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1、大黄虫丸对肝纤维化大鼠肝组织及其表达的影响 肝纤维化指标正常值 关键词 大黄NFAE6虫丸 肝纤维化 血管惊慌素1型受体 二甲基亚硝胺 大鼠 肝纤维化是各种慢性肝病共同的病理学基础,是诸多慢性肝病向肝硬化甚至肝癌发展的必经阶段,其核心环节是肝星状细胞(HSC)的活化并向肌成纤维样细胞和成纤维细胞的转化,阻断或逆转肝纤维化是治疗各种慢性肝病的关键。肝局部存在肾素血管惊慌素系统(RAS),其成分通过血管惊慌素1型受体(AT1R)可促进肝星状细胞活化从而参加肝纤维化的发展1。大黄NFAE6虫丸抗肝纤维化治疗疗效准确2,但其抗肝纤维化作用机制是否与AT1 R有关未见报道。本试验通过视察大黄NFAE6虫
2、丸对二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化模型大鼠的治疗作用,探讨其对肝组织AT1 R及其m RNA表达的影响,从RAS角度初步探讨大黄NFAE6虫丸抗肝纤维化的作用机制。 1 材料 1.1 动物:清洁级SD大鼠50只,雄性,体重16020g,由浙江中医药高校试验动物中心供应并饲养。 1.2 主要药物与试剂:大黄NFAE6虫丸:3g/袋,湖南回春堂药业有限公司产品(批号:20080410);复方鳖甲软肝片:0.5g/片,内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司产品(批号:20080317);二甲基亚硝胺:天津市化学试剂公司出品。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂盒均为上海科欣生物技术探讨所产
3、品,(批号分别为:20071203、080101);Trizol试剂:美国Invitrogen公司产品(批号:1382739);AT1R免疫组化试剂盒:河北博海生物工程开发有限公司产品(批号:080713);RT-PCR试剂盒:上海科延生物技术有限公司产品(批号:070602)。 1.3 引物:大鼠AT1 R上游引物:5-CAC GCT TTC TTA CCG-3,下游引物:5-TGA CTA CAG GGA CAA CA-3;肌动蛋白(-actin)上游引物:5ATG CCA TCC TGC GTC TG 3,下游引物:5GGA CTC ATC GTA CTC CTG CT 3。引物由上海博
4、尚生物科技有限公司合成。 1.4 试验仪器:组织切片机(德国Leca公司),恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂),PCR循环仪(德国Biometra公司),多功能真彩色细胞图象分析管理系统(美国Media Cybernetics公司),GIS凝胶图像分析处理系统(上海天能科技有限公司)。 2 方法 2.1 肝纤维化模型制备及分组:50只雄性SD大鼠随机分为造模组及正常比照组。除正常比照组大鼠10只外,其余40只大鼠按10mg/kg体重每周一、二、三连续3次腹腔注射1%浓度的DMN进行造模,连续注射4周共12次3,4周后将存活的35只大鼠随机分为模型比照组12只、大黄NFAE6虫丸组12只、阳性比照
5、组(复方鳖甲软肝片)11只。 2.2 试验用药:将大黄NFAE6虫丸与复方鳖甲软肝片分别用蒸馏水溶解制成混悬液,按人与大鼠体表面积比折算的等效剂量给药。大黄NFAE6虫丸按1.08g/kg体重灌胃给药,复方鳖甲软肝片按1g/kg体重灌胃给药。模型组与正常组以生理盐水10ml/kg体重灌胃,各组均每天给药1次,时间持续2周。 2.3 大鼠处理方法:末次给药当晚禁食不禁水,次日上午空腹按40mg/kg剂量腹腔注射1%的戊巴比妥麻醉,腹腔静脉采血,离心机分别取血清,-20冰箱保存备用。快速分别肝脏,取大鼠肝左叶肝组织入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定,逐级酒精脱水,经透亮、常规石蜡包埋,用作肝组织HE染
