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1、荧光定量聚合酶链反应对肺结核患者支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌-DNA检出的意义研究【摘要】目的 研究荧光定量聚合酶链反应对肺结核患者支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌-DNA检出的意义。方法 将我院肺结核患者36例以及同期36例非结核肺部疾病者作为研究对象。所有患者先采用漂浮集菌涂片法，再采用实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌DNA，比较两种方法的检测结果。结果 荧光定量PCR检测的阳性率为75.00，漂浮集菌涂片法的阳性率为44.44，与痰涂片抗酸染色相比，FQPCR法检出结核杆菌阳性率高，且P0.05。结论 利用荧光定量聚合酶链反应对肺结核患者进行诊断有很高的检出率，可作为一种可靠的诊断依据。【
2、关键词】荧光定量聚合酶链反应；肺结核；结核分枝杆菌；DNA前言肺结核是一种传染性疾病，随着人口流动的增加，肺结核的发生率也呈现着增长的趋势。目前，肺结核已经成为临床上研究的重点之一1。肺结核大多症状不典型，因此诊断有一定的困难。我院现研究荧光定量聚合酶链反应在肺结核患者支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌-DNA检测中的价值，以探讨其诊断意义。1.资料和方法1.1一般资料抽取我院2014年3月2015年3月期间36例肺结核患者以及36例非肺结核患者作为本次实验的研究对象，先后给予不同方法诊断。非肺结核患者中男18例，女18例；年龄3164岁，平均年龄为46.572.36岁；急慢性支气管炎13例，支气管
3、扩张8例，肺炎9例，肺癌6例。肺结核患者中男17例，女19例；年龄3265岁，平均年龄为46.342.54岁；菌阴19例，菌阳17例。两组患者一般资料上的差异不显著（P0.05），具有可比性。1.2方法所有患者采用漂浮集菌涂片法，收集患者的晨痰、夜间痰和及时痰，加入两倍体积无菌蒸馏水，利用高压蒸汽灭菌20分钟后再加入0.3ml二甲苯，摇晃10分钟，将无菌蒸馏水加满至瓶口，静置15分钟，取涂有血清的玻片盖在瓶口上，静置15分钟，去载玻片，干燥之后，根据结核病诊断实验室检验规程进行抗酸染色和镜检。 FQ-PCR采用结核分支杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒和FQPCR仪，根据患者的病变部位选择灌洗肺段，在
4、患者肺段或者肺亚段支气管开口处插入纤维支气管镜，经活检孔将23ml2%的利多卡因注入，局部麻醉灌洗肺段，并将20ml37的生理盐水注入，回收BALF，大约为15ml，可重复灌洗两到三次。1.3统计学处理文中所有数据均采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计数资料采用x2检验，计量资料用t检验，并用()表示，P0.05表示差异存在统计学意义。2. 结果2.1两组患者的阳性率比较 36例肺结核患者中，FQ-PCR阳性率为75.00，痰涂片抗酸染色阳性率为44.44，FQ-PCR阳性率显著高于痰涂片，P0.05（x2=6.99）；非肺结核患者中，FQ-PCR阳性率为13.89，痰涂片抗酸染色阳性率
5、为13.89，两组相比无差异，P0.05，见表1。表1 两组患者不同检查方法的阳性率比较n（%）组别例数FQ-PCR痰涂片肺结核3627(75.00)16(44.44)非肺结核365(13.89)5(13.89)x227.238.13P0.050.052.2两种方法检出率比较 FQ-PCR 法和痰涂片法相比，其结核杆菌检出率更高，P0.05，见表2。表2 两种方法检测结果比较 方法总例数检出数检出率FQ-PCR363186.11%痰涂片362363.89%x24.744.74P0.050.053. 讨论对于不典型的肺结核患者，通常要根据患者的临床症状、体征和实验室检查来进行推测性诊断。实时荧光
6、定量PCR检测是肺结核患者主要的检查方法之一，具有较高的敏感性和特异性，根据研究结果证明，支气管肺泡灌洗液PCR对结核分枝杆菌的检测阳性率高，据分析，这是由于支气管肺泡灌洗液是从患者的病变部位直接取材，因此获得的结核分枝杆菌的机会也更多，对于一些痰菌含量少、未与引流支气管相通、肺部病灶局限以及肺结核暂时处于稳定期的患者而言，特别是无痰或者少痰菌阴患者，能够一定程度上避免口咽部对标本的污染。漂浮集菌涂片法虽然简单快速，但是由于其灵敏度和检出率比较低，有资料表明，大约500010000条菌/ml才能检查出阳性结果，而且不能分开结核杆菌和其它的分枝杆菌2-3。本次研究中采用的痰漂浮集菌涂片法是一种改
7、良的痰涂片，其敏感性高于直接涂片法，但是特异性比较低。荧光定量聚合酶链反应在分子生物学技术的发展下取得了较为满意的成果，该技术结合了核酸扩增、杂交和光谱技术，在封闭状态下进行检测，避免了扩增产物污染导致的假阳性，利用特异性探针进行实时检测，实现自动分析一体化，检测结果精确4。据观察，PCR法对结核杆菌基因组DNA的检测灵敏度很高。在本次实验中，PCR法与痰涂片法相比，其检测阳性率大大高于痰涂片。实时荧光定量聚合酶链反应是基于PCR定性技术发展起来的核酸定量技术。和其它PCR技术相比，该种方法在反应体系中加入了荧光团，将其作为一种标记物对整个PCR的进程进行检测，通过标准曲线定量分析未知模板和检
8、测液中的DNA5。FQ-PCR的优势在于，不仅能够实现定量分析，而且灵敏度较高，具有很强的特异性，具备自动化、实时性、准确性，避免交叉污染，是一种十分可靠的诊断方式。而临床上主要的培养法是检查结核杆菌的金标准，但是由于结核杆菌细胞壁结果比较特殊，因此生长速度比较慢，培养周期一般需要3至8W左右，最快的培养时间也需要7至10天，不利于肺结核的早期诊断。据研究，FQ-PCR总体检测与培养法符合率比较高，对痰培养阳性标本敏感性和培养法具有很高的一致性，但总体的敏感性更高。综上所述，在肺结核的诊断中，采用荧光定量聚合酶链反应对患者的支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌-DNA检出具有重要的价值。【参考文献】1
9、黄泽亮， 桂福.FQ-PCR检查痰中结核杆菌对肺结核诊断的临床价值J.中南医学科学杂志,2013,41(04)：389-391.2宋朝宾， 周真珍.荧光定量PCR技术在痰结核菌中的检测评价J.中外健康文摘,2013，10(26):257-258.3韦南仕， 黄强.实时荧光定量聚合酶链反应对不典型肺结核的诊断价值J.中国保健营养(上旬刊),2013,23(04):1636.4刘小文， 欧阳冬英.实时荧光定量PCR检测痰中结核分枝杆菌临床评价J.中国现代医药杂志,2014,16(01):24-26.5孟小蓉， 包勇， 李凯等.巢式实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA的临床应用J.中华肺部疾病杂志（电子版），2014,7(01)：32-35.内容总结（1）荧光定量聚合酶链反应对肺结核患者支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌-DNA检出的意义研究【摘要】目的 研究荧光定量聚合酶链反应对肺结核患者支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌-DNA检出的意义（2）荧光定量聚合酶链反应对肺结核患者支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌-DNA检出的意义研究【摘要】目的 研究荧光定量聚合酶链反应对肺结核患者支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌-DNA检出的意义