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1、病原真菌与植物互作的分子作用的机理【摘要】：寄主植物与枯萎病菌互作的病理学是一个十分复杂的系统, 从病原菌接触寄主植物到寄主植物发病, 是病原菌识别寄主, 穿透寄主组织、生长和繁殖, 解除寄主防御以及植物抵抗病原菌的入侵和繁殖相互斗争的过程。其间包含着各种信号的传递过程和寄主在细胞、组织、形态、生理、生化、分子等水平的变化过程。仅仅研究两者间某一水平或某一状态下的互作机理是远远不够的, 应综合运用生物化学、细胞生物学和分子生物学手段进行系统研究。【关键词】：病原真菌（pathogenic fungi） 信号传导(signal transduction) 基因表达(gene expression
2、) 分子作用(molecular action)Abstract: The host plants and germs interaction pathology is a very complicated system. Contacting from pathogen host plants to host plant disease, the pathogen recognition is host, through the host organization, growth and reproduction, remove host plants resist pathogens de
3、fense and the invasion and reproduction of the process against each other. It contains all kinds of signal transfer process and host in cells, organizing, form, physiology, biochemistry and molecular level of change process. Only between a level research or a state of the interaction mechanism is no
4、t enough, so we should be comprehensive use of biological chemistry, cell biology and molecular biology research means for the system.引言：当人类不断改良植物的同时,病原真菌与植物之间的关系也随之变化。在植物与病原真菌相互作用的漫长过程中,形成了高度专化和极端复杂的关系,造就了一种相互选择,协同进化的格局。随着植物分子病理学及重组DNA 技术的迅速发展,日益深化人们对植物病原菌互作关系的认识。Flor (1947 ,1971) 通过对亚麻锈病的研究为此学科奠定了
5、遗传学基础。他的假说认为:寄主中调节抗病的基因与病原菌中调节致病的基因一一对应。目前在抗病性中有两种模型:一种是Flor 提出的基因对基因的特异特性,激发子受体模式;而另一种是Scheffer等提出的毒素解毒酶的模式,这是在病原菌分泌寄主特异的毒素情况下的一种模式。随着近年来的转座子标签法及图谱克隆技术的应用,在此领域已有很多突破性进展。1.病原真菌致病的分子基础1.1.真菌致病因子及相关基因致病基因是决定病原菌与寄主建立亲和互作关系,并进而影响植物正常生理功能的基因。据估计,一种病菌至少有100 多个基因与致病有关。通常有几类物质被认为是病原真菌致病因子,即:毒素、各种酶(角质酶、纤维素酶等
6、) 及其它毒性因子。.寄主选择性真菌毒素及其相关基因长期以来,寄主选择性真菌毒素一直作为典型的致病因子,多为萜类、脂类、糖苷、多糖、肽、蛋白质及糖蛋白等低分子次生代谢产物。在感病品种中,具有毒素的受体(receptor) ,而抗病品种中则缺乏此受体,或受体发生了变化导致不能识别毒素。研究表明,在产生寄主选择性毒素的旋孢腔菌的三个小种中, 三个不同的单基因Tox1 、Tox2 、Tox3 分别控制HMT2毒素、HC 毒素及HV 毒素的产生。Janes (1993) 研究认为: Cochliobol us carorum1 号小种产生HC 毒素需要HTS21 和HTS22 两种酶,它们均受Tox2
