支气管炎和肺气肿 马、兔、大鼠、小鼠均可自发性肺气肿。花斑鼠可自发性进行性全小叶肺气肿，有遗传性弹力蛋白合成缺陷而导致弹力组织网发育的缺陷，此将肺气肿的病
12、因与某些遗传性缺陷联系起来大鼠、小鼠定时吸入SO2引起慢支。SO2、烟雾、甲醛蒸气、辣性气体可诱发猴、兔、大鼠、小鼠慢支。烟草燃烧和SO2混合熏蒸4个月引起猕猴慢支2.过敏性肺炎 农民肺(farmers lung)，由于吸入长有霉菌的干草灰尘而急性发作过敏性抗原物质(霉菌孢子、干燥霉菌、昆虫碎片、鸟粪颗粒)牛、马、猴，血清中有抗体，肺泡间隔有广泛的淋巴细胞、浆细胞、间质细胞浸润 常用家兔造模(因易于产生和检出沉淀素)(三)消化系统猪和非洲啮齿类自发性胃溃疡豚鼠的诱发性结肠溃疡花斑小鼠自发性巨结肠仓鼠的肝淀粉样变性羊和大鼠的先天性高胆红素血症South Down变种羊，先天性肝摄取有机阴离子(如
13、胆红素)缺陷，血中未结合胆红素增高，与人类Gilbert综合征相似Gilbert syndrome:因肝细胞摄取非结合胆红素障碍及微粒体内葡萄糖醛酸转移酶不足所致。Gilbert综合征是最常见的家族性成人遗传性非溶血性黄疸。患者除有黄疸外,多无其他症状,或仅有乏力、消化不良、肝区不适等。感染、手术、酗酒、妊娠等可诱发或加重黄疸。血清非结合胆红素增高,红细胞脆性正常,肝功能检查正常。一般无需特殊治疗,预后良好Corriedale羊的遗传性缺陷，为有机阴离子从肝细胞内排入胆汁的障碍，与人类Dubin-Johnson综合征类似。适用于研究人类遗传性肝病及肝内胆红素的形成、转变和排泄 Gunn大鼠(是
14、Wistar大鼠的突变系)，存在慢性非溶血性未结合胆红素血症，葡萄糖醛酸酶活性缺陷以致胆红素醛酸盐形成障碍，与人类Crigler-Narjjar综合征相似。是研究胆红素代谢、肠内醛酸盐的形成及核黄疸的极好模型Dubin-Johnson综合征是慢性良性间歇性黄疸。由肝细胞的先天性缺陷,使结合胆红素不能在肝内运转,也不能被排出细胞外,致血清结合胆红素增高、尿中胆红素阳性。还存在分泌非水溶性有机阴离子(如BSP、碘造影剂、雌激素)障碍,此为Dubin-Johnson综合征所特有的表现。口服胆囊造影剂时,75%患者胆囊不显影,显影者也甚暗淡;静脉法造影时有半数不显影。此病多在青少年时期被发现,有明显的
15、家族背景。患者多无自觉症状,或偶有乏力、肝区不适。约半数病人肝脏轻度肿大,如行肝活组织检查可发现肝细胞内有弥漫性棕色色素颗粒。本病无需任何治疗,预后良好,并不演变为慢性肝病(四)泌尿系统注射异种抗肾血清、大量异种血清、细菌抗原与肾组织复合抗原，抗原抗体复合物，可诱发兔、羊的肾小球肾炎屠宰场的羊患增生性肾炎的比例高，牛和山羊亦见类似损害。芬兰的Landrace羊羔中可见一种进展迅速并致死的肾小球肾炎伴肾小球免疫复合物沉积，与人类的系膜-毛细血管性肾炎(mesangial-capillary nephritis)相似。灵长类中，濑猴患膜性肾炎，食蟹猴和枭猴可出现自发性肾小球肾炎的变化(肾活检)，狗
16、和猫可见自发性免疫性肾炎(五)内分泌与代谢1.糖尿病 在小鼠、大鼠、中国仓鼠、沙漠鼠、猫、狗、猴均可见，包括自发的和诱发的模型Wistar大鼠的自发性糖尿病模型(bb)与人的少年型糖尿病最为相似(中度或显著的糖尿、酮尿、多尿、体重减轻、血糖升高达800 mg%、高酮血症、低胰岛素血症01 ng/mL、胰高血糖素过多、无肥胖症、胰岛细胞破坏显著)，对胰岛素治疗反应良好，寿命较非糖尿病鼠短BB大鼠是和自身免疫性毁坏胰腺细胞的胰岛炎以及胰岛素缺乏有关的自发性糖尿病模型(60120周龄时突然发病；数天后出现严重高血糖、低胰岛素和酮血症，除非开始胰岛素治疗)，用胰岛素治疗，用免疫抑制剂预防，对病鼠可移植