6、色、苦味酸-天狼红胶原染色及免疫组织化学染色指标的检测。其余簇新肝脏经生理盐水清洗后马上投入液氮中冻存,3小时后移入-70低温冰箱中保存,用于提取总核糖核酸(RNA)及RT-PCR检测。 2.4 检测指标及方法:血清ALT、AST采纳赖氏法检测,按试剂盒说明书操作。肝组织行HE和苦味酸-天狼红染色,光镜下视察肝组织病理改变与肝纤维化程度,依照试验动物肝纤维化组织学级标准和改良的Chevallier肝纤维化SSS半定量计分标准进行肝纤维化程度评判。肝组织AT1R的表达采纳免疫组织化学SP法检测。逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR法)检测肝组织AT1RmRNA的表达:用Trizol一步法抽提肝组织
7、总RNA,。逆转录后运用上述引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经琼脂糖电泳,GIS凝胶图像分析处理系统对电泳条带进行光密度值扫描,用AT1R/-actin的光密度比值表示AT1R的mRNA表达的相对水平。 2.5 统计学处理:采纳SPSS 13.0统计软件包进行数据的分析处理,结果以均数标准差(xs)表示,对计量资料采纳单因素方差分析,对等级计数资料采纳非参数秩和检验,检验其差异显著性,均以P0.05)。 3.2 对各组大鼠肝脏病理学的视察:正常组大鼠肝小叶结构完整,无变性、坏死,肝细胞索排列整齐。肝组织基本无胶原分布,仅在中心静脉和汇管区四周以及肝窦内有少量分布。模型组大鼠肝小叶结构破坏,肝
8、细胞索排列紊乱,可见肝细胞不同程度的炎性坏死,炎性细胞浸润严峻。胶原纤维明显增生,相互连接的纤维隔将肝小叶重新分割形成假小叶。大黄NFAE6虫丸组与阳性比照组肝细胞坏死、炎性细胞浸润程度轻于模型组。模型组大鼠肝组织肝纤维化SSS计分明显高于正常组(P0.05)。见表2。 3.3 各组大鼠肝组织AT1R及其mRNA表达改变:见表3。模型组大鼠肝组织AT1R表达面积及其mRNA的表达水平比较正常组显著上升(P0.05)。 4 探讨 探讨证明,肝纤维化时激活的HSC大量表达AT1R,同时合成血管惊慌素,血管惊慌素又与HSC细胞膜上的AT1R结合刺激其增殖和胶原合成,从而进一步促进肝纤维化的形成4。A
9、T1R拮抗剂能有效抑制肝纤维化进程,提示肝局部RAS与肝纤维化亲密相关。 本探讨结果显示,大黄NFAE6虫丸可明显改善DMN诱导的肝纤维化大鼠的肝纤维化程度,降低血清ALT、AST水平。免疫组化和RT-PCR结果表明,正常肝组织可表达AT1R,肝纤维化时AT1R及其mRNA表达明显增加,提示AT1R可能参加了DMN致的大鼠肝纤维化的形成。用大黄NFAE6虫丸治疗2周后,大鼠肝组织AT1R及其mRNA表达明显低于模型组,提示通过部分下调肝组织AT1RmRNA的基因表达从而部分阻断肝AT1R表达,截断肝纤维化发生发展的一系列反应,削减细胞外的合成与沉积,可能是大黄NFAE6虫丸抗肝纤维化的重要途径
10、之一。 5 参考文献 1Yoshiji H,Yoshii J,Ikenaka Y.et al.Inhibition of reninangiotensin system attenuates liver enzymealtered preneoplastic lesions and fibrosis development in ratsJ.J Hepatol,2002,37:22-30. 2潘志恒,程木华,李林,等.大黄NFAE6虫丸抗肝纤维化作用的临床探讨J.中国中西医结合消化杂志,2003,11(4):212-214. 3Sakaida I,Hironaka K,Terai S,et al.Gadoliniumchloride reverses dimethylnit rosamine (DMN)2inducedrat liver fibrosis with increased mat rix metallo2proteinases (MMPs) of Kupffer cellsJ.Life Sci,2003,72(8):943-959. 4谢红东,刘成海.血管惊慌素与肝纤维化探讨进展J.临床肝胆病杂志,2008,24(3):234-236. 收稿日期 2009-06-04