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1、 细胞衰老概括【引言】人体衰老的实质即为细胞衰老，当前科学家无不探究着生命的奇迹意欲找出防止细胞衰老而延缓生命的方式，然而细胞衰老一方面对人体有着不可替代的作用，领一方面 又不为人们所接受。 【The advantage of cell senescence】1.细胞衰老可抑制肝脏纤维化 人类繁殖后期（postreproductive）的生命通常与衰退、能力丧失联系在一起，细胞中称为衰老（senescence）的状态，即细胞衰老与此相似。然而近期来自美国冷泉港实验室、霍德华休斯医学院、巴西圣保罗大学研究人员发现一类特殊的衰老肝脏细胞能调控活体小鼠中一系列的生命活动，抑制纤维化（fibrosis
2、）这是肝脏遇到急剧伤害的时候作出的自然反应。 这一惊人的发现是由这一研究团队去年将肝脏细胞衰老与抵抗肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的器官功能联系在一起的技术获得的。这一研究成果公布在8月22日的细胞（Cell）1杂志上。 这项研究成果首次证明了细胞衰老在非癌症性病理中的特殊作用，CSHL研究小组认为这有助于针对一些严重肝脏疾病的前体，譬如肝硬化提出新的治疗方法肝硬化是美国第12种最常见的致死疾病。 在2003年Scott W.Lowe博士等人就发现细胞衰老机制会让癌细胞停止生长，并且他们成功的让癌细胞在进行治疗后处于无法复制的细胞衰老阶段，并显现出良好的效果。
3、在那项研究中，研究人员还进一步找出了这个使细胞停止生长的分子机制，即细胞衰老是由于一些特殊的染色体区域被紧密的包裹在异染色质内所致。研究人员将这些新发现的区域命名为“衰老相关异染色质基因座”（senescenceassociated heterochromatic foci，SAHF）。 去年研究小组又发现诱导衰老的细胞衰老能够有效预防自发性癌症。衰老细胞有异常染色体，上面携带机能不良的端粒和较短的末端，在肿瘤抑制子p53缺失时促进肿瘤发生，可能与老年人癌症高发性有关。研究人员认为衰老途径的活化，足够抑制原发性肿瘤，说明通过阻止细胞增殖，p53介导的衰老是抑制衰老细胞形成肿瘤的一个重要机制。
4、而近期Lowe研究小组的有关肝脏疾病的相关衰老研究分成了两个不同的方向：哪些伤害对于肝脏组织而言是急性，哪些则是慢性，这种对照性的实验有助于发现衰老是如何帮助抑制损伤的，以及衰老过程是如何和何时被肝脏受到的慢性伤害“打垮”的。 在针对第一项的研究中，研究人员对小鼠肝脏施用一种毒素急性伤害，发现了与之前实验的一致的结果：在细胞纤维化增多之后， 出现肝细胞死亡（纤维化是小鼠，人类中都存在的应对组织损伤的一种天然反应）。之后的研究就越来越有趣了，Lowe博士说，“我们观测到肝脏星状细胞（Hepatic stellate cells，HSC）出现增殖激增之后，我们发现这些细胞为了避免更多纤维化反应，最
5、终走向衰老，从肝脏中清除了出去。” 而在慢性伤害的实验中比如由酒精中毒，慢性肝炎，或者脂肪肝引起的肝脏伤害，研究人员发现相对于清除，小鼠会产生更多的衰老细胞，Lowe认为，这导致“持续性炎症反应， 以及增加的纤维化”这是一种在一些病例中导致癌变的状态。 从这两种实验结果来看，研究人员认为，对于慢性伤害，纤维化如何导致肝硬化是遗传突变，以及其它引发肝癌的细胞转化的一个诱导条件（predisposing condition）。而急性伤害实验则表明未来针对刺激免疫细胞（靶向纤维损伤的衰老细胞）的治疗，也许对于患有急性肝脏损伤的病患提供一种有效的治疗方法，尤其是哪些早期受到了短期毒性成分的影响的肝脏损