17、纯化胰岛细胞B!oBreedin(BB)大鼠是一种白发性、遗传性糖尿病动物模型，l974年在加拿大渥太华的BioBreedin实验室首次发现，并以该中心的字母缩写来命名近交系Wistar老龄雄大鼠、WBN/Kob大鼠，有自发性高血糖、糖尿和葡萄糖耐量降低(雄大鼠12周龄时胰岛大小与数目减少，12周龄时围绕退化的胰岛和胰管周围胰腺组织中出现纤维性渗出与变性，21周龄时出现葡萄糖耐量降低和糖尿)Cohen糖尿病大鼠表现为高血糖、糖尿、高胰岛素血症，然后发展为低胰岛素血症、胰岛素抵抗和胰岛素受体数目和敏感性降低，喂以富含蔗糖或精制糖又缺乏铜元素的饲料的大鼠形成明显的糖尿病及其并发症，但喂淀粉或粗料时
18、则不发病Zucker肥胖大鼠是典型的高胰岛素血症肥胖模型。肥胖是由于单常染色体隐性基因，在幼时发病，表现为轻度葡萄糖耐量降低、高胰岛素血症和外周胰岛素抵抗，类似人的非胰岛素依赖性糖尿病，但其血糖水平终身是正常的幻灯片 18WDF/Ta-fa大鼠通常指Wistar肥胖大鼠，是从Zuker大鼠脂肪基因转至Wistar Kyoto大鼠而得到的遗传性肥胖高血糖大鼠，表现为肥胖、高胰岛素血症、葡萄糖耐量降低、高脂血症和多食症均类似Zuker大鼠，但存在更差的葡萄糖耐量和更大的胰岛素抵抗 通常雌鼠不出现高血糖，但饲料中添加蔗糖则可诱发。用吡格列酮激活Wistar肥胖大鼠胰岛素受体激酶可增强胰岛素的敏感性e
19、SS大鼠是Tarres等1981年发现的一个大鼠种群中发生自发性糖尿病大鼠。2月龄以上的eSS大鼠葡萄糖耐量试验异常，但属轻型糖尿病，并不减少寿命；6月龄大鼠出现胰岛结构破坏和基质纤维化SHR肥胖大鼠是由Koletsky(1973,1975)将Kyoto-Wistar自发性高血压雌大鼠和正常血压的Spraque-Dawley大鼠交配育成，经数代选择性繁殖，出现高血压、高脂血症，一部分大鼠发生胰岛极度肥大、高血糖、糖尿SHR/N-cp大鼠：先天性糖尿病SHR/N-cp大鼠是由具肥胖基因(cp/+)杂合子雄大鼠和Okamato雌大鼠交配育成。至少12次逆代杂交后，纯合子(cp/cp)SHR/N-c
20、p大鼠出现肥胖、轻度高血压、高胰岛素血症和葡萄糖耐量降低BHE大鼠种群由宾夕法尼亚州立大学品系的黑白头巾鼠和耶鲁品系的白大鼠交配而来。只有在成熟期才发生糖尿病。50日龄时有高胰岛素血症、葡萄糖耐量降低、胰岛素抵抗，而后高胰岛素血症减轻，胰腺中胰岛素贮量减少，出现轻度高血糖和高脂血症 自发性糖尿病小鼠：KK小鼠，KK-Ay小鼠，NOD小鼠，Wellesley小鼠。NZO小鼠，高血糖肥胖小鼠，糖尿病小鼠(db/db)(从C57BL/KsJ品系小鼠自发的常染色体隐性突变衍化而来，严重的糖尿病症状包括早发的高胰岛素血症、体重下降、早死，以及明显的肾病)中国仓鼠的遗传性糖尿病：血糖从正常的110mg%升
