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1、第二章 实验室生物安全防护及菌种保存技术01020304通过学习希望能回答的问题实验室生物安全水平分级?如何预防实验室相关感染的发生?如何处理实验室暴露?常用的菌种保存方法有哪些？一微生物实验室安全防护实验室生物安全防护实验室生物安全防护：采用合理的：采用合理的实验室建筑设施、实验室建筑设施、安全的防护设备安全的防护设备、规范的、规范的微生物操作技术微生物操作技术防止相关人员、防止相关人员、环境暴露于实验室的感染性微生物和毒素。环境暴露于实验室的感染性微生物和毒素。研究显示研究显示,导致实验室相关感染最常见的原因除少导致实验室相关感染最常见的原因除少数为明确的如被锐器刺伤、感染的实验动物咬伤等
2、数为明确的如被锐器刺伤、感染的实验动物咬伤等,此此外大多数情况下均为不明原因导致的实验室感染外大多数情况下均为不明原因导致的实验室感染,此类此类感染大多由生物因子气溶胶所引起。感染大多由生物因子气溶胶所引起。第一节第一节悬浮于气体介质中粒径一悬浮于气体介质中粒径一般为般为0.01-100m的固体、液的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态体微小粒子形成的胶溶状态颗粒。颗粒。气溶胶气溶胶(aerosol)引起实验室相引起实验室相关感染最常见关感染最常见的微生物的微生物细菌：伤寒沙门菌、结核分枝杆菌、布鲁菌属、Q热立克次体、鹦鹉热衣原体等。病毒：血液传播病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等。真菌：皮炎芽生菌、球孢
3、子菌等。在国内尤以布鲁菌属、结核分枝杆菌引起的实验室感染多见,其原因与微生物的危险等级及实验室的生物安全防护水平均有关。危险度1级危险度2级危险度3级危险度4级（无或极低的个体和群体危险）不太可能引起人或动物致病的微生物。病原体能够对人或动物致病，但不严重。实验室暴露可能会引起较严重感染，预防和治疗措施有效，传播危险有限。（个体危险高，群体危险低）病原体通常能引起人或动物的严重疾病，但一般不会发生感染个体向其他个体的传播，并且对感染有有效的预防和治疗措施。病原体通常能引起人或动物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。（个体危险中等，群体危险低）
4、（个体和群体的危险均高）(一）生物因子危险度等级细菌中危险度3级的微生物微生物生物安全水平危险等级结核分枝杆菌33（已有疫苗）羊流产布氏杆菌33鼻疽伯克霍尔德菌33类鼻疽伯克霍尔德菌2/33立克次体33鼠疫耶尔森菌2（有疫苗）、3（二）实验室生物安全防护水平（WHO)根据所操作生物因子的危害程度和采取的防护措施以及实验室设计建筑构造、防护设施设备以及操作程序,将实验室生物安全防护水平（biosafety level,BSL）分为四级。分为：一级生物安全防护水平(BSL1)二级生物安全防护水平(BSL2)三级生物安全防护水平(BSL3)四级生物安全防护水平(BSL4)与微生物危险度等级相对应的安
5、全防护水平、操作和设施(WHO)危险度等 级生物安全水平实验室类型实验室操作规范安全设备1级基础实验室一级生物安全水平基础的教学、研究GMT（常规的微生物操作技术规范）不需要，开放实验台2级基础实验室二级生物安全水平初级卫生服务；诊断、研究GMT，加防护服、生物危害标志开放实验台，此外需BSC 用于防护可能生成的气溶胶3级防护实验室三级生物安全水平特殊的诊断、研究在二级生物安全防护水平上增加特殊防护服、进入制度、定向气流BSC 和或其他所有实验室工作所需要的基本设备4级最高防护实验室四级生物安全水平危险病原体研究在三级生物安全防护水平上增加气锁入口、出口淋浴、污染物品的特殊处理级BSC 或级B
6、SC并穿着正压服、双开门高压灭菌器（穿过墙体）、经过滤的空气二实验室生物安全防护一级防护(隔离)二级防护(屏障)（一）生物安全基本设备（二）个体防护装置实验室的特殊设计和建设要求01OPTION02OPTION03OPTION生物安全柜高压灭菌器紧急喷淋及洗眼装置（一）生物安全基本设备生物安全基本设备是确保实验室工作人员不与致病微生物及其毒素直接接触的一级屏障。121.生物安全柜（biosafety cabinet，BSC）是处理危险性微生物时所用的箱型空气净化安全装置。实验室应按要求分别配备、级生物安全柜。所有可能使致病微生物及其毒素溅出或产生气溶胶的操作，除实际上不可实施外，都必须在生物安