6、伤。2.细胞衰老对肿瘤的促进作用 肿瘤是一种典型的年龄相关性疾病，多在老年人发生2,3，1961年Hayflick在对体外培养细胞研究中发现细胞有增殖极限的现象，称之为细胞衰老。目前研究细胞衰老大多集中在对细胞周期机制、自由基及DNA损伤与衰老的关系、衰老的端粒学说、线粒体与衰老、衰老相关基因和长寿基因、细胞信号转导等方面。在对肿瘤和衰老的研究中，人们发现二者的形成过程似乎有一个此消彼长、相互排斥的关系，细胞的衰老可能成为肿瘤形成的天然屏障。大量证据已经显示，细胞除了可以通过凋亡或自杀来抑制肿瘤形成外，还可以通过衰老阻止细胞分裂，进而抑制肿瘤(1)细胞衰老抑制肿瘤发生发展的主要途径 细胞衰老抑
7、制肿瘤发生发展的机制主要有两方面4：端粒途径，主要依赖于P53信号通路；以积累性应激损伤为主的P16RB通路及非端粒途径的P53通路。研究认为5，端粒缩短启动衰老是ATM/ATRP53P21通路调节的DNA损伤反应。在衰老机制中，端粒的作用仅是一方面，除此之外尚存在其他多种非端粒信号通路，如应激引起的信号通路、癌基因及有丝分裂原通路等。其中癌基因诱导细胞衰老与肿瘤的关系成为研究者关注的热点。(2)癌基因诱导细胞衰老的研究 (2).1 癌基因诱导细胞衰老的既往研究 Serrano等6通过实验发现，用HRas(V12)可诱导啮齿动物和人类细胞早衰，因为Ras信号分子存在于RafMekErk通路上，
8、故此通路中的其他信号分子，如Raf、Mek等亦可诱导细胞衰老。后来Zhu等7在人肺成纤维细胞实验中，通过活化Raf1导致了细胞短暂而不可逆的增殖抑制和早衰反应。他们还发现Raf1引起了RafMekErk激酶级联反应，其结果是P16INK4a表达增加、细胞增殖抑制及细胞衰老。后来较多实验810也证实了此观点，即体外培养的细胞可以在癌基因诱导下发生衰老。 (2).2 癌基因诱导细胞衰老的新近研究 由于以前的研究仅限体外细胞培养，近期报道3,1115显示，该方面的研究已经深入到体内实验。Collado等12用KrasV12癌基因在大鼠体内复制了多发性肺腺瘤及腺癌模型，在腺瘤中检测到几种衰老标志物，而
9、腺癌中则缺乏。进一步他们在皮肤及胰腺组织实验中，得出了相同结论，即内源性癌基因Ras相关肿瘤的癌前病变中，有衰老细胞存在，而相应的恶性肿瘤中几乎没有衰老细胞。同时，用基因芯片对一系列基因进行检测后发现，这些基因的表达与ERK蛋白诱导衰老高度相关，检测到的衰老相关分子标记有P16INK4a、P15INK4b（CDKN2B）、Dec1（BHLHB2）、Dcr2（TNFRSF10D）以及经典的细胞衰老标志物SA Gal（衰老相关半乳糖苷酶）和HP1(衰老相关异染色质灶)。因此，研究者认为，癌基因诱导衰老的效应分子P16INK4a或P53存在于癌前病变中，癌组织中则缺失，而且没有衰老细胞存在。 BRA