21、至600mg%，严重的多尿、糖尿、酮尿和蛋白尿。胰岛素和口服降糖药有效。胰腺、肝、肾组织可见病理改变，胰岛数目减少，剩余胰岛细胞异常 沙漠鼠：北非和近东沙漠地带，经23月的饲养而发病，糖尿病的严重程度不同，重者死于酮血症。疾病中期胰岛细胞脱颗粒，继之细胞变性、坏死，产生胰岛素缺乏和酮尿猫自发性糖尿病，多发于89岁，主要病理变化是胰岛淀粉样变性，相当于人的成年型糖尿病非人灵长类黑猩猩糖尿病的发病率随年龄而增长，胰岛呈淀粉样变性，类似成人型糖尿病。严重的猿猴糖尿病可伴发动脉粥样硬化和白内障 2.尿崩症 神经原性(下丘脑-垂体功能障碍，抗利尿激素分泌不足)尿崩症，呈常染色体半隐性遗传，Brattle
22、boro大鼠患此病，患鼠每天饮水量10倍于正常鼠，纯合子鼠尿量为体重的70%(正常鼠为3%)，注射抗利尿激素可纠正肾原性尿崩症(不能建立正常的肾皮质乳头渗透压梯度和对抗利尿激素的反应性降低)可见于小鼠，因尿液浓缩和水分排泄的遗传性缺陷而呈不同程度的多尿症状 3.其它内分泌障碍 狗和兔肾上腺皮质功能亢进症，狗和小鼠垂体性侏儒，羊、山羊和牛的家族性甲状腺肿，小鼠和大鼠的睾丸雌性化(雄性假两性畸形)山羊的家族性先天性甲状腺肿是一种常染色体隐性遗传病(呆滞、皮毛粗糙、毛稀少而皮肤厚，甲状腺功能低下，甲状腺球蛋白含量减少，甲状腺腺泡缩小，腺上皮细胞变高，腺泡内无胶性蛋白液)，甲状腺球蛋白的合成障碍睾丸雌
23、性化的模型TFM大鼠和TFM/Y小鼠是2株研究雄激素及其受体的有用的突变系，呈X连锁隐性遗传，为染色质内受体部位缺陷引起的受体病(六)免疫系统1.原发性免疫缺陷病(1)B淋巴细胞缺乏：马的无球蛋白血症、鸡的异常球蛋白血症、免疫缺陷CBA/N小鼠及遗传性无脾小鼠。其中马的无球蛋白血症(雄性，用各种抗原免疫均无特异性抗体产生，淋巴结内没有原发滤泡及生发中心，也无浆细胞产生)，是与人的Bruton氏症相应的动物模型(2)T淋巴细胞缺乏：裸小鼠、免疫缺陷无毛豚鼠、丹麦黑牛变种裸小鼠(nu/nu)：Flanagan于1966年首先发现并报道的无毛突变小鼠胸腺不发育和免疫功能缺损，为常染色体隐性遗传缺陷，
24、第3对鳃弓和鳃囊发育缺陷，纯合子胸腺发育不良，皮肤无毛裸小鼠缺乏TH淋巴细胞，对胸腺依赖抗原不产生抗体，不产生细胞毒T细胞，对促细胞分裂剂几无反应，对同种移植物和异种移植物无排斥反应，无宿主抗移植物反应，广泛用于人类肿瘤组织的移植试验裸小鼠T细胞缺乏与胸腺发育不良或缺乏有关 裸大鼠(rnu/rnu)：1953年在英国Rowett Research Institute发现有触须，皮肤有稀疏的毛，胸腺发育不良但有一定数量的T细胞免疫功能严重缺损，脾淋巴细胞对促有丝分裂剂及胸腺依赖抗原不起反应，淋巴结细胞对PHA和ConA起反应同种皮肤移植可被接受，而异种皮肤移植可能被接受或排斥，对异种肿瘤移植一般
25、可被接受体型较大，可接受裸小鼠难以接受的手术，对不适宜的环境的耐受力较小鼠强无毛免疫缺陷豚鼠：体形小，皮皱、毛干、触须短，胸腺发育不良或缺如，对移植排斥反应推迟，低球蛋白血症，对病毒感受性增加丹麦黑牛的突变型 为常染色体隐性遗传。病牛的胸腺、淋巴结和脾的T细胞缺乏，细胞免疫显著抑制，而免疫球蛋白水平及免疫后抗体滴度正常。患牛口服ZnO或ZnSO4后可完全恢复(皮损痊愈，淋巴组织发育正常，对DNCB(二硝基氯苯)和结核菌素的反应也恢复)，如停止摄Zn2+，则13周后复发，故此种免疫缺陷病与体内Zn2+缺乏(肠吸收Zn2+的先天性缺陷)有关。此模型与人的肠胃型肢皮炎相似，也可用于研究Zn2+在细胞
