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1、改进的原吓琳IX引导神经外科肿瘤检测与频域荧光寿命成抽象精确的术中脑肿瘤可视化支持外科医生实现最大的平安切除。从这个意义上说，已经证明接受原吓咻IX荧光引导手术的高级别 胶质瘤患者的预后有所改善。频域中的相位荧光寿命成像已经显示出将弱口卜咻IX荧光与竞争性内源性组织荧光团区分开来的前 景，从而允许高灵敏度的脑肿瘤检测。在这项工作中，我们说明，当仅检测615nm以上的荧光发射时，通过最小化自发荧光信 号贡献的串扰，可以进一步改进该技术。结合对一组130个离体脑肿瘤标本（14个低级别和56个高级别胶质瘤，39个脑膜瘤 和21个转移瘤）的荧光寿命和光谱测量，连贯地证实了相对于先前工作中使用的检测波段
2、的荧光寿命的增加。这对于从生理大 脑的自发荧光背景中获得明确的区别具有重要意义。特别是，在手术切除过程中缺乏视觉荧光的低级别和高级别胶质瘤标本的 中位荧光寿命分别从4.7 ns增加到5.4 ns和2.9 ns增力口至U 3.3 ns。虽然需要更多的数据来创立统计证据，但所有肿瘤组中观察 到的一致性强调，在未来的研究中应该考虑到这种优化。关犍字:荧光引导手术;荧光寿命成像;荧光光谱;原口卜琳IX1.引言在美国，被诊断为中枢神经系统（CNS）肿瘤的患者的年平均年龄调整发病率为每100, 000人中有24人。特别是， 浸润性胶质瘤预后较差。多形性胶质母细胞瘤（GBM）的中位生存期约为8-15个月，而
3、低级别胶质瘤（LGG）的中位生存期 为3-10年1, 2o在细胞减灭手术中，最大限度地扩大切除范围，同时优先考虑神经功能是最具决定性的预后因素之一，也是 胶质瘤、脑膜瘤（MNG）和脑转移瘤（MET）初始治疗的关键因素3, 4, 5, 6, 7, 8, 90原吓咻IX （PpIX）荧光导联线首 先用于高级别胶质瘤（HGG）的术中可视化10, 11,随后在MNG 12和MET 13中进行了研究，结果有希望。非荧光前体 5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）的术前给药可导致PpIX的肿瘤特异性代谢14。手术显微镜可以配备光学滤光片来可视化PpIX的红 色荧光，从而检测肿瘤组织。然而，传统的PpIX引导手术仅
4、限于肿瘤浸润脑中的低级别胶质瘤或低浓度的PpIX,其中内源性 组织荧光和局部蓝色激发光超过PpIX荧光3, 15, 16o特别是，绝大多数纯LGG在切除过程中缺乏荧光3, 16, 17, 18, 19, 这些肿瘤中的可见荧光主要在间变性病灶中观察到17, 20, 21o频域相位荧光寿命成像（FD-FLIM）已显示出从竞争荧光团中 划定低PpIX浓度的前景，因为它们各自的衰变动力学存在差异15, 22, 23, 24, 250由于PpIX的兴奋态种群具有较慢的人 口减少率（原生寿命H6.4 ns 26）, PpIX在组织中的积累需要相对于生理性脑实质中发现的约1 ns至2 ns的荧光寿命增加15
5、, 24,25, 27。当PpIX荧光和组织自发荧光处于同一数量级时，测量的寿命取决于相对PpIX和自发荧光信号的贡献15FD-FLIM 相位的平均寿命对于导致多指数衰变的荧光团，由下式给出跟作为调制频率，强度贡献和每个荧光基团的荧光寿命28。相反，在时域中测量的平均荧光寿命由下式给出：（1）因此，与时域FLIM的平均寿命相比，寿命较短的荧光基团在相位的频域测量中权重更强28。因此，为了描绘组织中PpIX 的弱浓度，减少自发荧光的贡献并使发射滤光片的检测带内的PpIX信号最大化特别有用。在我们之前的工作中，我们采用了 590 nm至740 nm的检测条带来捕获组织的荧光响应15, 22, 23