10、F癌基因是MAPK信号传导通路上Ras下游的传递因子，主要存在于神经来源的肿瘤组织，如良、恶性黑素细胞瘤、甲状腺瘤、卵巢癌等。Michaloglon等13在良性黑素细胞瘤实验中，探索衰老与肿瘤的关系时发现，在培养的人黑素细胞及成纤维细胞中，突变基因BRAFV600E可导致短暂的细胞增殖，随后引起细胞衰老及P16表达增加。这种衰老样细胞周期抑制可被病毒癌基因SV40大T抗原所拮抗，其机制可能与SV40大T抗原使P53或Rb失活有关。另外发现痣中的P16表达具有异质性，且其消除对衰老毫无影响，这些细胞中也没有明显的端粒缩短现象，这提示在没有端粒及P16参与的情况下，可能还有其他导致细胞衰老的机制存
11、在。 Pten是存在于许多肿瘤中的抑癌基因，在敲除Pten基因的鼠前列腺实验中，Chen等14发现在癌前病变或低度恶性肿瘤组织中有衰老标志物的表达，而高度恶性的肿瘤组织则没有表达。对这些Pten缺陷的动物细胞进行培养，能使其进入衰老状态，但又可以被P53失活所逆转，说明Pten缺陷时P53参与了细胞衰老抑制肿瘤这一过程。这一结论与以前发现的人早期前列腺癌表达衰老标志物，而高度恶性癌不表达衰老标志物相一致。 Suv39h1是一种组蛋白甲基转移酶，在衰老细胞中可以使促生长基因的异染色质沉默。Braig等15在持续表达致瘤性Ras（EuNRas ）的EuNRas鼠淋巴瘤的研究中发现，淋巴瘤细胞对化疗
12、药表现出衰老反应，而当Suv39h1缺陷时，则未见衰老反应。因此证实，Ras诱导的细胞衰老可以抑制淋巴瘤的形成和发展，但必需Suv39h1的参与。而且实验结果显示，在Rb促细胞衰老过程中，亦需Suv39h1参与，如果其缺陷，Rb则不能促进细胞衰老，可能与生理情况下Suv39h1与Rb结合导致DNA包装异常有关。以往实验1215中研究者均发现，癌基因诱导的细胞衰老主要存在与癌前病变中，它可以阻止癌前病变向恶性肿瘤进展，进一步证实，癌基因活化后可诱导癌前病变中的细胞衰老，细胞衰老可以做为防止细胞增殖和肿瘤发生发展的有效途径。另外，衰老是有分子异质性的，对于不同的刺激物，不同类型的细胞，细胞衰老将经
13、历不同的途径。(3)临床方面 临床上也有关于细胞衰老与肿瘤关系的一些研究，如Poele16等对曾进行过化疗的乳腺癌患者的肿瘤标本进行免疫组化染色后发现，SA Gal、P53及P16INK4a表达均增高，而在未经化疗药物治疗的肿瘤组织及瘤周正常组织中表达相对较低。之后，Roberson等在实验中亦证实了此观点。临床研究表明，肿瘤细胞中的不同衰老调控基因的表达对应了不同的预后，清楚的了解这些基因表达情况及其调控机制将有助于制定新的肿瘤化疗方案，以提高治愈率和降低副作用。(4)癌基因诱导细胞衰老抑制肿瘤的主要机制 癌基因诱导衰老主要涉及两个细胞信号通路，ARFP53P21和P16INK4aRb通路1
14、1。p53和Rb基因是最重要的两个抑癌基因，也是最主要的衰老调控因子。既往研究肯定了P53能够调控肿瘤细胞的凋亡，新近研究显示，高度活化的p53也可以促进细胞衰老18。许多研究认为，P53在促进细胞衰老中可以上调P21,后者通过抑制CDK2/Cyclin E及CDK4/Cyclin Ds等细胞周期调节因子的活性来抑制细胞增殖。另外，CDKs的活性抑制还可以引起pRB的低磷酸化，促进细胞衰老。调节P53的因子很多19，正性调节因子如ARF（在人和鼠分别是P14ARF和P19ARF）、PML、PTEN、NPM及P33ING1，负性调节因子有E3泛素连接酶MDM2、PIRH2和COP1。除p53外，