7、 基因位点控制,该位点有一个1517kb 的基因( HTS21) 负责编码多功能肽合成酶1 。对A l ternaria 属的几种寄主专化性毒素的基因调控进行初步研究的结果表明,它的产毒菌株间DNA 同源性达90 %。到目前为止,对毒素基因调控方面的研究较少。原因是产毒单基因控制毒素产生的机理还不清楚。一些假设认为:某类毒素可能是在Tox 基因的非功能位点存在下积累的、偶尔有植物毒性的中间代谢物。然而从其它许多寄主选择性毒素结构来看,更有可能是Tox 基因编码多功能酶或基因群。1.1.2.病原真菌的角质酶基因及其致病性在病原菌侵入植物过程中,植物体表的角质层是病原真菌必须突破的第一层障碍。在过
8、去的二十年时间中,对角质酶在病原菌入侵中作用的研究证明,角质酶在决定病原菌致病性方面有重要作用。此方面的研究较多的来自于豌豆真菌Fusariumsolanifsppisi。研究表明,此菌对豌豆的毒性与角质酶表达量成正相关。当用基因降解法破坏角质酶基因表达时,导致病原真菌对豌豆毒性下降。.决定寄主范围的病原真菌抑制子(suppres2sor)在植物与病原真菌长期互作并不断进化过程中,真菌产生出一种逃避寄主的识别或干扰寄主的防卫体系的机制。其一种策略是产生抑制子(sup2pressor)。它的作用可能是直接干扰激发子与受体的结合,或者是信号传导、基因激活及对来自植物的防卫因子活性的抑制等。目前已公
9、认,寄主选择性毒素与寄主选择或非选择性的“抑制子”一起决定着真菌对寄主的致病性。抑制子存在的证据来自于:当植物被毒性真菌小种侵染后,寄主对于非毒性的小种也变得很敏感。得抗性,还可能向相反方向发展。到目前为止,只有少数几种植物的病原真菌抑制子得到研究。其中对豌豆病原真菌Mycosphaerlla pi nodes 的研究较详细。.某些病原真菌的毒性基因在豌豆枯萎病菌( Fusari um solani f . sp. pisi )中存在致病力不同的菌株。其毒力强弱同细胞色素p450 单加氧酶的活性呈正相关。致病菌可降解寄主体内的一种植保素( Pisatin) ,从而使寄主感病。Welt ring
10、 等(1989) 6 通过建立强毒株系的基因文库,获得了毒性基因Pda 。用其转化无毒菌株可恢复侵染力。1.2.病原真菌激发子与无毒基因及其产物病原菌与植物互作初期常会产生激发子引发寄主防卫反应系统,激发子多属于寡多糖、多糖、多肽、蛋白和糖蛋白一类小分子化合物。其中某些化合物可以从真菌入侵的芽管结构中释放出来。普通激发子通常是由一种病原菌所有小种产生的,能激发一种植物所有基因型产生防卫反应。如寡聚N2乙酰葡糖胺和寡聚半乳糖醛酸等对多种植物均具有活性。此类激发子通常也是真菌细胞的结构成份。小种专化性激发子也即无毒基因产物,它仅能激发那些含有相应抗性基因的植物品种的 防卫反应体系,从而产生抗性反应
11、。2.寄主植物与枯萎病菌互作机理植物枯萎病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌( Fusa rium oxysporum ) 寄生引起的一种世界性真菌土传病害, 病原菌从根部侵染植物, 在维管束内繁殖蔓延, 通过堵塞维管束导管和分泌有毒物质为害寄主, 造成叶片萎蔫和全株枯萎死亡。2.1.寄主植物与枯萎病菌互作的组织病理学研究通过对枯萎病菌侵入黄瓜根部维管组织的显微观察, 发现分生孢子在幼根表皮上萌发产生菌丝, 通过胞间层侵入表皮细胞, 之后菌丝继续向内部生长, 穿过皮层组织进入导管; 受侵染的导管内相继出现壁覆盖物、侵填体、褐色物。抗病品种的壁覆盖物比感病品种的厚, 侵填体由受侵染导管旁边的薄壁细胞
12、产生, 感病品种中的侵填体发育不充分, 抗病品种中的侵填体能完全堵塞导管;褐色物在感病、抗病品种中均能完全堵塞导管, 对菌丝的侵入构成了较强的机械障碍(徐建华等, 1997) 。陈珉等( 2003 ) 的研究发现, 枯萎病菌从黄瓜伤口进入导管后菌丝向上扩展的速度在抗病品种中较在感病品种中慢, 抗病品种的皮层薄壁细胞间隙未观察到菌丝, 表明抗病品种能抵抗病菌通过表皮的入侵。接种后, 抗、感黄瓜品种在木质部导管中出现侵填体、壁覆盖物、褐色物及皮层薄壁细胞木栓化, 抗病品种出现这些反应较早, 表明抗病品种较早形成保卫反应。因此, 以上研究结果均表明, 寄主受侵染后最终的抗病或感病表现与壁覆盖物、侵填
