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1、植物生物物技术的的概念：植物生生物技术术: 指对对植物品品质和性性状进行行改造的的生物技技术植物生物物技术核核心技术术及其在在农业生生产中的的应用创造新材材料培育育新品种种开发功功能食品品快速繁殖殖稀有材材料材料料的指纹纹分析新新基因挖挖掘、定定位、辅辅助育种种等第一章 植物组织织培养的的应用： （1）快快速繁殖殖和规模模化生产产 （2）培培养无病病毒植株株 （3）培培育转基基因植物物 （4）突突变体筛筛选 （5）制制成人工工种子 灭菌的方方法和原原理 （1）灭灭菌方法法 物理灭菌菌：高温温高压灭灭菌 干热灭灭菌 射线线照射灭灭菌 过滤滤灭菌 化学灭菌菌：熏蒸蒸灭菌 消毒毒液灭菌菌 （2）灭灭
2、菌原理理 （a）高高温高压压灭菌 原理理：将待待灭菌的的物品放放在一个个密封的的高压高高温灭菌菌锅内，在在1211高温和和每平方方厘米11个大气气压下，一一般持续续1520 minn，就可可杀死一一切微生生物的营营养体及及其孢子子，适于于器皿、工工具、衣衣物和培培养基灭灭菌。 （2）过过滤灭菌菌法 原理理：将带带菌的液液体或气气体通过过孔径小小于0.45m微孔孔滤器装装置， 使液、气气体通过过滤膜流流入无孔孔瓶中。 培养基的的种类和和特点 目前发展展出的培培养基有有几十种种，但常常用的有有MS、BB5、wwhitte、NN6、SSH、KKM8PP等。 （1）MMS培养养基 19622年Muur
3、asshigge和SSkooog为培培养烟草草组织时时设计的的，是目目前应用用最广泛泛的一种种培养基基。 无机盐浓浓度高，养养分平衡衡，尤其其是铵盐盐和硝酸酸盐的含含量很大大 它不适合合生长缓缓慢、对对无机盐盐浓度要要求比较较低的植植物，尤尤其不适适合铵盐盐过高易易发生毒毒害的植植物。 与MS培培养基基基本成分分较为接接近的还还有LSS、RMM培养基基，LSS培养基基去掉了了甘氨酸酸、盐酸酸吡哆醇醇和烟酸酸；RMM培养基基把硝酸酸铵的含含量提高高到49950mmg/LL，磷酸酸二氢钾钾提高到到5100 mgg/L。 （2）WWhitte培养养基 19433年由WWhitte设计计的，11963
4、3年做了了改良。 无机盐浓浓度较低低 适于生根根培养 （3）NN6培养养基 19744年，朱朱至清等等学者为为水稻等等禾谷类类作物花花药培养养而设计计的 KNO33和（NNH4）22SO44含量高高，不含含钼 适于花粉粉和花药药培养。 （4）BB5培养养基 19688年由CCambborhh等设计计的 含有较低低的铵盐盐，较高高的硝酸酸盐和盐盐酸硫胺胺素。铵铵盐可能能对不少少培养物物的生长长有抑制制作用 适合于某某些双子子叶植物物特别是是木本植植物的生生长。 （5）SSH培养养基 19722年由SScheenkHHid和和Hiddebrranddt设计计的。 它的主要要特点与与B5相相似，不不
5、用（NNH4）22SO44，而改改用NHH4H22PO44，是无无机盐浓浓度较高高的培养养基 在不少单单子叶和和双子叶叶植物上上使用，效效果很好好。 KM8PP Kao andd Miichaayluuk 119755 有机成分分较复杂杂，它包包括了所所有的单单糖和维维生素，呼呼吸代谢谢中的主主要有机机酸。 主要用于于原生质质体培养养 培养基的的成分及及配制方方法培养基中中包括植植物生长长必需的的15种种营养元元素和某某些生理理活性物物质，可可概括为为四大类类：1、无机机营养物物:植物物生长发发育中非非常重要要u 镁（Mgg）是叶叶绿素分分子的一一部分u 钙（Caa）是细细胞壁的的组分之之一u
