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1、 ICS 11.220 CCS B 41 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 1864.32022 家禽疫病诊断技术规程 第 3 部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法 Code for practice diagnostic techniques of poultry diseases series Part 3:Test method of triple fluorescent PCR for detectingchicken Salmonella,Clostridium perfringens and Campylobacter jejuni 2022-
2、04-25 发布 2022-06-25 实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 1864.32022 I 目次 前言.II 引言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 原理.2 6 试验条件.2 7 仪器设备.2 8 试剂或材料.2 9 试验步骤.3 10 结果判定.4 11 生物安全措施.4 DB42/T 1864.32022 II 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件DB42/T 1864家禽疫病诊断技术规程为系列标准。本部分为DB42/T 1864的第3部
3、分。DB42/T 1864发布了以下部分：第 1 部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。第 3 部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜酸菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本文件由湖北省农业农村厅归口管理。本文件起草单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：张腾飞、罗青平、邵华斌、李婷婷、彭伏虎、温国元、王红琳、汪宏才、张蓉蓉、卢琴、罗玲、张文婷、商雨。本文件实施应用的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：；在执行过
4、程中有意见和建议请及时反馈至湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，联系电话：027-87284950，邮箱：。DB42/T 1864.32022 III 引 言 近年来，我国高度重视动物传染病的预防和控制工作，在国务院颁布的国家中长期动物疫病防治规划（20122020年）中明确要求进一步做好种禽场疫病净化、加强疫病检测诊断能力建设。家禽及蛋制品产业链是湖北省的十大重点产业链之一，为了加快湖北省重点农业产业链建设，保证家禽养殖健康与食品安全，依据湖北省重点农业产业链实施方案，对影响家禽及蛋制品产业链的禽白血病、禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌等家禽重要疫病开展快速检测方法研究。为加快我省家禽疫病净化进程，提
5、升疫病的监测、检测效率，促进我省家禽业持续健康发展，起草组围绕家禽疫病防控的需要，研制了 家禽疫病诊断技术规程系列标准，拟由4个部分构成。第一部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。目的在于开展家禽 J 亚群白血病病毒、马立克氏病病毒、网状内皮组织增生症病毒的快速检测，指导家禽肿瘤病的快速鉴别诊断。第二部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测。目的在于检测家禽泄殖腔拭子和粪便中的致病群大肠杆菌，指导家禽致病群大肠杆菌的快速检测。第三部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。目的在于检测鸡肉及相关产品、鸡泄殖腔拭子和粪便中的沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌，指导鸡肉及相关产品细菌
6、性疾病的快速检测。第四部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法。目的在于检测种鸡群蛋清、血浆、精液、胎粪、肛拭子中禽白血病抗原 ELISA 检测，指导种鸡场禽白血病的净化检测。DB42/T 1864.32022 1 家禽疫病诊断技术规程 第 3 部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了禽沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光PCR检测方法所需检测样品、仪器与设备、试剂与材料、检测步骤及结果判定。本文件适用于检测鸡肉及相关产品、鸡泄殖腔拭子和粪便中的沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而
7、构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.17 食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 荧光PCR realtime PCR 一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。BHQ1：黑洞淬灭剂-1
8、（Black Hole Quencher-1）BHQ2：黑洞淬灭剂-2（Black Hole Quencher-2）Ct值：循环阈值（Cycle threshold）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）FAM：荧光素酰胺（Fluorescein Amidite）HEX：六氯荧光素（Hexachloro-Fluorescein）DB42/T 1864.32022 2 PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）TAMRA：羧四甲基罗丹明（
