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1、十三、炭炭疽防治治技术规规范炭疽（AAnthhraxx）是由由炭疽芽芽胞杆菌菌引起的的一种人人畜共患患传染病病。世界界动物卫卫生组织织（OIEE）将其其列为必必须报告告的动物物疫病，我我国将其其列为二二类动物物疫病。为预防和和控制炭炭疽，依依据中中华人民民共和国国动物防防疫法和和其它相相关法律律法规，制制定本规规范。1 适适用范围围本规范规规定了炭炭疽的诊诊断、疫疫情报告告、疫情情处理、防防治措施施和控制制标准。本规范适适用于中中华人民民共和国国境内一一切从事事动物饲饲养、经经营及其其产品的的生产、经经营的单单位和个个人，以以及从事事动物防防疫活动动的单位位和个人人。2 诊诊断依据本病病流行病
2、病学调查查、临床床症状，结结合实验验室诊断断结果做做出综合合判定。2.1 流行行特点本病为人人畜共患患传染病病，各种种家畜、野野生动物物及人对对本病都都有不同同程度的的易感性性。草食食动物最最易感，其其次是杂杂食动物物，再次次是肉食食动物，家家禽一般般不感染染。人也也易感。患病动物物和因炭炭疽而死死亡的动动物尸体体以及污污染的土土壤、草草地、水水、饲料料都是本本病的主主要传染染源，炭炭疽芽胞胞对环境境具有很很强的抵抵抗力，其其污染的的土壤、水水源及场场地可形形成持久久的疫源源地。本本病主要要经消化化道、呼呼吸道和和皮肤感感染。本病呈地地方性流流行。有有一定的的季节性性，多发发生在吸吸血昆虫虫多
3、、雨雨水多、洪洪水泛滥滥的季节节。2.2 临床床症状2.2.1 本规范范规定本本病的潜潜伏期为为20天天。2.2.2 典型症症状 本病主要要呈急性性经过，多多以突然然死亡、天天然孔出出血、尸尸僵不全全为特征征。牛：体温温升高常常达411以上，可可视黏膜膜呈暗紫紫色，心心动过速速、呼吸吸困难。呈呈慢性经经过的病病牛，在在颈、胸胸前、肩肩胛、腹腹下或外外阴部常常见水肿肿；皮肤肤病灶温温度增高高，坚硬硬，有压压痛，也也可发生生坏死，有有时形成成溃疡；颈部水水肿常与与咽炎和和喉头水水肿相伴伴发生，致致使呼吸吸困难加加重。急急性病例例一般经经2436小小时后死死亡，亚亚急性病病例一般般经25天后后死亡。
4、马：体温温升高，腹腹下、乳乳房、肩肩及咽喉喉部常见见水肿。舌舌炭疽多多见呼吸吸困难、发发绀；肠肠炭疽腹腹痛明显显。急性性病例一一般经224336小时时后死亡亡，有炭炭疽痈时时，病程程可达338天天。羊：多表表现为最最急性（猝猝死）病病症，摇摇摆、磨磨牙、抽抽搐，挣挣扎、突突然倒毙毙，有的的可见从从天然孔孔流出带带气泡的的黑红色色血液。病病程稍长长者也只只持续数数小时后后死亡。猪：多为为局限性性变化，呈呈慢性经经过，临临床症状状不明显显，常在在宰后见见病变。犬和其它它肉食动动物临床床症状不不明显。2.3 病理理变化死亡患病病动物可可视黏膜膜发绀、出出血。血血液呈暗暗紫红色色，凝固固不良，粘粘稠似
5、煤煤焦油状状。皮下下、肌间间、咽喉喉等部位位有浆液液性渗出出及出血血。淋巴巴结肿大大、充血血，切面面潮红。脾脾脏高度度肿胀，达达正常数数倍，脾脾髓呈黑黑紫色。严禁在非非生物安安全条件件下进行行疑似患患病动物物、患病病动物的的尸体剖剖检。2.4 实验验室诊断断实验室病病原学诊诊断必须须在相应应级别的的生物安安全实验验室进行行。2.4.1 病原鉴鉴定2.4.1.11 样样品采集集、包装装与运输输按照NYYT5561 2.11.2、44.1、55.1执执行。2.4.1.22 病病原学诊诊断炭疽的病病原分离离及鉴定定（见NNY/TT5611）。2.4.2 血清学学诊断 炭疽沉淀淀反应（见见NY/T56