6、 氮（N）是是各种氨氨基酸、维维生素、蛋蛋白质和和核酸的的重要组组成部分分u 此外，铁铁（Fee）、锌锌（ ZZn）和和钼（MMo）等等是某些些酶的组组成部分分。植物除了了碳（CC）、氢氢（H）和和氧（OO）外，已已知还有有12种种元素对对于植物物的生长长是必需需的，它它们是氮氮(N)、磷（PP）、钾钾（K）、硫硫（S）、钙钙(Caa)、镁镁(Mgg)、铁铁(Fee)、锰锰（Mnn）、铜铜（Cuu）、锌锌(Znn)、硼硼（B）和和铝（AAl）。前6种元元素需要要的数量量较大，称称之为大大量元素素或主要要元素后6种元元素需要要的数量量较小，称称为微量量元素或或次要元元素按照国际际植物生生理协会会
7、的建议议，植物物所需要要的浓度度大于00.5mmmoll/L的的元素为为大量元元素，小小于0.5mmmol/L的元元素为微微量元素素2、有机机营养成成分主要包包括碳源源（糖类类）和维维生素类类 最常用的的碳源是是蔗糖和和葡萄糖糖 使用浓度度为2%5% 作为植物物生长发发育所需需的营养养物质 调节培养养基中的的渗透压压 维生素：u 硫胺素（维维生素BB1）一一般认为为是一种种必需的的成分u 吡哆醇（维维生素BB6），烟烟酸（维维生素BB3），泛泛酸钙（维维生素BB5）和和肌醇也也都能显显著地改改善培养养的植物物组织生生长状况况3、植物物生长调调节物质质(激素素）主要有五五大天然然激素（和和人工合
8、合成的生生长调节节物质生生长素）：植物五大大天然激激素的合合成部位位吲哚乙酸酸 分生生组织、种种子细胞分裂裂素 根尖赤霉素 生生长的种种子脱落酸、乙乙烯 成熟熟、衰老老和环境境条件4、其他他附加物物 不是植物物生长所所必需的的，但对对细胞生生长有益益（1）凝凝固剂 琼脂(aagarr)是固固体培养养基的必必要成分分，琼脂脂是一种种由海藻藻中提取取的高分分子碳水水化合物物，本身身并不提提供任何何营养 琼脂能溶溶解在热热水中，成成为溶胶胶，冷却却至400即凝固固为固体体状凝胶胶。（2）抗抗生素 抗生物质质(anntibbiottic)，包括括青霉素素、链霉霉素、庆庆大霉素素等，用用量在5520mm
9、g/LL之间 添加抗生生物质可可防止菌菌类污染染，减少少培养中中材料的的损失，尤尤其是快快速繁殖殖中，常常因污染染而丢弃弃成百上上千瓶的的培养物物，采用用适当的的抗生素素便可节节约人力力、物力力和时间间 （3）活活性炭 活性炭为为木炭粉粉碎经加加工形成成的粉沫沫结构，它它结构疏疏松，孔孔隙大，吸吸水力强强，有很很强的吸吸附作用用 通常使用用浓度为为0.55l0ggL 活性炭（aactiive carrbonn）可以以降低组组织培养养物的有有害代谢谢物浓度度，对细细胞生长长有利培养基的的制备1、母液液的配制制 配制制母液有有两个好好处: 可减少少每次配配制称量量药品的的麻烦 减少极极微量药药品在
10、每每次称量量时造成成的误差差（1）大大量元素素母液: 可配成110倍母母液,用用时每配配10000mll培养基基取1000mll母液（2）微微量元素素母液 因含量低低，一般般配成1100倍倍甚至110000倍，每每配10000mml培养养基取110mll或1mml（3）铁铁盐母液液 必须单独独配制，若若与其它它元素混混合易造造成沉淀淀（4）有有机化合合物母液液 主要是维维生素和和氨基酸酸类物质质，这类类物质不不能配成成混合母母液，一一定要分分别配成成单独的的母液，浓浓度为每每毫升含含0.11,1,10mmg,使使用时根根据需要要量取（5）激激素 每种激素素必须单单独配成成母液，其其浓度为为0.