6、, 24, 25。我们假 设调整光谱检测波段以优化PpIX与自发荧光比进一步增加整体测量寿命，从而增强与生理脑实质自发荧光背景的比照度。为了 证实我们的假设，在一组130个脑肿瘤标本上获得了 FD-FLIM和光谱荧光数据。然后，我们评估了 FD-FLIM以及时间和光谱 分辨荧光数据的组合，以验证对检测条带所做的调整。2 .材料和方法FD-FUM和光谱成像设置FD-FLIM和光谱数据是使用工作距离为200 mm的多模态手术显微镜获取的（OPMI Visu 200, Carl Zeiss Meditec AG, 德国耶拿）。有兴趣的读者可以参考我们之前的工作，了解该系统的详细说明15, 23o简而
7、言之，荧光由405nm激光二极管 （phoxX-405, Omicron Laserage, Rodgau, Germany）激发，该二极管以10 MHz的频率调制并在整个组织中进行光栅扫描。 在6.5 x6.5mm的视场上采集荧光寿命图通过采用同源检测方案。FD-FLIM采集在16秒内完成,横向分辨率为25pm（256x256 像素），激光功率为6mW。我们的系统允许将激光引导到标本上的特定感兴趣区域，以获取互补的光谱信息。影像学检查方案 可在其他地方找到15。荧光发射通过590 nm至740 nm （665/150 BrightLine HC Semrock,罗切斯特，纽约州，美国）带通
8、滤光片或615 nm长通滤光片（ET615LP, Chroma, Bellow Falls, Vermont）过滤。我们安装了一个带谐振压电电机的多位置 滑块（ELL9K, Thorlabs Inc.,牛顿，新泽西州，美国），用于在发射滤波器之间快速切换。患者队列和标本处理作为正在进行的离体研究的一局部，脑肿瘤标本被常规平安地切除，保存在人工脑脊液中（Landesapotheke Salzburg, 19C11S02）,并在切除后一小时内成像。组织病理学检查由经验丰富的神经病理学家根据2016年WHO对CNS肿瘤进行分 类后进行29。总共用两种过滤器对14个LGG, 56个HGG, 39 MN
9、G和21个MET标本进行成像，并进一步分组为亚组，这 些亚组是（1）没有5-ALA给药的样品，（2）在手术过程中施用5-ALA但缺乏可见荧光的样品，以及（3）在手术过程中显示 可见荧光的样品。MET标本组起源于不同的癌，包括支气管癌、乳腺癌、甲状腺癌、尿路癌、肾细胞癌和鳞状细胞癌。本研究 中考虑的口服和不口服5-ALA的标本数量见表1。用两个光学滤光片连续成像标本。对于具有5-ALA给药的标本,我们将FD-FLIM 与光谱测量相结合。由于光谱仪通道是在工程后期实施的，因此具有光谱测量的标本数量为82个，总共有269个数据点（每个 样品约3个光谱测量）。获得维也纳医科大学伦理委员会批准（EK41
10、9/200804/2018修正案），患者被告知并给予书面同意。 表1.转移、低级别胶质瘤、高级别胶质瘤和脑膜瘤的荧光寿命统计数据，使用590 nm-740 nm带通和615 nm长通滤光片 测量。将离体成像的人脑肿瘤标本进一步分组为未给予5-ALA的样品（No. 5-ALA）和具有5-ALA给药的无或具有可见术中荧 光的样品（分别为Fluo, Fluo+） o.结果优化FD-FLIM检测带,以增强PpIX与组织自发荧光的描绘当在荧光引导手术中检测弱PpIX浓度时，大脑的自发荧光背景可能比实际的PpIX荧光更强。图1中所示的代表性LGG 对此进行了说明。用405nm激发后，用科学相机（430nm
11、）捕获的标本的荧光为白色至淡蓝色（al） o组织自发荧光主导了 总体信号，在手术切除和成像过程中无法直观地观察到红色的PpIX荧光。在沾满鲜血的区域可以看到深红色的斑点。在三个选 定的投资回报率上获得光谱测量（all）,通过红色方块表示。在自发荧光背景上方观察到635 nm处和略低于700 nm的小峰， 对应于PpIX的弱积累。样品（alll）的代表性苏木精和曙红（H&E）染色显示CNS组织具有增加的细胞性和浸润多形性神经胶 质肿瘤细胞。从590 nm到740 nm的发射带，我们在以前的工作中也采用了这种发射带，如图（bl）所示。拟合线下方的信号 贡献有助于自发荧光背景，并呈蓝色。PpIX信号