6、61）。2.4.3 分子生生物学诊诊断聚合酶链链式反应应（PCCR）（见见附件11）。3 疫疫情报告告3.1 任何何单位和和个人发发现患有有本病或或者疑似似本病的的动物，都都应立即即向当地地动物防防疫监督督机构报报告。3.2 当地地动物防防疫监督督机构接接到疫情情报告后后，按国国家动物物疫情报报告管理理的有关关规定执执行。4 疫疫情处理理依据本病病流行病病学调查查、临床床症状，结结合实验验室诊断断做出的的综合判判定结果果可做为为疫情处处理依据据。4.1 当地地动物防防疫监督督机构接接到疑似似炭疽疫疫情报告告后，应应及时派派员到现现场进行行流行病病学调查查和临床床检查，采采集病料料送符合合规定的
7、的实验室室诊断，并并立即隔隔离疑似似患病动动物及同同群动物物，限制制移动。对病死动动物尸体体，严禁禁进行开开放式解解剖检查查，采样样时必须须按规定定进行，防防止病原原污染环环境，形形成永久久性疫源源地。4.2 确诊诊为炭疽疽后，必必须按下下列要求求处理。4.2.1 由由所在地地县级以以上兽医医主管部部门划定定疫点、疫疫区、受受威胁区区。疫 点：指患病病动物所所在地点点。一般般是指患患病动物物及同群群动物所所在畜场场（户组组）或其其它有关关屠宰、经经营单位位。疫 区：指由疫疫点边缘缘外延33公里范范围内的的区域。在在实际划划分疫区区时，应应考虑当当地饲养养环境和和自然屏屏障（如如河流、山山脉等）
8、以以及气象象因素，科科学确定定疫区范范围。受威胁区区：指疫疫区外延延5公里里范围内内的区域域。4.2.2 本本病呈零零星散发发时，应应对患病病动物作作无血扑扑杀处理理，对同同群动物物立即进进行强制制免疫接接种，并并隔离观观察200天。对对病死动动物及排排泄物、可可能被污污染饲料料、污水水等按附附件2的的要求进进行无害害化处理理；对可可能被污污染的物物品、交交通工具具、用具具、动物物舍进行行严格彻彻底消毒毒（见附附件2）。疫疫区、受受威胁区区所有易易感动物物进行紧紧急免疫疫接种。对对病死动动物尸体体严禁进进行开放放式解剖剖检查，采采样必须须按规定定进行，防防止病原原污染环环境，形形成永久久性疫源
9、源地。4.2.3 本病病呈暴发发流行时时（1个个县100天内发发现5头头以上的的患病动动物），要要报请同同级人民民政府对对疫区实实行封锁锁；人民民政府在在接到封封锁报告告后，应应立即发发布封锁锁令，并并对疫区区实施封封锁。疫点、疫疫区和受受威胁区区采取的的处理措措施如下下：4.2.3.11 疫疫点出入口必必须设立立消毒设设施。限限制人、易易感动物物、车辆辆进出和和动物产产品及可可能受污污染的物物品运出出。对疫疫点内动动物舍、场场地以及及所有运运载工具具、饮水水用具等等必须进进行严格格彻底地地消毒。患病动物物和同群群动物全全部进行行无血扑扑杀处理理。其它它易感动动物紧急急免疫接接种。对所有病病死
10、动物物、被扑扑杀动物物，以及及排泄物物和可能能被污染染的垫料料、饲料料等物品品产品按按附件22要求进进行无害害化处理理。动物尸体体需要运运送时，应应使用防防漏容器器，须有有明显标标志，并并在动物物防疫监监督机构构的监督督下实施施。4.2.3.22 疫疫区：交交通要道道建立动动物防疫疫监督检检查站，派派专人监监管动物物及其产产品的流流动，对对进出人人员、车车辆须进进行消毒毒。停止止疫区内内动物及及其产品品的交易易、移动动。所有有易感动动物必须须圈养，或或在指定定地点放放养；对对动物舍舍、道路路等可能能污染的的场所进进行消毒毒。对疫区内内的所有有易感动动物进行行紧急免免疫接种种。4.2.3.33