11、11, 0.55或1.0mgg/mll, 多多数激素素难溶于于水，2、培养养基的配配制（1）分分别按配配方逐个个加入各各种贮备备液，包包括生长长调节物物质和其其他的特特殊补加加物。（2）充充分混合合之后，用用1mool/LL Naa0H和和1mool/LL HCCl调节节培养基基的pHH。一般般来说，植植物组织织培养适适合的ppH值为为5.88，当ppH高于于6时，培培养基将将会变硬硬，低于于5时，琼琼脂就不不能很好好地凝固固。(3)称称出规定定数量的的蔗糖或或葡萄糖糖，加水水直到培培养基最最终容积积 。（4）加加入一定定数量的的凝固剂剂（琼脂脂或非态态胶），加加热融化化（5）把把培养基基分装
12、到到所选用用的培养养容器中中，每个个 2251500mm的的试管约约装培养养基155m1；每个1100mml三角角瓶约装装50mml。（6）用用封口膜膜封口（7）灭灭菌（高高压灭菌菌）对于不不能用高高压灭菌菌的药品品来讲，经经过滤灭灭菌后的的药液等等到高压压灭菌的的培养基基冷却到到大约660时，在在超净工工作台加加入到培培养基中中，摇匀匀。第二章看护培养养：将发发育正常常的胚的的胚乳作作为看护护组织，进进行胚乳乳发育障障碍胚的的离体培培养。胚培养的的意义1、克服服远缘杂杂交不亲亲和性和和杂种不不育性，获获得种间间或属间间杂种2.获得得单倍体体植株 3.克服服种子休休眠，提提早结实实 4.缩短短
13、育种周周期，提提高育种种效率5、种子子生活力力的快速速测定6.稀有有植物的的繁殖(使种子子无生活活力或胚胚发育不不全的植植物获得得后代)离体胚培培养时，胚胚发育几几种可能能途径（1）胚胚胎发育育途径：幼胚经经过心形形期，再再发育到到鱼雷形形期，进进而进入入子叶期期，最后后萌发成成苗。这这是幼胚胚培养成成功的途途径。（2）早早熟萌发发途径：幼胚从从心形期期发育到到鱼雷形形期后，不不经过子子叶期直直接发育育成苗，即即跳过某某一个发发育阶段段，这样样的幼苗苗往往很很弱小，组组织不健健全，且且难于培培养成正正常的植植株。（3）产产生愈伤伤组织：幼胚培培养过程程中细胞胞脱分化化产生愈愈伤组织织。通过过幼
14、胚培培养产生生的愈伤伤组织，经经植株再再生同样样可得到到远缘杂杂种。据据报道，由由胚培养养产生的的愈伤组组织较其其它外植植体容易易得到再再生植株株。（4）停停止生长长或幼胚胚死亡。非非常小的的幼胚进进行培养养时，接接种后常常遇到细细胞生长长停滞，如如不采取取一些拯拯救措施施，幼胚胚细胞即即死亡。第三章愈伤组织织：是指指将植物物上的某某个部分分切下，形形成外植植体，接接种到适适宜的培培养基上上培养，其其外植体体组织的的增生细细胞产生生的一团团不定形形的疏松松排列的的薄壁组组织脱分化：使已分分化的体体细胞，在在人工诱诱导的条条件下回回复到未未分化的的原始状状态并具具有细胞胞全能性性表达潜潜力的过过
15、程再分化：处于脱脱分化状状态的愈愈伤组织织，再度度分化成成其他类类型的细细胞、组组织、器器官，甚甚至最终终再生成成完整植植株的过过程细胞全能能性：所所谓细胞胞的全能能性，就是植植物的每每个细胞胞都具有有该植物物的全部部遗传信信息和发发育成完完整植株株的能力力。从理论上上讲，生生物体的的每一个个活细胞胞都应该该具有全全能性。差异：（11） 受受精卵的的全能性性最高 （2） 受精卵卵分化后后的细胞胞中，体体细胞的的全能性性比生殖殖细胞的的低。体细胞胚胚胎发生生：体细胞胞胚胎发发生：在在离体培培养条件件下，植植物体细细胞形成成胚性细细胞，然然后经过过一系列列形态学学及生物物化学的的变化形形成类似似合
16、子胚胚结构的的过程。愈伤组织织诱导的的形成过过程（三三个时期期）植物愈伤伤组织诱诱导(ccalllus indduciing)：使那些些已分化化的体细细胞包括括离体的的器官、组组织和细细胞在人人工培养养基上，经经多次细细胞分裂裂而失去去原来的的分化状状态，形形成无结结构的愈愈伤组织织或细胞胞团的过过程大致经历历起动期期，分裂裂期和形形成期33个阶段段（1）起起动期(诱导期期)，外外植体已已分化的的活细胞胞在外源源激素的的作用下下，通过过脱分化化起动而而进入分分裂状态态,开始始形成愈愈伤组织织。(2) 分裂期期: 外植体切切口边缘缘开始膨膨大，外外层细胞胞通过一一分为二二的方式式进行分分裂，从从