13、体、褐色物出现的早晚及其强度有关, 抗病品种中, 这种防卫反应出现得早且迅速, 且较感病品种强,是相对有效的抗性反应。而仅靠根系维管束对病原菌孢子移动的机械阻碍作用并不能为抗病品种提供足够的抗性, 但却为寄主防卫反应的发挥赢得了时间。2.2.寄主植物与枯萎病菌互作的生理生化病理学研究史娟等(2001) 用枯萎病菌感染黄瓜的试验表明, 黄瓜根部几丁质酶可被诱导积累, 在诱导的速度和强度上抗病品种和感病品种有明显的差别。高抗品种津杂4号几丁质酶的活性不仅上升的速度快, 而且升高的幅度是感病品种津研4号的23倍, 这表明几丁质酶与黄瓜对枯萎病的抗性反应有关。邹芳斌等( 2008) 以6个不同抗性品系
14、黄瓜为材料, 研究苗期感染枯萎病菌后,叶片组织内过氧化物酶( POD) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、多酚氧化酶( PPO) 活性变化曲线中存在2个酶峰, 苯丙氨酸转氨酶( PAL) 活性变化曲线中存在1个单峰。抗病品系的4种酶的峰值明显高于感病品系, 且与抗性呈显著正相关。2.3.寄主植物与枯萎病菌互作的分子生物学研究2.3.1.枯萎病抗病基因在枯萎病抗病基因克隆研究方面, Simons等( 1998) 利用图位克隆技术首先克隆了番茄抗枯萎病基因I2之后, 众多学者又利用抗病基因同源序列(Resistance gene analogs, RGA) 克隆技术,在小麦、水稻、鹰嘴豆、甜瓜、黄瓜
15、等经济作物上广泛开展了抗枯萎病候选基因的挖掘研究, 获得了大量RGA。甜瓜抗枯萎病基因克隆研究取得了突破性进展, Oliver等( 2001) 首先获得了与甜瓜抗枯萎病生理小种2基因紧密连锁的SSR标记, Luo等( 2001) 以抗枯萎病, 同时抗霜霉病、白粉病的甜瓜品系MR - 1, 构建了甜瓜的2个BAC文库, 用与Fom - 2共分离的标记FM、AM作为探针筛选抗病候选基因。结果表明: 抗病基因通常以基因簇的形式存在, 通常R 基因的功能通过信号转导通路, 含有受体结构域。B rotman等(2002) 从甜瓜中分离了14个RGA片段, 它们推导的氨基酸序列均与已知抗病基因编码的蛋白产
16、物类似, 并且通过分析其连锁关系发现, 部分同源序列与病虫抗性遗传位点连锁。Silberstein等( 2003) 采用RT - PCR 技术分析甜瓜的mRNA序列, 发现其中一个cDNA克隆与NB S - LRR 家族基因类似, 并把其定位在甜瓜遗传连锁图谱上。Joobeur等( 2004) 获得了甜瓜抗枯萎病生理小种0、1候选基因Fom - 2的克隆。2.3.2.与枯萎病抗性相关基因表达的研究Pietro等( 1998) 利用枯萎病菌引起的番茄维管束萎蔫病害, 克隆PG 1基因编码一个内- 多聚半乳糖醛酸酶, RT - PCR表明PG 1在根部和根茎部被枯萎病菌诱导表达。Martijn (
17、 2002) 研究发现枯萎病菌侵染番茄, 番茄木质部伤流液中蛋白质的含量相对于没接种病原菌的正常植株发生很大的变化, 发现PR - 5在两种类型的互作中出现积累, 其他病程相关蛋白随着病情的发展出现在亲和互作中。Dowd等(2004) 利用Microarray技术建立了枯萎病菌诱导下棉花根系和胚轴基因的表达谱, 发现枯萎病菌诱导了棉花的抗病相关蛋白, 植物抗毒素生物合成, 次生代谢物单宁、花青素、苯丙烷, 厌氧胁迫, 乙烯信号和植物激素等代谢途径基因的表达。Andrew和Frederick(2005) 通过用拟南芥抗病材料和感病材料杂交分离分析, 找到了6 个抗枯萎病的位点, 其中R FO 1