11、受受威胁区区：对受受威胁区区内的所所有易感感动物进进行紧急急免疫接接种。4.2.3.44 进进行疫源源分析与与流行病病学调查查4.2.3.55 封封锁令的的解除最后1头头患病动动物死亡亡或患病病动物和和同群动动物扑杀杀处理后后20天天内不再再出现新新的病例例，进行行终末消消毒后，经经动物防防疫监督督机构审审验合格格后，由由当地兽兽医主管管部门向向原发布布封锁令令的机关关申请发发布解除除封锁令令。4.2.4 处理记记录对处理疫疫情的全全过程必必须做好好完整的的详细记记录，建建立档案案。5 预预防与控控制5.1 环境境控制 饲养、生生产、经经营场所所和屠宰宰场必须须符合动动物防疫疫条件审审核管理理
12、办法（农农业部20002115号令令）规定定的动物物防疫条条件，建建立严格格的卫生生（消毒毒）管理理制度。5.2 免疫疫接种 5.2.1 各省根根据当地地疫情流流行情况况，按农农业部制制定的免免疫方案案，确定定免疫接接种对象象、范围围。5.2.2 使用国国家批准准的炭疽疽疫苗，并并按免疫疫程序进进行适时时免疫接接种，建建立免疫疫档案。5.3 检疫疫5.3.1 产地检检疫按GB1165449和动物检疫管理办法实施检疫。检出炭疽阳性动物时，按本规范4.2.2规定处理。5.3.2 屠宰检检疫按NY4467和和动物物检疫管管理办法法对屠屠宰的动动物实施施检疫。5.4 消毒毒对新老疫疫区进行行经常性性消
13、毒，雨雨季要重重点消毒毒。皮张张、毛等等按照附附件2实实施消毒毒。5.5 人员员防护动物防疫疫检疫、实实验室诊诊断及饲饲养场、畜畜产品及及皮张加加工企业业工作人人员要注注意个人人防护，参与疫情处理的有关人员，应穿防护服、戴口罩和手套，做好自身防护。附件1聚合酶链链式反应（PPCR）技技术1 试试剂1.1 消化液液1.1.1 11M 三三羟甲基基氨基甲甲烷-盐盐酸(TTriss-HCCl)(pH88.0)三羟甲基基氨基甲甲烷 122.111g灭菌双蒸蒸水 80mLL浓盐酸 调pHH至8.0灭菌双蒸蒸水 加加至1000mLL1.1.2 00.5MM 乙二二铵四乙乙酸二钠钠(EDDTA)溶液 (pH
14、H8.00)二水乙二二铵四乙乙酸二钠钠 118.661g灭菌双蒸蒸水 80mLL氢氧化钠钠 调调pH至88.0灭菌双蒸蒸水 加至1100mmL1.1.3 20% 十二二烷基磺磺酸钠(SDSS)溶液液 (ppH7.2)十二烷基基磺酸钠钠 220g灭菌双蒸蒸水 80mmL浓盐酸 调ppH至77.2灭菌双蒸蒸水 加加至1000mLL1.1.4 消消化液配配制1M 三三羟甲基基氨基甲甲烷-盐盐酸(TTriss-HCCl)(pH8.0) 22mL0.5mmol/L 乙乙二铵四四乙酸二二钠溶液液(pHH8.00) 0.4mLL20% 十二烷烷基磺酸酸钠溶液液(pHH7.22) 5mmL5M 氯氯化钠 44
15、mL灭菌双蒸蒸水 加至至2000mL1.2 蛋白白酶K溶溶液蛋白酶KK5g灭菌双蒸蒸水 加加至2550mLL1.3 酚/氯仿/异戊醇醇混合液液碱性酚 25mmL氯仿 244mL异戊醇 1mmL1.4 2.5mmmol/LdNNTP dATPP(1000mmmol/L) 200LdTTPP(1000mmmol/L) 200LdGTPP(1000mmmol/L) 220LdCTPP(1000mmmol/L) 220L灭菌双蒸蒸水加至至8000L1.5 8ppmoll/L PPCR引引物上游引物物ATXXU（22 ODD）加入入7011l灭菌双双蒸水溶溶解，下游引引物ATTXD（22 ODD）加入入