17、而形成成一团具具有分生生组织状状态细胞胞的过程程。(3) 形成期期: 外外植体的的细胞经经过诱导导，分裂裂形成了了具有无无序结构构的愈伤伤组织时时期植株再生生的两个个途径及及其比较较（这里里不太确确定，你你们可以以看看课课件）植株再生生的两种种途径：器官发发生(oorgaanoggeneesiss)和体体细胞胚胚胎发生生(soomattic embbryoogennesiis) 体细胞胚胚胎发生生：在离离体培养养条件下下，植物物体细胞胞形成胚胚性细胞胞，然后后经过一一系列形形态学及及生物化化学的变变化形成成类似合合子胚结结构的过过程。体细胞胚胚是一个个二极结结构，不不物理地地附着于于原组织织，
18、每一一个体细细胞胚称称为胚状状体，它它可以同同合子胚胚一样发发育成植植株。器官发生生：是指指培养条条件下的的组织或或细胞团团（愈伤伤组织）分分化形成成不定根根（addvenntittiouus rrootts）、不不定芽（aadveentiitioous shoootss）等器器官的过过程 。 两种形态态发生的的结构特特点胚状体途途径形成成的植株株细胞内出出现方向向相反的的两极分分化，具具有根端端和芽端端两个分分生中心心不定胚维维管组织织与外植植体维管管组织不不相连具有典型型的胚胎胎形态发发生过程程形成的的幼苗具具有子叶叶胚状体发发育的苗苗，根和和芽齐全全器官途径径形成的的植株单向极性性，单个
19、个分生中中心直接接分化为为器官不定芽和和不定根根与愈伤伤组织的的维管相相连,无无胚胎形形态不定芽的的苗无子子叶先长芽后后长根，或或先长根根后长芽芽影响器官官发生的的因素（1）化化学因素素 早期烟草草组织的的研究，器器官发生生的表达达可被外外源化学学物质控控制 高浓度的的生长素素和低浓浓度的分分裂素可可以促使使细胞连连续繁殖殖无组组织的生生长 高浓度的的分裂素素能引起起茎-芽芽（shhoott-buud）形形成 auxiion/cyttokiininn之比值值的变化化成为特特定的器器官、根根或芽分分化的一一个参数数 生长素促促进根分分化，分分裂素促促进芽分分化 生长素与与根形成成有关，同同时对于
20、于愈伤组组织的保保持也是是必须的的 在促进芽芽的分化化中，BBAP （苄氨氨基嘌呤呤）是最最有效的的（2）物物理因素素 光： 很多光照照条件下下，一些些植物均均能进行行器官发发生，说说明光周周期并不不是非常常重要的的因子 有的植物物在光、暗暗交替条条件下才才能形成成芽，而而在连续续光照下下则不能能 尽管如此此，多数数植物需需要一个个稳定的的光周期期，多数数培养条条件是114-116h光光照，88-100h黑暗暗 温度：不不同植物物不一样样，需要要摸索，如如烟草和和棉花就就不一样样影响胚状状体发生生和发育育的因素素1影响胚胚状体发发生和发发育的外外部条件件.植物物激素a.生长长素类物物质胡萝卜胚
21、胚状体的的发生可可分为两两个阶段段外植体细细胞的脱脱分化、愈愈伤组织织的诱导导、胚性性细胞或或细胞团团的形成成，培养养基必须须含有生生长素类类物质，主主要是22，4-D胚状体的的形成和和发育，必必须在降降低2，44-D浓浓度或完完全去除除2，44-D的的培养基基上才能能进行其它生长长素如IIAA、NNAA、NNOA、22，4，55-T等等的作用用与2，44-D大大致相同同，但诱诱导的效效果和对对胚状体体形成的的抑制作作用不完完全一致致绝大多数数植物均均属于这这一模式式，但不不同的植植物在含含生长素素时胚状状体发育育时期不不一样，有有的只能能产生胚胚性愈伤伤，有的的可达圆圆球胚，有有的可达达鱼雷
22、胚胚，个别别植物可可发育到到成熟胚胚这些不同同发育程程度的胚胚状体都都必须在在转移到到无生长长素或生生长素含含量很低低的培养养基上以以后才能能继续发发育和成成株b.细胞胞分裂素素类物质质 不仅仅没有诱诱导的作作用(单单独使用用不能诱诱导愈伤伤),而而且对已已完成诱诱导的愈愈伤组织织中胚状状体的发发生还有有抑制作作用。但但在除去去，胚状状体发生生能力还还可能部部分地恢恢复。c.其它它激素 一般般ABAA、GAA抑制胚胚状体发发育，但但有人认认为，AABA对对柑桔的的胚状体体发生有有明显的的促进作作用含氮化化合物 NHH4+与与NO33-的作作用不同同 NHH4+/NO33-的比比例 氨基基酸、酰