26、免疫和胸腺功能中的作用(3)T、B淋巴细胞缺乏(联合免疫缺陷)：见于阿拉伯马驹、N:NIH(S)11-nu/nu小鼠及Motheaten小鼠在美国出生的阿拉伯马驹约有2%患联合免疫缺陷病，出生时正常，野外条件下5月龄便死亡，严重的呼吸道(马腺病毒和肺囊肿病毒)感染症状，重度淋巴细胞(包括B细胞)缺乏，不能合成免疫球蛋白，T细胞显著减少乃至测不到，皮肤延迟过敏反应和对PHA的反应减弱或缺如，对同种异体淋巴细胞无反应，用于研究小儿联合免疫缺陷病及其实验性治疗，研究免疫缺陷与代谢缺陷的关系 2.自身免疫病 新西兰小鼠(NZBNZW)F1杂交系中，有一种严重的进行性的病变过程，常引起肾功能衰竭、死亡，
27、有免疫复合物沉积于肾小球基底膜，检测到抗组织细胞和抗核抗体，此模型与人的系统性红斑狼疮相似，可用于研究红斑狼疮的环境和遗传因素狗可见类似的模型，出现类似慢性肾炎的肾损害狗和鼠的自家免疫性溶血性贫血狗和马的特发性血小板紫癜狗的类风湿性关节炎鸡和大鼠的自家免疫性甲状腺炎狗的重症肌无力症和寻常性天疱疮(七)肿瘤化学致瘤，病毒诱发，移植性肿瘤(八)传染病九带犰狳体温低(32-35)，对低氧负荷耐受性好，麻风杆菌接种于其皮下和足趾间(九)遗传病遗传病模型突变系先天性代谢缺陷动物，如各种先天性溶酶体贮积病(糖原贮积症、神经磷脂增多症、高雪氏病、尼曼匹克氏病、粘多糖贮积病)第4节 诱发的动物病理模型一、分类
28、1.动物模型、细胞模型 体内模型、体外模型2.器官、组织、细胞、分子、基因、功能基因、mRNA、蛋白质、非蛋白质分子、基因敲除、基因导入二、动物模型的特点、标准与人类疾病相似而不相同用作研究人类疾病的动物模型的有效性是选择动物模型最重要的标准可行性、稳定性、标准性、相似程度三、如何模拟1.全模拟 用NIN小鼠腹腔接种细粒棘球蚴和多房棘球蚴原头节制成包虫病动物模型,以包虫囊的湿囊重和囊重抑制率进行药效学评价小鼠或家兔血吸虫病肝纤维化模型2.病因上 体质量20-25kg的1年期雄性健康小香猪16只,以标准大肠杆菌由右侧颈内静脉缓慢注入,分别于注入大肠杆菌前及注入后1、3、5、7h检测血清内毒素、血
29、常规、血气分析、血生化,同时记录动脉压及平均动脉压(MAP)、心率(HR)、体温及呼吸频率。结果:注入大肠杆菌3h后,动物100%出现内毒素血症,5h后全部出现MODS,制模成功多因素随机性慢性刺激引起慢性应激/抑郁症移植性肿瘤模型我国已建立小鼠可移植肿瘤株10余种1969年Rygarrd首次用人的结肠癌移植于裸小鼠获得成功；直肠癌、黑色素瘤、鼻咽癌、骨肉瘤、胰腺癌、胃癌、结肠癌等百余种；我国建成的人类肿瘤的裸鼠移植瘤数十种病毒诱发的肿瘤模型目前几乎所有禽类的肿瘤和小鼠的肿瘤以及部分其他动物的肿瘤均可用肿瘤的无细胞滤液诱发，电镜下可见滤液中有病毒颗粒，应用无细胞滤液或病毒的培养物可将动物的肿瘤
30、传递下去，并可诱发其他种类动物新的肿瘤模型，如Rous鸡肉瘤病毒动物肿瘤病毒：RNA病毒和DNA病毒，仅小鼠白血病病毒就多于14种化学致瘤物诱发的动物肿瘤模型 多环碳氢化合物、氨基偶氮染料、芳香胺、亚硝胺黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等重金属农药3.病理过程上 80只Wistar大鼠,雌雄各半。分别采用复合因素法、四氯化碳(CCl4)加乙醇法及玉米面、胆固醇加乙醇法建立大鼠肝硬化的模型(假小叶形成为判定CM成功的唯一标准)。复合因素法:40只大鼠,饲料为80%的玉米面、20%动物油 、0.5%胆固醇,饮料仅为15%酒精,首次sc注射40%CCl4-橄榄油溶液5mLkg-1(以下浓度相同),以