7、全柜内进行。不得用超净工作台代替生物安全柜。生物安全柜根据入口气流风速、排气方式和循环方式及生物安全防护水平的差异,分为三级：级级级可保护工作人员和环境而不保护样品（可用于操作危险度1、2、3级病原体）二级生物安全柜是目前应用最为广泛的柜型。可提供对工作人员、环境和样本的保护，可分为4个级别:A1型、A2型、B1型和B2型,可用于操作危险度2级和3级微生物,穿正压防护服时可处理危险度4级微生物全封闭的、气密结构的通风，通过与柜体联结的橡胶手套进行操作；柜内保持至少120Pa的负压；送风通过HEPA抽入内；外排的气流经过双层HEPA过滤或经HEPA后再经燃烧处理柜，可处理危险度1、2、3、4级微
8、生物。3.紧急喷淋及洗眼装置2.高压蒸汽灭菌器基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的,具有高效的灭菌功能。临床微生物实验室产生的废弃的培养皿（基）、血培养瓶、临床样本等医疗垃圾均需进行高压灭菌,使其无害化后方可运出实验室,从而保证实验室工作人员及环境安全。一般安装在使用苛性碱和腐蚀性化学品附近（30米内）的地方,可对眼睛和身体进行紧急冲洗或者淋浴,主要是避免感染性物质或化学物质对人体造成进一步伤害。要求：实验室任何个人必须加强个人防护。装备应符合国家有关标准的要求。在危害评估的基础上，按不同级别的防护要求选择适当的个人防护装备。实验室对个人防护装备的选择、使用、维护应有明确的书面规定
9、、程序和使用指导。(二）个人防护装备（三）、安全操作规范、暴露和废弃物的处理01微生物实验室安全操作（1）样本的微生物操作：样本采集、运送、接收及接种,均应严格按照相关的标准操作规程进行。（2）微生物实验室的基本安全操作:所有样本、培养物和废弃物均应视为含有传染性生物因子而予以安全方式进行处理和处置。02实验室暴露的处理（1）刺伤、切割伤或擦伤；美国发生美国发生HIVHIV职业暴露后艾滋病病毒感染职业暴露后艾滋病病毒感染者，其中：者，其中：最主要的职业是护士和实验室技术员；除少数实验室人员是暴露于艾滋病病毒培养以外，其余全部是由于污染血液或体液所致。刺伤皮肤紧急局部处理No.1用肥皂液和流动水
10、冲洗污染的皮肤No.2在伤口旁端轻轻挤压，尽可能挤出损伤处的血液No.3再用肥皂液和流动水进行冲洗No.4用75%酒精或碘伏消毒No.5包扎伤口02实验室暴露的处理（2）潜在感染性物质食入；（3）潜在危害性气溶胶释放（快速离开，1h后进入处理）；（4）潜在感染性物质溢出（消毒液处理30min)；（5）离心管破裂(停止离心，30min后处理）。03感染性废弃物处理废弃物处理首要原则是所有感染性材料必须在实验室内通过高压灭菌或消毒等方式清除污染后运出实验室。第二节菌种保存技术及管理一、菌种的分类01标准菌株主要用于临床微生物实验室仪器、培养基、染色液、试剂和诊断血清的室内质量控制,也可作为实验室教
11、学和培训的示教材料。实验室必须长期保存一定种类和数量的标准菌株,以满足工作需要。从临床各类样本中分离的菌株,根据需要可做短期或长期保存,以供后续分析和研究。02临床菌株二、菌种保存方法（一）定期移植保存法培养基直接保存法快速冷冻保存法载体保存法真空冷冻干燥保存法（二）防止菌种变异的措施01020304OPTION严格执行无菌操作技术,避免污染；控制传代次数,尽可能减少传代和转种次数。可根据需要决定保留菌种的数量,如经常用于生化反应和药敏质控的标准菌种,在购买后初次转种时应大量留存；用典型菌落传代并采用合适的培养基；选择合理有效的菌种保存方法,妥善保存菌种,最好采用真空冷冻干燥法。（三）菌种保存注意事项01040302避免用含有可发酵性糖的培养基、选择性培养基和药敏试验平板保存菌种,尽量使用对菌株生长无刺激的营养琼脂培养基;避免培养菌干枯,所有试管要保持良好的密封性;淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌等对温度变化敏感的细菌,不能贮存于冰箱,但可用快速冷冻干燥法长期保存;用于抗菌药物敏感试验的标准菌株,由保存状态取出后,不能连续使用1周以上,应定期传代,但一般不超过6次,必要时进行更换。010203三、菌种保护管理正确安全规范THANK YOU THANK YOU FOR YOUR FOR YOUR ATTENTION!ATTENTION!