23、酰胺等有有机氮其它外外部因素素离子浓度度、逆境境胁迫、悬悬浮培养养等2影响胚胚状体发发生和发发育的内内部因素素 植株株基因型型的影响响培养个体体的遗传传基础决决定了离离体培养养的反应应能力不同种的的植物甚甚至同种种植物的的不同品品种(或或不同地地理来源源)个体体之间，其其个体基基因型存存在着差差异，这这就决定定了不同同的体细细胞胚胎胎发生能能力生理上上的隔离离 细胞与其其周围组组织之间间生理上上的隔离离是其进进行胚状状体发生生的先决决条件。外植体体的年龄龄(生理理状态)与来源源少数植物物如胡萝萝卜，几几乎所有有的器官官都可诱诱导 产产生胚状状体大多数植植物，在在目前只只有一定定发育时时期的某某
24、些器官官可产生生胚状体体一般以幼幼嫰组织织作外植植体较易易诱导胚胚状体培养时时间和细细胞倍性性变化的的影响一般由初初分离或或诱导的的或仅经经过短时时期培养养的愈伤伤组织，最最易产生生胚状体体随着培养养时间的的延长，形形成胚状状体的能能力下降降以至完完全消失失培养细胞胞倍性的的变化可可能对胚胚状体的的形成有有一定影影响内源激激素水平平的变化化外源生生长素对对体细胞胞胚产生生和发育育的调控控是通过过调节内内源激素素的合成成、代谢谢、极性性运输和和平衡而而起作用用的第四章体细胞无无性系变变异：体体细胞培培养的任任何阶段段所产生生的变异异（细胞胞，原生生质体，愈愈伤组织织，再生生植株等等）统称称为体细
25、细胞无性性系变异异体细胞无无性系变变异的特特点1、变异异广泛包括数数量性状状、质量量性状、染染色体数数目和结结构变异异，DNNA扩增增和减少少，生化化特性变变化等，以以数量性性状变异异为主 2、变异异频率高高棉花体体细胞培培养获得得的每一一个再生生植株几几乎都存存在一定定程度的的变异。3、后代代稳定快快一般无无性系二二代就可可获得稳稳定株系系，这是是优良性性状选择择的关键键时期，从从而大大大地缩短短育种年年限4、潜在在的隐性性性状和和显性性性状的活活化在无性性系变异异后代不不但出现现显性性性状的改改变，常常出现一一些供体体植株所所没有的的隐性性性状的变变异如雄雄性不育育、矮杆杆等5、起点点高，
26、效效率高选用现现行最好好的品种种（系），作作为起始始材料，一一旦选育育出就能能超过现现有的品品种，不不需要多多年的适适应性试试验体细胞无无性系变变异的应应用（这这是在育育种中的的应用）一、直接接利用体体细胞变变异材料料二、利用用诱变技技术或进进行定向向选择获获得体细细胞变异异材料三、体细细胞突变变体的应应用当前在农农业上，体体细胞突突变体筛筛选技术术研究主主要集中中在抗病病、 抗抗盐、抗抗除草剂剂、抗低低温、高高温等逆逆境胁迫迫的突变变体筛选选。另外，在在提高作作物营养养物质（如如蛋白质质、赖氨氨酸等）改改变作物物品质方方面也取取得了一一定进展展。体细胞无无性系变变异育种种应用中中存在一一些不
27、足足: 1、产生生的变异异多，变变异类型型复杂，并并非所有有的变异异都可以以稳定遗遗传，离离体选择择只对那那些在离离体培养养和移栽栽到大田田环境都都表现的的表型变变异有效效，即能能在后代代稳定表表达和遗遗传； 2、变异异方向难难以控制制，难以以预测，负负向变异异多，或或有一个个性状表表现优良良，但其其它方面面则呈现现负向，变变异并非非都是新新的变异异； 3、筛选选出的突突变性状状随着代代数的增增加，存存在逐渐渐丧失抗抗性的趋趋势；同同时一些些抗性突突变体的的筛选与与丰产性性之间存存在一定定的矛盾盾；4、植物物细胞群群体和微微生物相相比，除除原生质质体外，难难以像微微生物那那样获得得完全是是单细
28、胞胞的群体体；在离离体培养养时增殖殖速率远远低于微微生物，且且多次继继代后特特别是经经过相应应因子筛筛选，很很快丧失失分化能能力； 5、无性性系变异异选择并并非对所所有的作作物都有有效，更更适应于于营养繁繁殖作物物。第五章原生质体体：指采采用机械械或酶解解法去掉掉细胞壁壁的裸露露细胞 由于没有有细胞壁壁，原生生质体为为作物遗遗传改良良和植物物学研究究提供了了极为有有利的试试验材料料。原生质体体分离方方法原生质体体分离的的最基本本原则是是保证原原生质体体不受伤伤害及不不损害它它的再生生能力一、分离离方法1、机械械法分离离质壁分分离细胞胞 缺点点：产量量极低；应用的的材料受受限制；操作极极费力2、