18、介导的抗性没有小种专化型, 通过同位克隆发现RFO 1 是一个以前命名的基因WAKL 22(WALL - ASSOC IATED KINASE - L IKE KINASE 22 ) , 编码一个激酶的受体,没有细胞外富含亮氨酸重复区, R FO 1突变体变成非常易感病,试验证实R FO 1编码一个具有抗多个枯萎病生理小种新类型的显性抗病蛋白, 且R FO 2 、RFO 4和R FO 6的表达依赖于R FO 1 。香蕉枯萎病研究中, 利用RT - PCR和RACE技术克隆了大蕉苯丙氨酸解氨酶基因(M - PAL ) , 并验证在病菌的诱导下大量表达, 推测M - PAL 基因可能与香焦枯萎病抗
19、性有关(Chen et al1, 2007 ) 。Lotan - pompan等(2007) 利用SSH和cDNA - AFLP技术, 研究了除草剂诱导甜瓜枯萎病抗性的机制, 发现除草剂是通过诱导胁迫反应来提高植物对枯萎病的抗性, 并具体分析了锌指DNA结合蛋白( zinc - fingerDNA - binding p rotein) 、植物萜类合成酶1 - 脱氧- D - 木酮糖- 5 - 磷酸还原异构酶、ADP - 葡萄糖- 焦磷酸化酶、乙醇酸氧化酶、软脂酰硫酯酶和水解酶7 个基因与甜瓜的枯萎病抗性有关。Szafranska等(2008) 以Charentais Fom - 2为材料,
20、分别接种生理小种1 (不致病) 和生理小种112 (致病) , 采用cDNA - AFLP的方法, 分析两种生理小种侵染引起的寄主差异表达的基因有500个, 其中P 14基因在不亲和互作中特异表达, 300个在亲和互作的晚期表达; 有50个来源于寄主的片段与枯萎病菌基因组具有同源性, 并上调表达, 但在病菌的培养中却不表达。3.植物细胞微丝骨架对真菌侵染的反应细胞骨架是20 世纪60 年代中期发现的一种新的细胞器,它是细胞质中由微管、微丝和中间纤维构成的一个三维网络结构的骨架体系。由于细胞骨架具有许多重要的生理功能,所以在发现至今的30 多年中,一直是活跃的研究前沿领域。近10 年来,病原微生
21、物侵染对寄主细胞骨架的影响也受到了研究者们的重视,但我国在这方面的研究起步较晚。3.1.植物细胞微丝骨架简介.植物微丝骨架的研究进展微丝主要由肌动蛋白构成,肌动蛋白(actin) 最初是20世纪40年代在脊椎动物骨骼肌中发现并加以命名的,它是真核生物细胞中最普遍存在的、最古老的蛋白质之一。1966 年,HATATO和COSAWA1 首次从低等生物粘菌中分离纯化出肌动蛋白。同年,BRLEN O和THIMANN首先在非肌细胞燕麦胚芽鞘中发现微丝结构,测出其纤维直径为7 nm ,它们成束分布在细胞质中。此后,PARTHASARATHY和MUHLETHALER(1972) 广泛调查了12 种植物的根、
22、茎细胞(正处于伸长中的细胞) ,结果在所有被观察的细胞中都发现有微丝存在。因此他们得出结论,微丝普遍存在于植物细胞中3 。1974 年,CONDEELIS 等4 采用特异标记肌动蛋白的方法重酶解肌球蛋白标记法,证明了高等植物孤挺花( Amaryllis belladonna) 花粉管细胞质中存在。.微丝骨架的结构和功能微丝骨架是由肌动蛋白聚合体和它的各种结合蛋白组成的丝状或网络状结构,是细胞骨架(主要由三种蛋白纤维组成:微管、微丝和中间纤维) 成员之一。细胞内的肌动蛋白以2 种形式存在:球状的肌动蛋白(globular actin ,即G2actin ) 和纤维状肌动蛋白(fibrous ac
23、tin ,即F2actin) 。G2actin 可以聚合成F2actin ,F2actin 也可以解聚成G2actin。G2actin 聚合成F2actin 时,若干G2actin 分子首先形成一个核心,然后从此长形分子的两端延长,肌动蛋白生长快的一端叫倒刺端,生长慢的一端叫尖端。肌动蛋白纤丝两端增长的速度不同,说明肌动蛋白纤丝是有极性的。肌动蛋白纤丝的直径只有7 nm ,在肌动蛋白交联蛋白的作用下,纤丝可以成束,形成光镜下可见的微丝束。微丝骨架的形态、分布随细胞生理功能的不同而不断变化着,因而微丝骨架结构具有动态性。3.2.真菌侵染时寄主细胞微丝骨架功能真菌侵染植物细胞的过程中,激发子、细胞