31、后每3d皮下注射CCl4 3mLkg-1。第6周末随机处死6只大鼠做肝脏病理,均符合肝硬化诊断标准。将余下存活的26只(逃逸2只、死亡6只)随机分为两组,每组13只均正常饲养,其一组每7d sc注射3mLkg-1CCl4,观察第7、8周末的病理变化。CCl4加乙醇法:20只大鼠,以正常饲料喂养,余条件同复合因素法前6周。玉米面、胆固醇加乙醇法:20只大鼠,不用CCl4,余条件同复合因素法前6周。结果:复合因素法6周末处死6只大鼠均形成CM,成模后正常饲养,2周后假小叶均消失,而继续应用CCl4 2周后，大鼠假小叶基本存在。其余2种方法 大鼠均未见典型肝硬化改变4.临床表现上5.处理方法上：病原
32、生物、异种蛋白、药物、手术等血吸虫尾蚴经皮肤感染引起小鼠或大耳白兔肝纤维化BSA、HAS、ConA分别引起大鼠、小鼠肝纤维化，ConA也引起急性肝损害CCl4、DMN引起大鼠肝纤维化、DMN和黄曲霉毒素等诱发肝癌、酒精引起慢性肝损害、D-氨基半乳糖和CCl4引起急性肝损害胆管结扎引起黄疸及肝纤维化四、如何选择动物1.首先应考虑实验的目的和要求2.动物是否容易获得、经济、容易饲养和管理3.注意实验动物的种类(species)、品种(breed)或品系(strain)、健康状态4.选择与人类的机能、代谢、结构以及疾病特点相近似的动物猴、狒狒、猩猩、长臂猿等灵长类动物是最近似于人类的理想动物猕猴、红
33、面猴和熊猴是研究脊髓灰白质炎、脑炎、痢疾、肝炎、麻疹等疾病的理想实验动物，也是放射医学、口腔医学、病毒学、妇产科学、胚胎学、外科学、病理学、生理学、免疫学等实验研究及药物毒理、营养、行为研究的良好动物 猕猴对人的痢疾杆菌和结核杆菌最易感染，是肠道杆菌病和结核病的很好动物模型猕猴的生殖生理与人非常接近，月经周期和人一样为28天左右，是研究人类避孕药的理想动物猕猴是制造和检定脊髓灰白质炎疫苗的唯一实验动物原猴类动物树鼩的信贷代谢过程较狗、鼠类更与人相似，大体解剖和生理功能方面也与其他灵长类相似；在乙型肝炎和睡眠生理研究有重要用途；还能自然感染和实验感染单纯疱疹病毒；适用于人疱疹病毒的研究狗具有发达
34、的血液循环和神经系统以及与人基本相似的消化过程，在药理方面的研究和人比较接近，适用于外科、营养、药理、毒理、生理、行为等研究猪的皮肤结构与人相似，上皮修复性再生、皮下脂肪层及烧伤后内分泌与代谢等也相似，选用小猪皮敷盖人烧伤后的创面，减少患者疼痛、感染，无排斥反应、血管联合好，愈合速度较快蛙适用于简单的反射弧实验5.选用遗传背景明确；具有已知菌丛或无菌动物纯系动物存在遗传的规律性、反应的一致性、实验结果精确可靠使动物实验的结果有规律性清洁级是最基本的要求；SPF级优先6.选用解剖、生理特点符合实验目的要求的实验动物狗的甲状旁腺位于甲状腺的表面，位置比较固定；家兔的甲状旁腺分布比较散，位置不固定，
35、除甲状腺周围外，甚至到主动脉弓附近，故作甲状旁腺摘除实验应选择狗；作甲状腺摘除实验如要保留甲状旁腺的功能，则应选用兔猴的气管腺的数量较多，直至三级支气管中部仍有腺体存在，用于慢性支气管炎的模型或祛痰平喘药的疗效实验较合适家兔颈部的交感神经、迷走神经和主动脉减压神经是分别存在、独立走行的，如要观察减压神经对心脏等的作用，就必须用家兔地鼠颈部颊囊是缺少组织相容性抗原的免疫特殊区，适用于作免疫学、组织培养、肿瘤学和微循环功能等的实验研究乌贼骨有一条巨大的神经，足以允许把一个微电计插入其内，适用于做神经纤维的膜电位和动作电位的实验 7.选用具有某些特殊反应的动物家兔对体温变化十分灵敏，适用于发热、解热