16、6977L灭菌双双蒸水溶溶解，分别取取ATXXU、ATXDD溶液各各3000L，混匀匀即为88pmool/L扩增引引物。1.6 0.5单位位Taqq DNNA聚合合酶5单位TTaq DNAA聚合酶酶 1L灭菌双蒸蒸水 加至110L现用现配配。 1.7 100PCRR缓冲液液1.7.1 1mool/LL 三羟羟甲基氨氨基甲烷烷-盐酸酸(Trris-HCll)( pH99.0)三羟基甲甲基氨基基甲烷 15.8g灭菌双蒸蒸水 800mL浓盐酸 调pHH至9.0灭菌双蒸蒸水 加至至1000mL1.7.2 10倍倍PCRR缓冲液液1moll/L三三羟基甲甲基氨基基甲烷-盐酸(Triis-HHCl)( p
17、pH9.0) 1mL氯化钾 00.3773g曲拉通XX-1000 0.11mL灭菌双蒸蒸水 加至1100mL1.8 溴化化乙锭(EB)溶液溴化乙锭锭 00.2gg灭菌双蒸蒸水 加至至20mmL1.9 电泳缓缓冲液(50倍倍)1.9.1 0.5mool/LL 乙二二铵四乙乙酸二钠钠(EDDTA)溶液 (pHH8.00)二水乙二二铵四乙乙酸二钠钠 188.611g灭菌双蒸蒸水 80mLL氢氧化钠钠 调pH至88.0灭菌双蒸蒸水 加加至1000mLL1.9.2 TTAE电电泳缓冲冲液(550倍) 三羟基甲甲基氨基基甲烷(Triis) 2442g冰乙酸 577.1mmlL0.5mmol/L乙二二铵四乙
18、乙酸二钠钠溶液(pH8.0) 1000mL灭菌双蒸蒸水 加加至1 0000mL用时用灭灭菌双蒸蒸水稀释释使用1.100 1.5琼琼脂糖凝凝胶 琼脂糖 33gTAE电电泳缓冲冲液(550倍) 4mmL灭菌双蒸蒸水 1966mL微波炉中中完全融融化，加加溴化乙乙锭（EEB）溶溶液200L。1.111 上上样缓冲冲液溴酚蓝00.2gg，加双双蒸水110mLL过夜溶溶解。550g蔗蔗糖加入入50mml水溶溶解后，移移入已溶溶解的溴溴酚蓝溶溶液中，摇摇匀定容容至1000mLL。1.122 其它它试剂异丙醇(分析纯纯)70%乙乙醇15mmmoL/L氯化化镁灭菌双蒸蒸水2 器器材2.1 仪器器分析天平平、高
19、速速离心机机、真空空干燥器器、PCCR扩增增仪、电电泳仪、电电泳槽、紫紫外凝胶胶成像仪仪（或紫紫外分析析仪）、液液氮或-70冰箱、微微波炉、组组织研磨磨器、-20冰箱、可可调移液液器（22L 、220L、2200L、110000L）。2.2 耗材材眼科剪、眼眼科镊、称称量纸、220 mmL一次次性注射射器、11.5mL灭菌菌离心管管、0.2 mmL薄壁壁PCRR管、琼琼脂糖、5500 mL量量筒、5500 mL锥锥形瓶、吸吸头(10L、2200L、110000L)、灭菌菌双蒸水水。2.3 引物物设计根据GeenBaank上上已发表表的炭疽疽杆菌PPOX11质粒序序列，设设计并合合成了以以下两条
20、条引物：ATXUU：5-AAGAAATGTTATCCACCCAGAAGGCC-3ATXXD：5-GTTTGTTAGAATTGGGAGGCCGTCC-3，此对对引物扩扩增片段段为3994bpp。2.4 样品品的采集集与处理理2.4.1 样品的的采集病死或扑扑杀的动动物取肝肝脏或脾脾；待检检的活动动物，用用注射器器取血55100mL，228保存，送送实验室室检测。2.4.2 样品品的处理理每份样品品分别处处理。2.4.2.11 组组织样品品处理称取待检检病料00.2gg，置研研磨器中中剪碎并并研磨，加加入2mmL消化化液继续续研磨。取取已研磨磨好的待待检病料料上清1100L加入入1.55 mLL灭
