[小鼠HL_1心肌细胞清道夫受体的表达]心肌细胞受体.docx

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1、小鼠HL_1心肌细胞清道夫受体的表达心肌细胞受体 中图分类号：R54 文献标识码：A 文章编号：1009_816X(2011) 05_0358_03 DOI:10.3969/j.issn.1009_816X.2011.05.10 The Expression of Scavenger Receptor_BI of HL_1 Cells.PENG Jun, QIANG Zheng_ming, HUANG Jian_zhen, et al. Cardiology Department, the F irst Peoples Hospital of Xiaoshan Hangzhou, Zhejia

2、ng 311200, China Abstract ObjectiveTo investigate the expression of scavenger receptor_BI (SR_BI) in HL_1 cells.Methods The expression of SR_BI in HL_1 cells was detected byreal time PCR and the expression of SR_BI on HL_1 cells was measured by FACS.ResultsThe mRNA expression of SR_BI in HL_1 cells（

3、1.000.03）increased signifi cantly （P0.01）when compared with HEK293 cells（0.070.02）. Comparedwith protein expression of SR_BI on HEK293 cells （0.040.02）% and on HL_1cells incubated with secondary antibody （0.400.05）%, the protein expressio n of SR_BI on HL_1 cells （11.100.71）% increased significantly

4、（P0.0 1）. Conclusions SR_BI can be detected in HL_1 cells and probabl y play a role in anti_atherosclerosis. Key words Scavenger receptor; HL_1 cells; Rats 冠状动脉粥样硬化性疾病已成为人类主要的致死因素之一，它通常起源于脂肪在动脉管 壁的沉积和斑块的形成。清道夫受体（SR）是一类细胞表面糖蛋白，通过氧化或乙酰化识别 低密度脂蛋白在脂代谢和动脉粥样硬化的发生发展过程中起着重要作用。依据它们的结构 特征已发觉的清道夫受体分为A、B、C三大类型，

5、清道夫受体BI（SR_BI）被确认为氧化低密 度脂蛋白受体，SR_BI能与氧化低密度脂蛋白相互作用，而且能与正常低密度脂蛋白和高密 度脂蛋白相互作用，在动脉粥样硬化的主动脉内膜上发觉有SR_BI的mRNA表达，表明白SR_BI 在介导动脉壁上胆固醇流淌的潜在作用1。本试验通过检测SR_BI在小鼠HL_1心肌 细胞的表达，了解小鼠HL_1心肌细胞是否参加冠状动脉粥样硬化形成过程中的胆固醇代谢。 1 材料和方法 1.1 细胞培育和处理：小鼠心肌细胞株HL_1心肌细胞保持了成年鼠心肌细胞的生物学特征 ，由德国U.Rauch教授赠予。培育基（Claycomb medium）含10%胎牛血清，0.1mm

6、ol/L肾 上腺素（Sigma），2mmol/L L_谷氨酸（Invitrogen）以及1倍的抗生素液。全部的培育皿及 培育板均预先在0.1%明胶37孵育半小时。 人胚肾293细胞（HEK293 cells）是目前最常用的工具细胞，且不表达SR_BI。RPMI 1640培 养 基含10%胎牛血清，1倍的抗生素液。HL_1心肌细胞生长至80%汇合状态后以每孔3105种 入6孔板中，HEK293细胞生长至80%汇合状态后以每孔2105种入6孔板中，生长至汇合状 态后分别收集两种细胞打算下一步试验。 1.2 探讨方法：实时定量PCR测细胞内SR_BI基因拷贝数，采纳Trizol法分别RNA，应用大

7、容量cDNA反转录试剂盒（Applied Biosystems）合成基因组DNA。总反应体积为25l,其中 含上游引物及下游引物各1l,SYBR green定量PCR预混液12.5l,无菌去离子水5.5l, 基因组DNA或标准 质粒5l。反应条件：50激活2分钟后95激活10分钟，进行40个循环的扩增，每一个循 环包括95 15秒，60 1分钟，最终一个循环完成后加以额外95 15秒及55 15秒孵 育。应用甘油醛_3_磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参照。引物设计：人L32上游引物5_AGGAG AGACACCGTCTGAACAAG_3；下游引物5_GAACCAGGATGGTCGCTTTC_3

8、。小鼠L32上游引物5 _TGCCCACGGAGGACTGACA_3；下游引物5_AGGTGCTGGGAGCTGCTACA_3。人SR_BI上游引物5 _GGGCTCTTCACGGTGTTCA_3；下游引物5_TGAGCCCGTTCCACTTGTC_3。小鼠SR_BI上游引 物5_AGAACCGCAGCCTCCCATTT_3；下游引物5_GATGTTAGGCAGTACAATGTAGTC_3。反应在 7900HT快速实时PCR仪中进行，用96孔PCR板，每板上设SR_BI标准质粒组、样 品组及NTC阴性比照组，检测达到设定的荧光强度时所进行的PCR反应循环数（CT值）。依据 质粒标准品的检测结果