15、Rb也是调节衰老的一个重要因子，但此方面的研究相对较少。但目前已知，上调Rb的因子包括P16INK4a和上游调控分子Bmi1、CBX7、ID1、Tts119，下调因子有P21及P27等9。(5)细胞衰老对肿瘤的促进作用 拮抗性多效（antagonistic pleiotropy）进化理论认为，衰老在早期可以保护机体不致于发生肿瘤，而到老年期则促进衰老表型，促使肿瘤形成1。细胞分裂达到一定限度时，就进入衰老阶段。尽管衰老的细胞不能像正常细胞一样增殖，但是它们仍然保持着代谢活性，并且还可以产生具有抑制和促进肿瘤生长的活性蛋白质。衰老细胞随着增龄而积累，产生胞外基质重构酶、炎性细胞因子及上皮生长因子
16、等。这些因子能够破坏局部组织微环境、刺激邻近细胞增殖和恶性进展，较多研究2023都证实了此观点。所以肿瘤的发生既可因衰老不足，也可因衰老过度而发生，如何平衡两者之间的矛盾，值得进一步深入研究。 癌前病变是一个细胞病理学概念，是一类具有细胞不典型性和分化异常的增生性病变。癌前病变具有和肿瘤相类似的生物学特征，如基因异常改变、细胞凋亡功能失常和细胞表型异常，因此，它有发展成肿瘤细胞的潜在趋势。但是，与恶性肿瘤不同，癌前病变仍然属于良性病变，并且可以停止发展、甚至逆转。癌前病变的一个显著特征是由癌基因诱导的细胞衰老，给肿瘤发展过程设置了障碍。而当机体发展到恶性肿瘤后，似乎衰老已经无能为力。因此对癌前
17、病变中细胞衰老的研究尤为重要，对肿瘤的防治将有深远意义。衰老标志物可作为肿瘤早期标志物，对这些标志物的检测将有助于肿瘤的分子病理学诊断。但是，在复杂的研究背后，仍然存在一些问题，如癌基因可以诱导衰老也可以导致癌前病变，但是其导致癌前病变早还是引起衰老更早，即二者孰因孰果值得探究，甚至是否可以认为肿瘤本身就是衰老的一种表现癌前病变，只有少数发展为恶性肿瘤，而大部分将处于静止或逆转，细胞衰老如何影响它们的转归，这些问题都值得进一步研究探讨。【The study concerned with cell senescence】1.天然脑活素促细胞增殖和抗细胞衰老作用 衰老（senescence）是细胞
18、的重要生命现象之一，绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，当其经过一定的倍增之后，将进入终末增殖状态，称为细胞衰老。一般来讲，人类胚胎的成纤维细胞在达到衰老时，能够复制 50 代左右（Population Doublings, Pds），由于这种衰老是由分裂传代而达到的，故又称之为复制性衰老（replicative senescence）24。探讨细胞衰老的分子机理是人类认识自我研究的重要组成部分，从分子水平研究衰老过程中基因及调控变化，已成为目前衰老机理研究的主要方向，同时研究开发延缓衰老的药物将为提高人类生存质量提供重要保证，也为衰老相关疾病的防治提供理论基础和实验依据。 天然脑活素为
19、结合临床经验和现代药效学正交实验优化筛选而成，在以往基础上以人胚肺二倍体成纤维细胞（MRC-5）为研究对象，观察天然脑活素对 MRC-5 细胞表型、细胞代龄、传代速度、细胞生长增殖能力及衰老相关指标的影响，探讨其延缓 MRC-5 细胞复制性衰老的作用及其机理。 光镜下观察 MRC-5 细胞衰老表型，常规计数细胞代龄、传代速度， MTT 法检测细胞增殖活度，X-Gal 染色法观察细胞衰老情况，计数衰老细胞百分率。 结果显示：天然脑活素可维持细胞的非衰老表型，增加 MRC-5 细胞代龄，天然脑活素 孵育 MRC-5 细胞的细胞增殖能力较空白老龄对照组明显升高（P 0.05），细胞的增殖速度显著加快