36、和检查致热源等实验鸽子、狗、猴、猫呕吐反应敏感，适于作呕吐实验金黄地鼠和豚鼠对各型钩端螺旋体敏感，适用于钩端螺旋体病的研究大鼠垂体-肾上腺系统功能发达，应激反应灵敏，适用于作应激反应和垂体、肾上腺、卵巢等内分泌实验大鼠肝再生能力强，适用于肝外科研究大鼠对炎症反应灵敏，踝关节对炎症反应更敏感，适用于多发性关节炎和化脓性淋巴腺炎研究也适于中耳疾病和内耳炎的研究大鼠是化学物质致畸最敏感的动物，适用于畸胎学研究豚鼠易于致敏，适于做过敏性实验研究家兔、鸡、鸽、猴食用高胆固醇、高脂肪的饲料一定时间后容易形成动脉粥样硬化病变，适用于动脉粥样硬化实验研究8.选择实验动物时既要考虑其特殊要求也不能忽视一般要求年
37、龄体重：幼年动物较灵敏；通常选成年动物进行实验；慢性实验时，可选择年幼、体重较小的动物 成年实验动物：小鼠1828 g，大鼠180280 g，豚鼠350650 g，家兔23 kg，猫1.52.5 kg，狗315 kg动物性别：一般应优先选用雄性动物或雌雄各半做实验；动物性别不影响实验结果的实验或一定要用雌性动物的实验例外健康状态：一定要选用健康动物做实验；应没有该动物所特有的疾病，如小鼠的脱脚病、肝炎和肺炎、鼠伤寒 实验季节和昼夜过程：如狗在春夏两季受辐射后的死亡率比秋冬高；一般放射敏感性白天低、夜间高；体温、血糖、基础代谢率、内分泌激素等皆有昼夜节律性变化实验重复和肯定：u在肯定一个实验结果
38、时最好采用2种以上的动物进行比较观察，其中一种应该是非啮齿类动物u由动物实验结果要外推到人的实验，所选用的动物品种应不少于3种，而且其中之一不应是啮齿类动物u常用的生物序列是：小鼠大鼠 狗(猴)五、如何选择指标1.形态指标、生化指标、功能指标、行为指标等2.金指标、一般指标将雄性Bcl-2高表达转基因小鼠(Bcl-2 transgenic mice)和受GFAP启动子控制表达疱疹病毒-胸苷激酶转基因雌性小鼠(GFAP-TK)交配产生的4只812周成年小鼠(2030g),Bcl-2/GFAP-TK双转基因小鼠作为实验组,同周龄4只Bcl-2转基因小鼠作为对照组。其中Bcl-2/GFAP-TK双转
39、基因小鼠皮下植入缓释泵,连续7d释放更昔洛韦(GCV)100mgkg-1d-1选择性地去除视神经损伤后激活的星形胶质细胞。更昔洛韦缓释泵植入术后2d在两组动物中制作右侧单眼标准的完全 性视神经钳夹损伤模型,视神经钳夹10d后获取组织标本。采用免疫荧光染色特异性检测再生轴突纤维并进行定量分析，结合罗丹明的霍乱毒素B亚单位(CTB-R)或增强表达绿色荧光蛋白的复制缺陷型腺相关病毒(AAV-EGFP)为标记物以显示再生轴突是否到达大脑靶器官。结果:在Bcl-2/GFAP-TK双转基因小鼠中存在免疫荧光阳性的再生视神经轴突,再生轴突计数为71.9924.04,并可见生长锥(growth cone)样结
40、构,但是再生轴突纤维未能延伸达到大脑靶器官。在对照组Bcl-2转基因小鼠中未见明显再生迹象 自体血注入和胶原酶注入大鼠尾状核建立脑出血模型是目前国内外使用最多的两种脑出血模型。但自体血注入法在取血过程中需控制在3min内完成,否则血液凝固；注血过程中血液大多从进针处冒出,血肿大小很不稳定；神经功能损伤不明，Bederson评分一般在2分左右。但血肿周围水肿带比较明显,因此该模型可用于脑水肿的机制、药物疗效及其作用机制的研究。胶原酶注入法:由胶原酶诱导的大鼠尾状核脑出血模型所产生的脑出血以渗出为主,出血量大,产生的血肿大小基本一致,并且神经功能障碍比较明显,Bederson评多在4分左右，是比较