29、酶法法分离 酶法可在在短时间间内获得得大量原原生质体体 分为直接接法和顺顺序法两两种 缺点是：不纯的的酶制剂剂所含杂杂质对原原生质体体可能有有不同程程度的毒毒害作用用原生质体体融合的的意义（应应用找不不到） 物种间生生殖隔离离阻碍了了物种之之间的基基因交流流,从而而给作物物育种带带来很大大的局限限性 原生质体体融合技技术是实实现基因因重组的的一条新新途径，目目前利用用细胞融融合已从从很多作作物种、属属间，甚甚至科间间获得体体细胞杂杂种，创创造了一一些自然然界不存存在的植植物类型型（1） 克服有有性杂交交不亲和和和生殖殖障碍 一些植物物的野生生材料具具有很好好的抗性性，但与与栽培品品种之间间存在
30、有有性杂交交不亲和和现象，难难以通过过常规技技术实现现有益抗抗性的转转移。原原生质体体融合不不涉及到到雌雄性性配子，从从而可以以克服生生殖障碍碍 番茄薯或或薯番茄茄尽管没没有实际际价值，但但其设想想还是具具有很深深远的意意义 （22 ）转转移有利利的农艺艺性状，创创造新的的种质材材料 作物栽培培品种常常常缺乏乏某些抗抗性性状状，在栽栽培中处处于不利利地位 野生种中中具有很很多优良良的抗性性，通过过原生质质体融合合可以将将野生种种的抗性性转移进进栽培种种中（3） 转移胞胞质基因因，为研研究体细细胞遗传传提供途途径和材材料 植物的细细胞质控控制着很很多优良良的性状状，如线线粒体控控制胞质质雄性不不
31、育，叶叶绿体控控制的抗抗除草剂剂特性 有性杂交交的胞质质成分主主要为母母系遗传传，不可可能实现现杂交亲亲本的胞胞质杂交交。但原原生质体体融合则则可以达达到此目目的第六章 单倍体在在遗传和和育种中中的应用用价值 一、在植植物育种种中使后后代迅速速纯合 二、提高高选择效效率 三、排除除杂种优优势对后后代选择择的干扰扰 四、遗传传研究的的良好实实验材料料体系 五、突变变体的筛筛选 六、消除除致死基基因 七、选育育新型自自交系 八、遗传传转化的的受体材材料 培养条件件下小孢孢子的发发育途径径 1）营养养细胞发发育途径径 2）生生殖细胞胞发育途途径 3）营营养细胞胞和生殖殖细胞并并进发育育途径 4）花花
32、粉均等等分裂途途径 小孢子培培养与花花药培养养的优势势体现在在哪些方方面 小孢子培培养在某某些方面面比花药药培养有有一定优优势 花药培养养有时会会由于花花药中的的有害物物质而不不能诱导导小孢子子启动第第一次分分裂，小小孢子培培养则不不会 花粉已是是单倍体体细胞，诱诱发都是是单倍体体植株或或双单倍倍体，不不含有因因药壁、花花丝、药药隔等体体细胞组组织的干干扰而形形成的体体细胞植植株 获得的材材料总是是纯合的的，不管管它是二二倍体还还是三倍倍体 由于花粉粉能均匀匀地接触触化学的的和物理理的诱变变因素，花花粉是研研究吸收收、转化化和诱变变的理想想材料 可观察到到由单个个细胞开开始雄核核发育的的全过程
33、程，是一一个很好好的遗传传与发育育研究的的材料体体系 小孢子培培养的应应用第七章 II型限限制性内内切酶的的特点及及剪切方方式 能识别专专一的核核苷酸顺顺序，并并在该顺顺序内的的固定位位置上切切割双链链 识别和切切割的核核苷酸都都是专一一的，是是DNAA重组技技术中最最常用的的工具酶酶之一 识别的专专一核苷苷酸顺序序最常见见的是44个或66个核苷苷酸，少少数也有有识别55个核苷苷酸以及及7个、88个、99个、110个和和11个个核苷酸酸的 识别顺序序是一个个回文对对称顺序序，即有有一个中中心对称称轴，从从这个轴轴朝二个个方向“读”都完全全相同 限制性内内切酶的的剪切方方式 平头末端端(bllu
34、ntt ennds)： 在在同一位位置上切切割双链链，产生生平头末末端 粘性末端端(sttickky eendss)：交交错切割割，结果果形成两两条单链链末端，这这种末端端的核苷苷酸顺序序是互补补的，可可形成氢氢键 主要DNNA聚合合酶的作作用 常用的DDNA聚聚合酶： 大肠杆菌菌DNAA聚合酶酶、大肠肠杆菌DDNA聚聚合酶的Kllenoow大片片断酶 Taqq DNNA聚合合酶、T7DDNA聚聚合酶、Taqq DNNA聚合合酶（PPCR反反应的专专用酶）、RNA反转录酶 末端转移移酶、碱性磷磷酸化酶酶 1、大肠肠杆菌DDNA聚聚合酶 DNA聚聚合酶的酶活活性： 11. 53的聚合合酶活性性；