20、。另外，天然脑活素连续培养的细胞在老龄阶段衰老细胞数显著低于老龄对照细胞（P 0.01）。初步证实天然脑活素可通过促进细胞增殖速度，进而延缓 MRC-5 细胞的复制性衰老，为中药延缓衰老开辟了新的研究途径。 绝大多数正常人类细胞在体外组织培养的序列传代过程中，逐渐丧失其增殖传代的能力，最终达到一种不可逆的增殖停滞状态，并可保持代谢活力的稳定，能够维持数月甚至数年。这种似乎是无限期的增殖停滞状态被命名为衰老（senescence），而细胞达到衰老状态时的传代次数称为寿限24，25。衰老是由细胞所经历的传代次数决定的，而与时间无关。体外细胞的衰老与体内组织的衰老有直接的相关性26，27 人二倍体成
21、纤维细胞（human diploid fibroblasts, HDFs）一般没有端粒酶活性，所以当端粒 DNA 长度丢失达到临界长度时，染色体变形急剧增加，染色体间发生融合， 细胞不再增殖，从而导致细胞衰老、死亡28，故常常被作为衰老研究的理想模型。衰老细胞除了不能复制传代之外，还表现出一系列生理学、形态学和多种分子生物学的改变，如形态大小不规则，胞浆内颗粒性物质累积，细胞排列散乱，培养基中多见细胞碎片，细胞失去融合能力、缝隙连接减少等2931。 天然脑活素作用于正常衰老型成纤维细胞，通过测定衰老细胞的百分比，与老龄对照组细胞相比衰老细胞数目明显减少，衰老细胞百分比显著降低，提示天然脑活素可
22、延缓衰老细胞的群体死亡的发生，从而延长细胞的体外寿命。总之：天然脑活素可升高 MRC-5 细胞增殖能力，有效延缓细胞的复制性衰老。2.线粒体与衰老的关系 线粒体作为真核细胞中一种重要而独特的细胞器,其性状改变与人的衰老和疾病密切相关,甚至被称为衰老的生物钟。自1989年Linnane等提出线粒体衰老假说以来,人们越来越关注线粒体与衰老的关系。 因线粒体一些特有的特点,如生命周期有限,具有高的更新率;形态、大小、数量和分布,常因细胞种类不同而异;线粒体DNA(mtDNA)与核DNA不同,是多拷贝的且具有异质性等,到目前为止,虽对衰老中线粒体的改变有一些研究报道,但结果并不一致,缺乏较系统的研究。
23、关于人衰老中线粒体的一些变化并无定论,线粒体衰退与机体的衰老二者的因果关系也有待于进一步探讨。机体的衰老来源于细胞的衰老,对二倍体细胞的研究有助于衰老机理的探讨。通过对二倍体细胞衰老中线粒体变化的研究,有助于探讨线粒体与衰老的关系,进一步弄清线粒体在衰老中的作用。这些研究将对衰老指标的测定,抗衰老药物研究及措施的评估有重要意义。通过建立细胞衰老模型,从二倍体细胞衰老过程中量与功能变化相结合来探讨线粒体与衰老的关系。 一.人胚肺二倍体细胞W1-38的培养 近年来应用人胚肺二倍体细胞W1-38作为衰老研究的体外模型,己得到了国内外研究工作者的肯定。细胞从20代传至约50代;定期冻存;隔期拍照记录生
24、长状态;计数板计数;MTT测定细胞活力。 观察发现,年轻细胞平均两天呈致密单层,细胞长梭形,排列成束状,折光度好,立体感强;每瓶细胞数为68105;衰老细胞形成单层时间明显延长,细胞圆缩蜕变,可呈菱形、三角形,折光度下降;每瓶细胞数为46105。晚期细胞活力明显低于早期。 二.衰老中线粒体质和量改变的研究 线粒体形态因外界环境和功能改变而异,线粒体形态变化可作为衰老研究的参考之一。收集固定细胞,制成切片,电镜观察线粒体三维结构和内部结构。线粒体的数量在不同细胞中差异很大,同时与细胞的功能状态是相关的。3.皮肤衰老与细胞衰老 皮肤衰老是机体衰老的重要外在表现之一，已引起老年学和皮肤科学的重视。体