9、Carboxytetramethylrhodamine）Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）5 原理 本文件采用Taqman三重探针法对鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌进行检测。该方法的原理是：针对沙门氏菌的特异性基因invA、产气荚膜梭菌的特异性基因cpa、空肠弯曲菌的特异性基因ccoN，分别设计特异的引物和探针，并以三种不同荧光标记三条探针，建立了一种鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光PCR检测方法。在样品检测时，样品DNA经PCR扩增与探针杂交，根据对应荧光强度判断是否存在鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌或空肠弯曲菌。6 试验条件 实验操作应在室温
10、（1825）下进行。样品前处理应在二级生物安全柜中进行。7 仪器设备 7.1 实时荧光 PCR 仪。7.2 生物安全柜。7.3 台式冷冻小型离心机（转速12 000 r/min）。7.4 微量移液器（2.5 L、10 L、200 L、1 mL）。7.5 冷藏冷冻冰箱。8 试剂或材料 8.1 试剂配制 本方法试验用水应按照GB/T 6682中规定的二级水，所有实验用试剂均为分析纯。试剂配制按照GB/T 27403规定执行。8.2 试剂或材料 8.2.1 PCR 缓冲液，dNTPs，Taq 酶。8.2.2 商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒。8.2.3 沙 门 氏 菌 引 物 与 探 针：上
11、游 引 物 5-GCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGC-3，下 游 引 物5-CCAGTACGATATTCAGTGCGATC-3，探针 5-TAMRA-TCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTAC-BHQ2-3。8.2.4 产 气 荚 膜 梭 菌 引 物 与 探 针：上 游 引 物 5-TGTAAGGCGCTTATTTGTGCT-3，下 游 引 物5-CCCTTGAGTTACAATCATAGCATG-3，探针 5-FAM-ACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTGG-BHQ1-3。8.2.5 空 肠 弯 曲 菌 引 物 与 探 针：上 游 引 物 5-TA
12、CAGATTGGATTCCAGGACA-3，下 游 引 物5-CTATACCTGTGGTTTGGATCCA-3，探针 5-HEX-TTCATGATGGAACATTAGGTTGGGTAGGAT-BHQ2-3。8.2.6 阳性对照：分别携带沙门氏菌 invA、携带产气荚膜梭菌 cpa 和携带空肠弯曲菌 ccoN 基因的阳性质粒 DNA，或沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌的基因组 DNA。DB42/T 1864.32022 3 8.2.7 阴性对照：无菌蒸馏水或去离子水。8.2.8 无 DNase/RNase 的 PCR 管、微量移液器枪头。9 试验步骤 9.1 样品的采集与保存 9.1.1 组织
13、样本 组织样品的取样方法按照GB/T 4789.17的规定执行。9.1.2 泄殖腔拭子样本 无菌操作将棉拭子插入泄殖腔内2 cm3 cm处并轻轻旋转，将有可见粪便的棉拭子放入采样管内。9.1.3 粪便样本 无菌操作采集l g2 g鸡新鲜粪便，放入一次性无菌采便管内。9.1.4 样品保存 样品采集后应编号，如果条件不许可立即送检进行前处理，前处理时间最好不超过采样后3小时。送检样品过程应注意冷藏，在实验室短暂保存时应置于冰箱4冷藏。9.2 DNA 的制备 9.2.1 样品前处理 将采集的粪便或棉拭子置于有0.5 mL无菌生理盐水的离心管中，搅拌混匀（尽可能将棉拭子上的粘附物洗脱下来），12000
14、 r/min离心2 min。弃上清，取沉淀用于核酸提取。9.2.2 DNA 提取 在样品的前处理沉淀中，加入100 L DNA提取液充分涡旋混匀，沸水浴10 min，在4下12 000 r/min离心5 min，上清可直接用于荧光PCR反应。也可以使用商品化的DNA提取试剂盒或高通量核酸纯化工作站提取DNA模板，具体步骤参照说明书。9.3 荧光 PCR 检测 9.3.1 反应体系 反应体系体积为25 L，10PCR缓冲液2.5 L，上、下游引物（10 mol/L）各0.5 L，dNTPs（10 mmol/L）2 L，探针（10 mol/L）各0.5 L，Taq酶（5 U/L）0.25 L，模板
15、DNA 2.5 L。也可使用商品化的PCR反应预混液替换单独的酶、dNTPs和缓冲液，再加入引物、探针和模板。用灭菌的去离子水补足体积至25 L。9.3.2 反应条件 荧光PCR反应在多通道荧光定量PCR仪上进行，选择荧光信号TAMRA、FAM和HEX（分别检测沙门氏菌-TAMRA，产气荚膜梭菌-FAM，空肠弯曲菌-HEX），反应参数为95 10 min，然后95 10 sec，60 45 DB42/T 1864.32022 4 sec，进行45个循环，其中在60进行三重荧光检测。阈值设置为阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点。9.3.3 对照 检测过程中分别设阳性对照与阴性对照。10
16、结果判定 10.1 质控标准 阴性对照（无菌水）无Ct值或大于40，无扩增曲线；阳性对照品TAMRA、FAM和HEX通道检测结果的Ct值均不大于30，扩增曲线明显呈对数增长；如果阴性对照或者阳性对照有一项不符合标准则本次检测无效。10.2 结果分析 检测结果的判定应按照表1规定。表1 检测结果的判定 通道 Ct 值 结果判断 TAMRA 35 报告为沙门氏菌荧光 PCR 检测阳性 无 Ct 值或40 检测样品低于检测限或没有，报告为沙门氏菌荧光 PCR 检测阴性 3540 Ct 值在 3540 之间为灰值区域，对样品重新提取基因组，再检测一次，重做后Ct 值37 且有扩增曲线的报告为沙门氏菌荧
17、光 PCR 检测阳性，其余则报告为沙门氏菌荧光 PCR 检测阴性 FAM 35 报告为产气荚膜梭菌荧光 PCR 检测阳性 无 Ct 值或40 检测样品低于检测限或没有，报告为产气荚膜梭菌荧光 PCR 检测阴性 3540 Ct 值在 3540 之间为灰值区域，对样品重新提取基因组，再检测一次，重做后Ct 值37 且有扩增曲线的报告为产气荚膜梭菌荧光 PCR 检测阳性，其余则报告为产气荚膜梭菌荧光 PCR 检测阴性 HEX 35 报告为空肠弯曲菌荧光 PCR 检测阳性 无 Ct 值或40 检测样品低于检测限或没有，报告为空肠弯曲菌荧光 PCR 检测阴性 3540 Ct 值在 3540 之间为灰值区域，对样品重新提取基因组，再检测一次，重做后Ct 值37 且有扩增曲线的报告为空肠弯曲菌荧光 PCR 检测阳性，其余则报告为空肠弯曲菌荧光 PCR 检测阴性 10.3 检测注意事项 本方法是基于DNA的检测，检测结果阳性表示核酸阳性。实验过程应避免环境污染，试剂污染，样品交叉污染。11 生物安全措施 DB42/T 1864.32022 5 生物安全措施按照GB 19489的规定执行。DB42/T 1864.32022 6