35、 22. 5 3的外切切酶活性性； 33. 3 5的外切切酶活性性（较低低）。 2. KKlennow片片断与DDNA末末端标记记 Klennow片片断：是是由大肠肠杆菌DDNA聚聚合酶II经枯草草杆菌蛋蛋白酶的的处理之之后，产产生出来来的分子子量为776KDDa的大大片断分分子 具有53的聚合合酶活性性和35 的外外切酶活活性 失去了全全酶的553外切酶酶活性 3、T44 DNNA聚合合酶和取取代合成成法标记记DNAA片断 具有53的聚合合酶活性性和35 的外外切酶活活性 在没有ddNTPP，3外切酶酶活性便便是T44 DNNA聚合合酶的独独特功能能 作用于双双链DNNA片断断，并按按35的
36、方向向从3-OHH末端开开始降解解DNAA。如果果反应物物中存在在一种ddNTPP时，它它的水解解作用进进行到暴暴露出同同反应物物中唯一一的dNNTP互互补的核核苷酸时时就会停停止 在反应过过程中，通通过T44 DNNA聚合合作用，反反应物中中的dNNTP逐逐渐地取取代了被被外切活活性删除除掉的DDNA片片断上原原有的核核苷酸，因因此叫做做取代合合成 4、T77具有553的聚合合酶活性性和很高高的单链链及双链链的35核酸外外切酶活活性 DNAA聚合酶酶 5、 TTaq DNAA聚合酶酶（PCCR反应应的专用用酶） Taq DNAA聚合酶酶是从极极度嗜热热的嗜热热水生菌菌Theermuus aa
37、quaaticcus中中纯化得得到的一一种耐热热的依赖赖于DNNA的DDNA聚聚合酶 Taq DNAA聚合酶酶能够在在94高温环环境中存存活3小小时以上上，具有有DNAA聚合酶酶活性和和5-3外切酶酶活性 Taq DNAA聚合酶酶的最佳佳聚合温温度在772-800之间，在在60时它的的聚合活活性不到到最佳活活性的11/2，在在复性的的条件下下Taqq DNNA聚合合酶的活活性极低低 因此利用用Taqq DNNA聚合合酶的这这种反应应特点可可以有效效地进行行PCRR扩增反反应 Taq DNAA聚合酶酶是以DDNA的的双链为为模板通通过变性性、复性性和延伸伸3个不不同的过过程来达达到目的的片段指指
38、数式的的增长 6、反转转录酶 一类以RRNA为为模板来来指导DDNA合合成的DDNA聚聚合酶，所所以又称称为依赖赖于RNNA的DDNA聚聚合酶 具有反转转录酶活活性和RRNasseH活活性 主要作用用是以mmRNAA为模板板合成ccDNAA 对5突突出末端端的DNNA片断断作末端端标记 7、末端端核苷酸酸转移酶酶（teermiinall trranssferrasee 催化5脱氧核核苷三磷磷酸进行行53方向的的聚合作作用，逐逐个地将将脱氧核核苷酸分分子加到到线性DDNA分分子的33-OHH末端 不需要模模板，可可以用含含有的33-OHH DNNA片段段为引物物，在33-OHH端加入入核苷酸酸达
39、几百百个 它作用的的底物可可以是具具有3-OHH末端的的单链DDNA,也可以以是具有有3-OHH突出末末端的双双链DNNA 8、碱性性磷酸酶酶 用于脱去去DNAA（RNNA）55末端的的磷酸根根，使55-P成成为5-OHH，该过过程称核核酸分子子的脱磷磷酸作用用 当需要55端同位位素标记记或为了了避免DDNA片片段自身身连接（或或环化）时时可进行行脱磷酸酸反应各种载体体的种类类、结构构、容量量及特点点1、质粒粒（pllasmmid）载载体 质粒是一一种独立立于染色色体外的的小分子子环状DDNA，可可自身复复制和表表达，有有的质粒粒还带有有可做为为选择性性标记的的抗药性性基因，经经过适当当改选后