12、贡献为红色。解调的荧光强度（mVMath Processing Error）和使用此滤波器 测量的寿命（ns）显示在（bll）和（bill）中。而整个样品的平均荧光强度为8.8mV/Ma力尸rocesshgErr。小ROI13的荧光 寿命平均值分别为2.0 ns、4.9 ns和3.7 ns。在测量的PpIX发射光谱中，在590nm和实际PpIX发射峰之间的波长处观察到相 当数量的自发荧光。为了确定这项工作中使用的优化的截止波长,我们推导出了 PpIX的荧光发射光谱（数据取自PhotochemCAD 30）,并选择了具有最接近推导开始上升点的可用现成滤光片的波长。这导致将截止时间设置为615 n
13、m,如图1 （cl）所示。 切除低于615 nm的自发荧光将平均荧光强度降低至7.1 mVMath Processing Error （ell）.这反过来又增加了 PpIX对整体信 号的相对贡献。因此，RO11至3的平均荧光寿命分别增加到2.2 ns、5.6 ns和4.3 ns （clll）。平均而言，与590 nm至740 nm的条带相比，所有标本的检测信号强度615 nm降低了约17%。图1. （a）用科学相机（I）捕获的标本的荧光430nm）,在标本上感兴趣的特定区域上测量光谱（II）,以及具有代表性的组织病理学H&E染色扫描（III）。使用590至740 nm （b （I） ） #61
14、5 nm （c （I）的发射滤光片获取数据。相应的解调均方根荧光强度(mYMath Processing Error)和寿命(ns)映射显示在(b (II) , c (II)和(b (III) , c (III)中。最小化自发荧光串扰改善了频域FUM的原口卜麻IX的检测基于这些观察结果，我们进行了一项研究，以研究调整后的过滤器对来自各种肿瘤实体的大量标本的影响。我们对130 个脑肿瘤标本进行了 FD-FLIM体外测量，并将其与其他光谱测量相结合。使用光谱来确定相对PpIX信号贡献（RSC） Math Processing Error） 15,这就是为什么没有5-ALA给药的标本被排除在图2a的
15、分析之外的原因。图2.光谱波段590 nm至740 nm和615 nm的FD-FLIM PpIX检测比拟。（a）将荧光寿命与相对PpIX信号贡献相关联，表 明从相对PpIX信号贡献约0.25开始，检测到615nm的测量寿命增加。对于590-740 nm和615 nm的检测，给出了 95% 的预测区间（虚线）和95%的置信区间（围绕5阶多项式拟合的色晕）。然后比拟两个波段的荧光寿命，用于转移（b）, 低级别和高级别胶质瘤（c）和脑膜瘤（d）。根据手术期间感知的荧光（可见，不可见）对样品进行分组，并且在手术前未给 予5-ALA的样品作为单独的组进行处理。来自我们先前工作的非病理标本的数据15用灰线
16、（实线：中位数，虚线：第一和第 三四分位数）表示，以便与肿瘤组织中测量的寿命直接比拟。每个过滤器和子组的试样数量在（bd）的下端表示（例如，6/6）。将测量的寿命绘制为RSC的函数说明了 615nm以下的封闭自发荧光如何影响测量的寿命（图2a）。使用615 nm长通 滤波器获取的数据以黄色绘制。数据点根据其在手术过程中的荧光状态进行标记，圆圈表示缺乏可见性，加可见荧光。低于0.25 RSC,自发荧光主导了整个信号，两个滤光片之间测得的荧光寿命几乎没有变化。高于0.25RSC,由于信号中PpIX含量的增 加，测量的寿命开始增加。比拟两个滤光片，我们观察到在615 nm处测量的开口寿命增加得更强，