21、菌离离心管中中，再加加入5000L消化化液和110L蛋白白酶K溶溶液，混混匀后，置置55水浴中中4116h。2.4.2.22 待待检菌的的处理取培养获获得的菌菌落，重重悬于生生理盐水水中。取取其悬液液1000L加入入1.55mL灭灭菌离心心管中，再再加入5500L 消消化液和和10L 蛋蛋白酶KK溶液，混混匀后，置置55水浴中中过夜。2.4.2.33 全全血样品品处理待血凝后后取上清清放于离离心管中中，480000 gg离心5分钟，取取上清1100L，加加入5000L消化化液和110L蛋白白酶K溶溶液，混混匀后，置置55水浴中中过夜。 2.4.2.44 阳阳性对照照处理取培养的的炭疽杆杆菌，重
22、重悬于生生理盐水水中。取取其悬液液1000L，置置1.55 mLL灭菌离离心管中中，加入入5000L消化化液和110L蛋白白酶K溶溶液，混混匀后，置置55水浴中中过夜。2.4.2.55 阴阴性对照照处理取灭菌双双蒸水1100L，置置1.55 mLL灭菌离离心管中中，加入入5000L 消消化液110l蛋白白酶K溶溶液，混混匀后，置置55水浴中中过夜。2.5 DNNA模板板的提取取2.5.1 取出已已处理的的样品及及阴、阳阳对照，加加入6000L酚/氯仿/异戊醇醇混合液液，用力力颠倒110次混混匀，1120000g离离心100分钟。2.5.2 取上清清置1.5mL灭灭菌离心心管中，加加入等体体积异
23、丙丙醇，混混匀，置置液氮中中3分钟钟。取出出样品管管，室温温融化，1150000rppm离心心15分分钟。2.5.3 弃上清清，沿管管壁缓缓缓滴入11ml 70%乙醇，轻轻轻旋转转洗一次次后倒掉掉，将离离心管倒倒扣于吸吸水纸上上1分钟钟，真空空抽干115分钟钟(以无无乙醇味味为准)。2.5.4 取出样样品管，用用50L灭菌菌双蒸水水溶解沉沉淀，作作为模板板备用。2.6 PCCR扩增增总体积220l，取取灭菌双双蒸水88l,2.5mmmol/L ddNTPP、8ppmoll/L扩增增引物、115mmmol/L氯化化镁、110PCRR缓冲液液、0.5单位位TaqqDNAA聚合酶酶各2L，22L模板
24、板DNAA。混匀匀，作好好标记，加加入矿物物油200L覆盖盖(有热热盖的自自动DNNA热循循环仪不不用加矿矿物油)。扩增增条件为为94 3分分钟后，94 30s，58 30s，72 30s循环35次，72延伸 5分钟。2.7 电泳泳将PCRR扩增产产物155L混合合3L上样样缓冲液液，点样样于1.5%琼琼脂糖凝凝胶孔中中，以55V/ccm电压压于1TAEE缓冲液液中电泳泳，紫外外凝胶成成像仪下下观察结结果。2.8 结果果判定在阳性对对照出现现3944bp扩扩增带、阴阴性对照照无带出出现(引物带带除外)时，试试验结果果成立。被被检样品品出现3394bbp扩增增带为炭炭疽杆菌菌阳性，否否则为阴阴性
25、。附件2无害化处处理1 炭炭疽动物物尸体处处理应结合远远离人们们生活、水水源等因因素考虑虑，因地地制宜，就就地焚烧烧。如需需移动尸尸体，先先用5福尔马马林消毒毒尸体表表面，然然后搬运运，并将将原放置置尸地及及尸体天天然孔出出血及渗渗出物用用5%福福尔马林林浸渍消消毒数次次，在搬搬运过程程中避免免污染沿沿途路段段。焚烧烧时将尸尸体垫起起，用油油或木柴柴焚烧，要要求燃烧烧彻底。无无条件进进行焚烧烧处理时时，也可可按规定定进行深深埋处理理。2 粪粪肥、垫垫料、饲饲料的处处理被污染的的粪肥、垫垫料、饲饲料等，应应混以适适量干碎碎草，在在远离建建筑物和和易燃品品处堆积积彻底焚焚烧，然然后取样样检验，确确