24、壁的降解物、吸器的膨压、侵入钉的压力可能都可以引起细胞骨架的变化。实验表明,显微注射针作用在原生质上的压力足够刺激原生质的聚集、核的迁移、活性氧的爆发和激活防卫反应。另外,豇豆细胞壁伤害和半纤维素酶的处理也可以刺激核的迁移。因而,真菌侵染时细胞骨架的精细重组似乎是原生质对伤害信号的一种反应。但是,几个实验系统提供的时间进程的证据表明,植物细胞所感知的并不是伤害信号。在大麦叶鞘细胞和亚麻细胞中,微丝出现重组要比侵入早34 h。而洋葱表皮细胞被真菌( Botrytis 或Magnaporthe) 侵染时,微丝积聚则与侵入同时发生。最有力的证据是来自对水稻稻瘟菌(Magnaporthe) 的一种突变
25、体mps1 的研究。该突变体由于缺失编码微管结合蛋白激酶(MAP - kinase) 的基因,不能形成侵入钉。但是该菌在植物表面生长时仍可以引起微丝骨架的重组。这表明在真菌生长过程的早期一定有一种信号物质被释放出来,与植物细胞进行识别。微丝的重组可能是细胞对识别信号的反应。尽管对真菌侵染时微丝骨架重组的确切功能目前还不甚了解,但是细胞松弛素等的药理学实验证明, 微丝骨架在植物抗真菌侵染中确实起着重要的作用。试验表明不能够发生微丝骨架重组的细胞可增强非致病菌侵入的能力,并且通过抑制过敏性坏死反应使真菌得以扩展。细胞松弛素可抑制或延迟大麦芽鞘细胞、马铃薯或豇豆的过敏性坏死,并且导致真菌向周围植物细
26、胞的扩散。细胞松弛素A 和E 在不抑制真菌生长的浓度条件下,可增加大麦白粉( Erysiphe graminis) 的穿透效率。并且,细胞松弛素A 可增加多种非致病真菌对大麦的穿透能力。本实验室(待发表资料) 用细胞松弛素D(CD) 预处理小麦叶片,然后接种叶锈菌,发现CD 明显抑制了寄主的过敏性坏死反应的发生。这些结果暗示着微丝骨架可能把与真菌互作的信号传递到细胞核从而改变了基因的表达;也可能是细胞通过微丝骨架向真菌侵入部位添补防卫相关的成分,形成了机械的或化学的屏障的缘故。从上面概略的叙述可以看出,微丝骨架不仅仅是被动地去感受病原菌的侵袭,而是在病原菌侵入之前微丝骨架就发生了主动的、精细的
27、重组。微丝骨架一端与质膜内侧的外(ectoplasm) 相连接, 另一端与核膜相连接,外质中又含有多种与信号转导级联反应有关的物质(例如蛋白激酶C 等) ,所以微丝骨架的重组可能同侵染信号的转导有着密切的关系。动物方面的研究表明,肌动蛋白结合蛋白对微丝骨架重组的启动、重组方式等都有着决定性的影响。因此,今后不仅应该继续研究不同寄主- 病原互作系统中微丝骨架的动态变化特征和功能,同时还应该注意研究各种肌动蛋白结合蛋白对微丝骨架重组的影响和功能。这对在亚细胞水平上查明植物抗病性的机制有着重要意义。参考文献: 1 蓝海燕，陈正华.植物与病原真菌互作的分子生物学及其研究进展 J . 生物工程进展200
28、0 ,Vol. 20 ,No. 42 张应烙, 尹彩萍, 赖伟明, 王祥胜, 邓贤兰，井冈山47种植物提取物对几种病原菌的生物活性J.江苏农业科学2005年第4期3 吕桂云，张海英，郭绍贵，许勇，寄主植物与枯萎病菌互作机理的研究进展J. 中国蔬菜2010 (4) : 1 - 74 陈晓波, 王冬梅, 刘娟, 王智植物细胞微丝骨架对真菌侵染的反应J. 河北农业大学学报Vol . 24 No. 35 王英杰,董萍.细胞骨架在跨膜信号传递中的作用J.生物学志,1995 ,2- 3.6 谢丽华, 王国红, 杨民和，内生真菌及其对宿主植物生态适应性的影响J. 菌物研究2006 , 4 (3) :98 -
29、 1067 唐雪辉,毛凯,干友民,刘琳，植物内生真菌的应用研究概况J. Grassland and Turf (Bimont hly) 2005 No. 5 (Sum No. 112)8 戴建武. 伴刀豆蛋白A 与巨噬细胞膜上受体结合后对微丝组装的影响J . 生物物理学报,1992 ,8 (1) :18 - 21.病原真菌与植物互作的分子作用的机理 班级 2008级生物技术 姓名 梁波 学号 0866149137内容总结（1）病原真菌与植物互作的分子作用的机理【摘要】：寄主植物与枯萎病菌互作的病理学是一个十分复杂的系统, 从病原菌接触寄主植物到寄主植物发病, 是病原菌识别寄主, 穿透寄主组织、生长和繁殖, 解除寄主防御以及植物抵抗病原菌的入侵和繁殖相互斗争的过程（2）通常有几类物质被认为是病原真菌致病因子,即:毒素、各种酶(角质酶、纤维素酶等) 及其它毒性因子