41、常用的疾病动物模型 肝纤维化模型1.造模因素：(1)化学毒物：如CCl4、DMN；(2)生物因素：血吸虫尾蚴、细菌细胞壁、异种血清、异种动物蛋白、刀豆球蛋白(concanavalin A)；(3)机械因素：如结扎胆管2.指标(1)生物化学指标，如肝hydroxyproline(2)组织形态学指标，如肝组织切片HE染色、胶原染色、免疫组化(3)血清学指标，如HA,PIIIP,IV Col,LN(4)细胞学及分子生物学指标(5)各种反映模型产生与药物作用机制的指标 第5节 新方法简介 转基因动物(transgenic animal)没有新的筛选模型，就没有新型药物转基因动物指体内基因组中稳定地整合
42、有外源性基因的动物，转基因动物技术的发展，使人为对动物基因组进行遗传修饰成为可能转基因动物的一种较为严谨的概念是：“外源DNA”导入(包括同一物种的DNA)动物的基因组而产生了可以遗传的改变转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中；然后注入受精卵的任何一个前核，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来；采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（foster mother）的子宫内,使之发育成能表达目的基因的胚胎动物,并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。这类动物由于外源性目的基因的稳定存在而赋于子代动物个体这些可以遗传的改变包括：p外源DNA片段至少整合
43、到一条染色体的一个位点上p外源DNA的插入使基因组中任何一个基因的结构发生改变p外源DNA的插入使染色体发生重排p导入可以持久存在的遗传实体，如一条人工染色体或者可以自我复制并传递给子细胞的非染色体DNA元件不属于转基因动物范畴的其它手段：由于化学品的诱变作用导致基因发生改变由于辐射作用导致基因发生改变由于化学品或辐射的作用使染色体发生畸变通过核移植交换遗传物质使用基因治疗技术导入DNA转基因动物在基础生物学研究和医学及农业应用研究上有其独特作用，不可能被其它方法所取代研究基因的功能和基因间互作，最有效的手段是基因剔除技术和把人工修饰后的基因序列定向地整合到它原来的基因座上基因定向整合只能在细
44、胞中完成，经过基因修饰的细胞需要变成动物，只有在活的动物体才能观察和检验基因的功能“多莉”技术表明：动物体上多种类型的体细胞都可以通过克隆变成动物个体，再没必要研究胚胎干细胞，体细胞培养条件比胚胎干细胞简单很多体细胞核移植技术为基因结构、功能和表达调控的研究提供了飞速发展的基本条件体细胞克隆技术的出现，使我们可以能动地改进动物的基因组，应用基因工程的手段培育动物优良品种使用基因定向转移技术，在基因座上对基因的结构部分和调控部分进行修改，并把这种经过基因修改的细胞变成动物个体获得理想的基因修饰的细胞可以大量繁殖，并使用它们克隆出一批动物在基因座上对基因进行修改相当于一种自然发生的有利突变，并可成