25、外的皮肤细胞衰老可部分反映机体皮肤老化状况。同时角质形成细胞在皮肤衰老中的作用也逐渐引起人们的重视，因为表皮角质形成细胞在皮肤衰老过程中的重要作用如同真皮成纤维细胞一样日益受到关注。加速有关皮肤衰老的研究可为阐明皮肤衰老机制、为老年皮肤病学的发展提供科学依据，进一步指导临床用药和皮肤疾病的防治。 衰老是指随着时间的推移所有个体都将发生的功能性和器质性衰退的渐进过程。这种退行性变化可归因于内源性(基因调控)和个体反复暴露于环境中各种有害因素的综合作用的结果32。人们对系统器官方面的衰老表象研究较多，已引起老年学研究工作者的重视。 (1)皮肤衰老衰老是指机体器官对环境改变适应性随年岁增长逐渐下降，
26、进而易患疾病或引起死亡。衰老部分是由机体预定的基因程序进行调控的；部分由内外：“磨损和消耗”所引起，同时表现于细胞和分子水平。皮肤可为研究衰老提供良好的场所，因为它浅表外露，有利于在分子和细胞水平上研究机体的衰老32,33。皮肤衰老主要为自然衰老和光老化两种形式，所谓自然衰老(intrinsic aging)系指由于机体内在因素的作用(主要为遗传因素)引起，见于暴露部位和非暴露部位，明显特征为皱纹的出现和皮肤的松弛。而光老化(photoaging)则指皮肤衰老过程紫外线损害的积累，是自然老化和紫外线辐射共同作用的结果，表现为皮肤暴露部位粗燥、皱纹加深加粗、结构异常、不规则性色素沉着、血管扩张、
27、表皮角化不良、出现异常增殖、真皮弹力纤维变性及降解产物蓄积等33,34。由此可见，自然衰老与光老化有一定的差异。皮肤衰老表现为表皮更新减慢、屏障功能减弱、角质形成细胞活力下降、表皮受伤后修复能力减弱。具体而言，表皮厚度改变不明显，但角质层的屏障功能下降：表皮使用50的氢氧化氨处理，则衰老皮肤产生小水疱为特征的初始反应时间缩短。表皮持续更新并维持机体与环境联系，以保持机体结构的完整。在完整的表皮，基底角质形成细胞中的角蛋白中间丝与基底层的致密斑相连。中间丝插入到具有大疱抗原(BP230、BP180)高密度的半桥粒致密斑中，半桥粒富含层粘蛋白和Nidogen，发出锚定纤维(anchoring fi
28、brils)平铺在透明层，直达致密层。致密层中富含型胶原和硫酸乙酰皮肤素，通过型胶原的锚定作用与间质胶原纤维相连。角质形成细胞经历复杂而又是预定的程序进行分化35。如果此过程出现障碍，则导致机体各种各样功能减弱，衰老过程中由于自由基及过氧化作用使胶原表面形成AGE(终末糖化产物)而过度交联，使皮肤半桥粒结构失去弹性，表皮真皮连接变平，皮肤变得松弛、失去弹性3436。真皮衰老表现为真皮对外来化学物清除力下降，真皮厚度变薄、胶原蛋白和弹性蛋白合成减少、分解增加，分解酶活性增强。皮肤作为重要的代谢器官，衰老时许多代谢酶类活性下降32,34。另外，、型胶原比值在衰老过程中逐渐倒置，胶原逐渐变粗、出现异