40、后便可成成为良好好的载体体 克隆的质质粒载体体：允许许外源的的DNAA插入，储储存 基因表达达的质粒粒载体：允许外外源DNNA的插插入、储储存和表表达（1）质质粒的生生物学特特性质粒DDNA的的构型：SC型型 共价闭闭合环形形DNAA（ccccDNNA） OCC型 开环环DNAA（occDNAA） L 型 线性性DNAA（cDDNA）不同质质粒的分分子量大大小差异异相当显显著：11061088D 作为载载体的质质粒都含含有三种种共同的的组分： 复制制基因、选选择性记记号、多多克隆位位点质粒DDNA编编码着一一些重要要的非染染色体控控制的遗遗传性状状、抗性性特征、代代谢特征征、修饰饰寄主生生活方
41、式式的因子子等质粒DDNA的的接合性性 非接接合型:不能整整合到宿宿主的染染色体上上；不能能通过“接合” 而转转移质粒DDNA的的复制类类型： 低拷贝的的质粒（113）：严紧型型复制控控制的质质粒（接接合型） 高拷贝的的质粒（110660）：松弛型型复制控控制的质质粒（非非接合型型） 质粒的的不亲合合性 在同一个个大肠杆杆菌细胞胞，一般般不能同同时含有有两种不不同的质质粒。也也称为质质粒的不不相容性性 是指在没没有选择择压力的的情况下下，两种种亲源关关系密切切的不同同质粒，不不能够在在同一个个寄主细细胞系中中稳定地地共存的的现象 质粒的不不亲合性性分子基基础，主主要是由由于它们们在复制制功能之
42、之间的相相互干扰扰造成的的2、 噬菌体体载体l噬菌体体的生物物学特性性 l噬菌体体是感染染大肠杆杆菌的溶溶源性噬噬菌体，在在感染宿宿主后可可进入溶溶源状态态，也可可进入裂裂解循环环。 基因组为为长度约约为 550kbb 的双双链 DDNA 分子。 基因组 DNAA 呈线线性，其其两端的的 5末端带带有 112 个个碱基的的互补单单链（粘粘性末端端，coos位点点）。 进入宿主主细胞后后，其两两端互补补单链通通过碱基基配对形形成环状状 DNNA 分分子，并并随宿主主细胞复复制。 经过 440445miin 的的生长循循环，释释放出约约 1000 个个感染性性噬菌体体颗粒，或或者进入入溶源状状态（
43、llysoogennic staate），将将基因组组 DNNA 通通过位点点专一性性重组整整合到宿宿主的染染色体 DNAA 中，并并随宿主主的繁殖殖传给子子代细胞胞。 噬菌体体染色体体上基因因组成包包括几个个不同的的部分： 噬菌体体头部合合成基因因。包括括与之对对应的编编码A，WW，B，CC，D，EE，F等等7种不不同的蛋蛋白质基基因，主主要分布布在噬菌体体的左侧侧。 噬菌体体的尾部部合成基基因。包包括与之之相对应应的编码码Z，UU，V，GG，H，MMLK，II，J等等10种种不同的的蛋白质质基因。 与噬噬菌体的的整合、重重组等功功能有关关的基因因，例如如位于噬菌体体中部的的attt, ii
44、nt, gaam, redd, ssix基基因等。 与噬噬菌体的的表达调调控有关关的基因因。例如如CIIII，NN，CII，crro和CIII等位于于噬菌体体的右半半部分。 其它与与噬菌体体的合成成有关的的基因。包包括与DNAA合成有有关的OO，P，SS，R基基因等。3、粘粒粒(coosmiid) 由质粒和和噬菌体体的coos区构构建而成成，大小小为46kbb，容量量为311455kb 具有l噬噬菌体的的特性：被包装装后能高高效转化化E.ccolii 具有质粒粒载体的的特性：自主复复制，带带有抗性性表记，易易于选择择阳性克克隆 高容量的的克隆能能力：可可载高达达45kkb外源源DNAA 因不含
45、ll的基因因，故不不会裂解解 便于定向向克隆4、酵母母人工染染色体载载体 （yeeastt arrtifficiial chrromoosomme, YAAC） 人基因组组十分庞庞大，约约含41099bp，建建立和筛筛选人的的基因组组文库，要要求有容容量更大大的载体体 YAC含含有酵母母染色体体端粒（tteleesomme）、着着丝点(cenntroomerre)及及复制起起点等功功能序列列 YAC是是迄今容容量最大大的克隆隆载体，插插入片段段平均长长度在220010000Kbb，最大大可达22Mb 导入酵母母细胞可可以随细细胞分裂裂周期复复制繁殖殖供作克克隆，成成为人基基因组研研究计划划的重要要工具 YAC的的主要缺缺点 1存在在高比例例的嵌合合体，即即一个YYAC克克隆含有有两个本本来不相相连的独独立片段段 2部分分克隆子子不稳定定，在转转代培养养中可能能会发生生缺失或或重排 3难与与酵母染染色体区区分开，因因为YAAC与酵酵母