17、从0.25 RSC逐渐增加至约 0.8 RSC.由于PpIX荧光和组织自发荧光处于相同的数量级，该滤光片影响了荧光团比，有利于PpIX。高于0.8 RSC在手术切 除过程中，PpIX荧光逐渐开始变得可见，PpIX现在是主要的信号贡献者。结果，组织自发荧光对整体信号的影响较小，并且两 个滤波器之间测量寿命的差异开始减小。术中荧光较强的样品在RSC下浓缩的1.0。然后，我们将MET （图2b） , LGG, HGG （图2c）和MNG（图2d）中的所有标本分组。对于每个组，我们进一步区分了手术前未施用5-ALA的标本，手术期间施用5-ALA 但没有可见荧光的标本和手术期间可见荧光的样品。使用所有子
18、组的箱形图可视化中位数以及0.25和0.75四分位数。正如 预期的那样，615 nm长通滤波器导致大多数5-ALA给药亚组的测量寿命增加。LGG试样的中位寿命分别为5.4 ns和4.7 ns, 615 nm长通滤光片和590 nm至740 nm带通滤光片的中位寿命分别为5.4 ns和4.7 ns。然而，两种发射滤光片之间没有发现 显着差异（p = 0.17）。同样，在没有（3.3 ns, 2.9 ns, p = 0.78）初 （74.7 ns, 13.4 ns, p = 0.04）可见荧光的情况下，HGG 的中位寿命增加。在没有可见荧光（4.9ns, 4.3ns, p = 0.03）和可见荧光
19、（9.8ns, 8.4ns, p = 0.11）的MET中也观察到了 这一点。只有在MNG组中，缺乏可见荧光的样品对于615 nm长通滤光片的寿命较低（3.8 ns, 4.2 ns, p = 0.67）,这将在后 面讨论。未给予5-ALA的患者标本的寿命几乎没有受到MET （2.5 ns, 2.5 ns, p = 0.47）和LGG （2.4 ns, 2.3 ns, p = 0.44） 的滤光片变化的影响，甚至在MNG中降低（2.2 ns, 2.4 ns, p = 0.90）。有关所有子组的完整数据，请参阅表1。从我们以前 的工作15中测量的非病理性大脑中的寿命用灰线表示（实心：中位数，虚线：
20、第一和第三个四分位数）。手术过程中缺乏可见 荧光的标本可以用两种滤光片与该自发荧光基线区分开来。然而，优化的滤波器增加了大多数子组中的测量寿命，这有利于检 测弱PpIX积累。3 .讨论在这项工作中，我们通过最小化检测带内的自发荧光串扰，改进了荧光引导手术的FD-FLIMPpIX可视化。光学滤光片必 须根据各自的应用进行定制，以确保荧光成像的最正确性能。这一点很重要，特别是当几个荧光团被激发并在检测条带内发射时， 在烟酰胺腺喋吟二核甘酸（NAD （P） H）和黄素腺喋吟二核甘酸（FAD）的代谢成像中，已经开展了大量工作来优化过滤器规 格并最大限度地减少串扰31, 32o PpIX的FLIM最近才
21、出现，之前的工作已经采用了宽检测波段（590-740 nm）来捕获完整 的PpIX发射光谱并增加总提供的信号15, 22, 23, 24, 25。这没有充分考虑组织自发荧光的影响，对于低级别肿瘤和弱肿瘤 浸润的大脑，其数量级可能与PpIX荧光相同。在FD-FLIM中，测量的寿命是所有发光荧光基团的加权平均值。当激发光谱蓝 色范围内的荧光时，590nm以上的非病理性脑的组织自发荧光在约1-2 ns内衰变15, 24, 25, 27,黄素、脂褐素、维生素A、 内源性吓咻和其他荧光团的个体贡献3司。发现肿瘤组织中的自发荧光寿命增加超过2 ns340 PpIX在有机溶剂26中产生更高 的寿命，在线粒体
22、中高达16.4 ns 26至7.4 ns 350光原吓咻和光产物II + III在线粒体中分别在5.4 ns内衰变36和细胞质中 约 2-4 ns37o组织中PpIX的弱浓度可以通过相对于自发荧光背景的寿命增加来检测。PpIX对总体激发态群体的相对贡献较高，从而 增加了所有荧光团的平均寿命，从而导致多指数衰变15。将FD-FLIM与光谱学相结合，从RSC开始，测量寿命的延长更大检 测荧光时约为0.25615nm。在590 nm和615 nm之间阻断自发荧光增加了 PpIX对整体信号的贡献，这有利于将PpIX与自发 荧光背景区分开来。同样，描述性统计一致地显示，除了在切除期间缺乏视觉荧光的MNG