26、认无害害后，方方可用作作肥料。3 房屋、厩厩舍处理理开放式房房屋、厩厩舍可用用5%福福尔马林林喷洒消消毒三遍遍，每次次浸渍22小时。也也可用220漂漂白粉液液喷雾，2200mmL/mm2作用22小时。对对砖墙、土土墙、地地面污染染严重处处，在离离开易燃燃品条件件下，亦亦可先用用酒精或或汽油喷喷灯地毯毯式喷烧烧一遍，然然后再用用5福福尔马林林喷洒消消毒三遍遍。对可密闭闭房屋及及室内橱橱柜、用用具消毒毒，可用用福尔马马林熏蒸蒸。在室室温188条件下下，对每每2530mm3空间，用用10浓甲醛醛液（内内含377甲醛醛气体）约约40000mLL，用电电煮锅蒸蒸4小时时。蒸前前先将门门窗关闭闭，通风风孔
27、隙用用高粘胶胶纸封严严，工作作人员戴戴专用防防毒面具具操作。密密封812小小时后，打打开门窗窗换气，然然后使用用。熏蒸消毒毒效果测测定，可可用浸有有炭疽弱弱毒菌芽芽孢的纸纸片，放放在含组组氨酸的的琼脂平平皿上，待待熏后取取出置337培养224小时时，如无无细菌生生长即认认为消毒毒有效。也可选择择其它消消毒液进进行喷洒洒消毒，如如4戊戊二醛（ppH8.088.5）22小时浸浸洗、55甲醛醛（约115福福尔马林林）2小小时、33 HH2O22小时时或过氧氧乙酸22小时。其其中，HH2O2和过氧氧乙酸不不宜用于于有血液液存在的的环境消消毒；过过氧乙酸酸不宜用用于金属属器械消消毒。4 泥泥浆、粪粪汤处
28、理理猪、牛等等动物死死亡污染染的泥浆浆、粪汤汤，可用用20漂白粉粉液1份份（处理理物2份份），作作用2小小时；或或甲醛溶溶液5001000mll/m33比例加加入，每每天搅拌拌122次，消消毒4天天，即可可撒到野野外或田田里，或或掩埋处处理(即即作深埋埋处理)。5 污污水处理理按水容量量加入甲甲醛溶液液，使其其含甲醛醛液量达达到5，处理理10小小时；或或用3过氧乙乙酸处理理4小时时；或用用氯胺或或液态氯氯加入污污水，于于pH44.0时时加入有有效氯量量为4mmg/LL，300分钟可可杀灭芽芽孢，一一般加氯氯后作用用2小时时流放一一次。6 土土壤处理理炭疽动物物倒毙处处的土壤壤消毒，可可用5甲醛
29、溶溶液5000mLL/m22消毒三三次，每每次2小小时，间间隔1小小时。亦亦可用氯氯胺或110漂漂白粉乳乳剂浸渍渍2小时时，处理理2次，间间隔1小小时。亦亦可先用用酒精或或柴油喷喷灯喷烧烧污染土土地表面面，然后后再用55甲醛醛溶液或或漂白粉粉乳剂浸浸渍消毒毒。7 衣衣物、工工具及其其它器具具处理耐高温的的衣物、工工具、器器具等可可用高压压蒸汽灭灭菌器在在1211高压蒸蒸汽灭菌菌1小时时；不耐耐高温的的器具可可用甲醛醛熏蒸，或或用5甲醛溶溶液浸渍渍消毒。运运输工具具、家具具可用110漂漂白粉液液或1过氧乙乙酸喷雾雾或擦拭拭，作用用122小时。凡凡无使用用价值的的严重污污染物品品可用火火彻底焚焚毁消毒毒。8 皮皮、毛处处理皮毛、猪猪鬃、马马尾的消消毒，采采用977988的环环氧乙烷烷、2的COO2、1的十二二氟混合合液体，加加热后输输入消毒毒容器内内，经448小时时渗透消消毒，启启开容器器换气，检检测消毒毒效果。但但须注意意，环氧氧乙烷的的熔点很很低（0），在在空气中中浓度超超过3，遇明明火即易易燃烧发发生爆炸炸，必须须低温保保存运输输，使用用时应注注意安全全。骨、角、蹄蹄在制作作肥料或或其它原原料前，均均应彻底底消毒。如如采用1121高压蒸蒸汽灭菌菌；或55甲醛醛溶液浸浸泡；或或用火焚焚烧。264