45、批生产基因定向转移和体细胞克隆，是生命科学中两项重大技术，二者结合就获得了按照事先的设计，有计划地修改动物基因组的能力转基因小鼠技术u广义的转基因小鼠技术是指将外源基因导入到小鼠组织细胞内，并发挥作用的过程u将外源基因导入到小鼠体内，并且导入的基因可以通过遗传传给子代(将SV40病毒的DNA注射到小鼠囊胚腔中；小鼠受精卵原核DNA显微注射)u明确了2个概念：导入的基因可以在小鼠体内表达并发挥作用；人类的基因同样可以在小鼠体内发挥与原来相同或相似的作用u应用或意义：研究导入基因表达产物的体内功能；建立疾病动物模型；进行基因表达调控的研究如特定基因表达的时空特性；结合反义技术和RNAi技术，用于专
46、一性抑制小鼠体内特定基因表达u转基因小鼠实验内容：导入基因表达载体的构建；转基因小鼠的建立和鉴定；转基因小鼠品系的繁复；表型鉴定小鼠的基因剔除技术 指利用细胞内染色体DNA可以与导入细胞的外源DNA在相同序列的区域内发生同源重组的现象，在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)中定点破坏内源的基因，而后利用ES细胞发育的全能性，获得从ES细胞发育而来的带有预定基因缺陷的杂合子小鼠，通过遗传育种最后获得目的基因纯合缺陷的小鼠个体u1981年Evans和Martin等利用小鼠胚胎内细胞团建立的体外可以连续扩增和传代的具有发育全能性的胚胎干细胞即ES细胞uRobertson等对ES细胞进行转基因操作，并获得ES细
47、胞来源的小鼠个体u1988年Thomas等在ES细胞中利用DNA同源重组的原理实现了对预定基因进行缺失突变(基因打靶)，基因剔除技术正式建立u1993年Gu等将Cre-LoxP系统用于ES细胞的打靶，建立了条件性基因剔除和基因敲入(gene knockin)技术建立一个基因剔除小鼠的步骤：基因打靶载体的构建ES细胞的DNA转染和基因剔除阳性细胞克隆的筛选ES细胞的囊胚注射和胚胎移植嵌合小鼠及基因剔除杂合子小鼠的获得纯合小鼠的获得及表型研究制备免疫缺陷型动物模型，用于免疫性疾病及抗肿瘤和抗感染的药物研究制备各种与人类相应遗传病具有最接近的遗传改变的转基因小鼠，并运用基因敲除(geneknock-
48、out)技术完全排除其他基因影响，精确检测遗传改变所导致的结果，研究致病基因的功能，阐明结构、功能及在染色体上的定位利用基因工程方法将致病基因导入胚胎，诱发带有特殊病种的动物模型，如将乙肝病毒核酸基因导入小鼠生殖细胞，得到筛选抗肝炎的药物模型转基因大动物提供了一种生产特殊药物的生物工厂(bio-factories)，即在转基因动物的乳汁中生产药用蛋白质，如能分泌1-抗胰蛋白酶(ATT)的转基因绵羊；可分泌人tpA的转基因山羊；如抗凝血酶，磷脂蛋白、血红蛋白、生长激素等转基因动物具有外源基因局限于乳腺表达，受整个动物体影响少；乳腺可对蛋白质进行复杂的翻译后加工，类似人体产品，天然活性较高；乳汁蛋
49、白纯化技术简单，无污染基因工程技术使人类能定向改造生物，创造新产品，生产原先难于获得的大量产品或更有效地生产现有产品。已有近30种基因工程药物投入市场，以DNA重组技术为基础的生物技术成果主要集中在蛋白质类、多肽类和基因工程疫苗。基因重组乙肝亚单位疫苗的研制成功，是开发新型疫苗的一个重要里程碑通过基因敲除法(knock-out)产生的缺失特定受体的动物，发现其在脊椎动物发育中也起重要作用。如GR基因敲除小鼠由于肺不张，于出生后短期内死亡，其肾上腺缺少嗜铬细胞，说明小鼠肺、肾上腺的发育与成熟需GR参与。ER缺陷的雄性小鼠睾丸较小，生精小管结构改变；雌性小鼠卵泡发育受损，说明精子发生过程和卵泡发育过程有ER参与