23、组外，所有给予5-ALA的亚组的寿 命增加。对于这一组，我们在光谱测量中观察到自发荧光信号的贡献增加。一种潜在的解释可能是具有相对较长寿命的黄素的 积累，例如黄素单核甘酸（与蛋白质结合时为4.8 ns）。使用615 nm长通滤波器去除这些贡献将解释对低PpIX浓度MNG的 整体寿命的相反影响。有必要进一步研究自身荧光特性，特别是MNG的自发荧光特性。对于大多数组，两个光谱滤波器之间的 差异没有发现显着，这可以导致每组样本数量有限，并且与组之间的寿命差异相比，组内的方差相对较高。虽然研究中纳入了 130个标本，但肿瘤实体和亚组的数量（可见荧光，不可见荧光，没有5-ALA给药）进一步缩小了组的大小
24、。此外，来自核心 肿瘤区域，浸润区以及坏死和反响区域的标本在亚组中合并，这导致了组内的差异。然而，优化滤光片的荧光寿命增加的趋势 对于所有亚组都非常一致，上面讨论的MNG组除外。还要注意的是，优化滤光片中总体信号强度的降低（与之前的滤光片相比 减少了 17%）可能导致相位噪声的增加，从而降低表现出非常弱荧光的组织的信噪比，例如，被血液覆盖的局部标本。然而， 整体光子预算主要由系统的检测效率决定，并且可以根据可接受的相位噪声水平进行定制。集成信号对FD-FLIM相位测量中噪 声的影响在我们之前工作的补充材料中进行了更详细的描述15。我们进一步强调，在手术过程中缺乏可见荧光的所有肿瘤实体 的37个
25、标本中，所有标本都可以通过增加荧光寿命来区分非病理性脑预期的1 ns至2 nso请注意，必须连续进行标本成像以比拟滤光片，这可能导致在第一次测量期间荧光漂白并影响第二次采集。我们通过使用 相同的滤光片连续成像样品来分析漂白，发现两次扫描之间漂白引起的寿命缩短小于0.1 nso此外，我们改变了首先使用哪个 滤光片在标本之间成像的顺序，并且无法发现对成像顺序的任何影响。在所有组中观察到的总体相干性以及多模态FD-FLIM和光谱学评估为支持615 nm长通滤光片提供了证据。PpIX与自发 荧光比的进一步优化潜力是将检测带限制在主要的PpIX发射峰。我们使用620 nm至640 nm带通滤波器进行了第
26、一次测试， 相对于615 nm长通滤波器，测量寿命略大，代价是降低了信噪比并增加了测量中的相位噪声。此外，在LGG中观察到PpIX 的双峰发射，其中一种物理化学状态在较低波长620nm处到达峰值38。因此，615 nm处的截止波长是首选。虽然我们采用了 现成的长通滤光片，但截止波长约为715 nm的带通滤光片，紧随第二个PpIX发射峰之后，似乎是PpIX的FD-FLIM成像的最 佳选择。光谱分辨的FLIM对于更详细地研究这一点非常有益39。在未来研究中，一个有价值的附加频域指标是调制寿命。因 此，基态异质性的度量可以由（/）-1,基本上反映了检测到的光谱内多指数荧光团衰变的寿命方差。对于PpI
27、X荧光超过组织 自发荧光的高级别肿瘤，该测量值预计将接近0,因为=对于单指数衰变28。对于较低级别的肿瘤，其中PpIX处于组织自发 荧光的数量级，基态异质性可能是区分5-ALA标记肿瘤和非病理性脑的有趣附加指标。此外，可以给出基于寿命的PpIX与背 景荧光的比率，例如，通过将相位和调制寿命转换为相量图的矢量空间24, 40o此外，时域FLIM将通过拟合多指数模型，允 许从自发荧光背景中更好地比照PpIXo旋转相关时间的荧光各向异性测量可能为解决5-ALA标记肿瘤和非病理性脑中的基态异 质性提供额外的比照来源。然而，正如本文和我们之前的工作15, 22, 23, 24, 25所概述的那样，仅FD-FLIM中的平均相寿 命确实构成了 PpIX荧光引导的一种敏感且有前途的方法。综上所述，我们说明，通过最小化检测波段的自发荧光串扰，可以进一步改善用于PpIX引导的脑肿瘤可视化的FD-FLIMo 在未来的系统和研究中，应使用615nm的截止波长检测荧光，以获得低级别肿瘤或弱肿瘤浸润脑中弱PpIX浓度相对于非病理 性脑的自发荧光背景的最正确比照度。