9、，得到拷贝数CT值标准曲线，再依据每份标本的CT值与标准曲线进 行比较，从而确定其标本所含的基因拷贝数。 流式细胞术检测细胞上SR_BI的表达，离心 细胞悬液(5min,2500rpm)，将细胞重悬于100l 1x一抗溶液（兔抗SR_BI多克隆抗体1100 稀释于PBS中，其中含1%牛血清白蛋白和2%胎牛血清）中，4避光孵育60min后PBS冲洗三 遍，然后，将细胞重悬于100l 1x二抗溶液（FITC结合的山羊抗兔免疫球蛋白1100稀释 于PBS中，其中含1%牛血清白蛋白），最终，细胞重悬于300l PBS中，在流式细胞仪上进 行检测。仅与二抗孵育的HL_1心肌细胞作为阴性比照。 1.3 统

10、计学处理：采纳SPSS11.5版统计软件进行数据统计分析，数据用（xs）表示，进行t检验，P0.05为差异 有统计学意义。 2 结果 2.1 实时定量PCR检测细胞内SR_BI基因拷贝数：HL_1心肌细胞内SR_BI为（1.000.03 ）；HEK293细胞内SR_BI为（0.070.02），两者比较差异有统计学意义（P0.01 ），见图1。 2.2 流式细胞术检测细胞上SR_BI的表达：HL_1心肌细胞上SR_BI的表达为（11.100.7 1）%；HEK293细胞上SR_BI的表达为（0.040.02）%，二抗孵育的HL_1心肌细胞上SR_BI 的表达为（0.400.05）%。两者SR_B

11、I的表达比较，差异有统计学意义（P0.01），见 图2。 3 探讨 本试验结果表明小鼠HL_1心肌细胞表达SR_BImRNA及蛋白。SR_BI是一种能够与多种脂蛋白 结合的受体，最初发觉SR_BI主要作为HDL受体促进胆固醇在肝脏的摄取并转运至HDL而发挥 抗动脉粥样硬化的作用2，探讨表明SR_BI同样可作为低密度脂蛋白（LDL）和氧 化修饰的LDL受体并与其相结合而促进代谢3。 动脉粥样硬化的形成过程中内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞之间的相互作用发挥着重要作 用，动脉粥样硬化的进展是一种累及这些细胞的坏死和凋亡的慢性炎症性疾病。除参加胆固 醇的转运外，SR_BI还参加了抗氧化剂维生素E的摄取

12、4,5、NO介导的血管舒张 6,7和凋亡细胞的清除8。HDL可募集内皮祖细胞并通过SR_BI促进内皮细 胞的修复9。SR_BI的缺乏减弱了凋亡物质的清除，从而促进细胞间的炎症反应及 动脉粥样硬化的进展。 在冠状动脉粥样硬化的发展过程中，单核细胞粘附到受损的内皮细胞上，并从内皮细胞之间 移行到内膜下分化成为巨噬细胞，最终转变为泡沫细胞形成粥样硬化病变的脂质条纹。单核 细胞并不表达SR_BI，但当单核细胞分化成为巨噬细胞后，SR_BI可表达于动脉粥样硬化斑块 中的巨噬细胞上，而过氧化物酶增殖物激活受体的激活可诱导SR_BI的表达10。血管惊慌素明显抑制内皮细胞上内源性的SR_BI的表达。小鼠的在体

13、试验探讨亦表 明骨髓源性细胞可表达SR_BI，并通过促进胆固醇内流至HDL而预防动脉粥样硬化的进展11 。过多脂质沉积和游离脂肪酸氧化具有心肌细胞毒性并导致心肌细胞功能紊乱。 本文表明小鼠HL_1心肌细胞表达SR_BI，说明小鼠HL_1心肌细胞可能参加了冠状动脉粥样硬 化形成过程中的胆固醇代谢，并发挥抗动脉粥样硬化作用，但详细机制尚待进一步阐明。 参考文献 1Ji Y, Jian B, Wang N, et al. Scavenger receptor BI promotes high d ensity lipoprotein_mediated cellular cholesterol eff

14、luxJ. The Journal of bio logical chemistry,1997,272(34):20982-20985. 2Trigatti B, Rigotti A, Krieger M. The role of the high_density lipoproteinreceptor SR_BI in cholesterol metabolismJ. Current opinion in lipidology,200 0,11(2):123-131. 3Gu X, Lawrence R, Krieger M. Dissociation of the high density

15、 lipoprotein a nd low density lipoprotein binding activities of murine scavenger receptor classB type I (mSR_BI) using retrovirus library_based activity dissectionJ. TheJournal of biological chemistry,2000,275(13):9120-9130. 4Tachikawa M, Okayasu S, Hosoya K. Functional involvement of scavenger rece

16、p tor class B, type I, in the uptake of alpha_tocopherol using cultured rat retina l capillary endothelial cellsJ. Molecular vision,2007,13:2041-2047. 5Goti D, Hrzenjak A, Levak_Frank S, et al. Scavenger receptor class B, typeI is expressed in porcine brain capillary endothelial cells and contribute

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