29、常交链，主要归因于衰老有关的组氨酸、丙氨酸交链键增加，同时非酶糖化的增多也是引起胶原异常交链出现的原因之一。真皮厚度变薄，胶原含量减少，特别是可溶性胶原含量下降明显，弹性蛋白含量上升；胞外间质中透明质酸和硫酸皮肤素含量明显下降，糖胺多糖总含量下降。此外，胶原纤维和弹性纤维排列也渐趋紊乱。其生理结局使老年皮肤失去增殖能力，其抗剪切力减弱。郎格汉斯细胞和黑素细胞数目明显下降、脂褐质明显增加，呈现出老年斑和 其他色素沉着症状。皮肤衰老也表现在皮肤功能方面，如温度调节、受伤后表皮重建能力、免疫反应、感觉能力、汗腺和皮脂腺分泌、维生素D3合成能力和血管反应性等多方面功能降低，这样导致老年人对紫外线、变应
30、原敏感，它们不仅是皮肤衰老的结果，反过来也进一步促进皮肤衰老3234。皮肤衰老的机制非常复杂27。在细胞、分子水平，可表现为染色体端粒缩短，DNA甲基化水平下降，EGF等生长因子及其受体或其它生长、抑制相关基因(如RB、fos、jun、GADD153)数量、功能的变化，对外界反应性逐渐降低，皮肤细胞增殖分化能力进而减弱、新陈代谢减缓，皮肤呈现出衰老外貌。 (2)皮肤细胞衰老皮肤表象的衰老反映在细胞水平即为细胞衰老(cell senescence)，细胞衰老是指正常细胞只有一定的生命周期而不能进行无限增殖。衰老细胞具有下列特征38,39：细胞衰老的明显特征是细胞内容物、代谢和形态学改变。衰老细胞
31、尽管丧失合成DNA和细胞增殖能力，但仍具有一定代谢活性。细胞变大、核增大，蛋白含量、脂质、核RNA含量增加，同样胞外基质也增加。细胞衰老是一种优势现象，年轻细胞和年老细胞的细胞融合实验证实衰老占主要过程，即杂合子细胞表现为衰老细胞，其可能的原因为年老细胞的细胞因子或其他成分阻止年轻细胞合成DNA，使细胞的生长停止。人们得出结论衰老细胞的生长停止是一种由衰老有关基因事先决定的现象。细胞衰老是一种不可逆的过程。除非用肿瘤病毒DNA进行转化则可逆转，少数细胞渡过一定的“危机”之后被转化变成不死细胞。这表明细胞衰老是细胞转化的逆过程，与终末分化相类似。衰老细胞不能进行DNA合成而导致生长的停止，这样人
32、们推断衰老 细胞中存在DNA合成抑制因子。体外实验研究表明，皮肤细胞的培养时间长短和增殖速率与供体的年龄成反比32,34,40。同时表现在对外界有丝分裂原的反应性、克隆形成能力和产生自体和旁分泌生长因子能力下降 ，对其抑制信号反应(如干扰素)增强。(2).1成纤维细胞衰老因为成纤维细胞具有易获取、易培养的特点，在皮肤衰老中研究较多。许多体外实验研究表明，成纤维细胞在衰老过程中I型胶原表达减少，其中转化生长因子(TGF)起十分重要的作用。随着细胞传代次数的增加，I型胶原和TGFmRNA表达均下降62，TGF受体、的mRNA表达下降59，TGF与受体结合力也随之下降41。同时衰老细胞中间质胶原酶(
33、MMP1)、间质溶解酶(MMP3)的诱导能力上调，引起胶原等间质蛋白分解增强42。衰老的成纤维细胞产生的Fas蛋白表达增加23倍，导致 凋亡的发生。有关光老化方面的结果也与此一致，老年人来源的比年轻人的来源的细胞、新生儿来源的比年轻人来源的细胞、太阳暴露部位比非暴露部位来源的细胞的体外倍增次数明显减少、对生长因子等生长刺激因素的反应力减弱、细胞表面的受体也减少、配体受体结合后磷酸化能力也减弱等等33,43。有研究报道44，UVA作用于成纤维细胞后使IL1的表达增加，诱导IL6的表达增多，从而导致间质胶原酶的分泌增加，引起皮肤间质胶原的分解增多，在光老化中起十分重要的作用。(2).2角质形成细胞
34、衰老人们在研究机体衰老和皮肤衰老时，多侧重于皮肤成纤维细胞衰老的研究。近年来，逐步认识到角质形成细胞在皮肤衰老中也起着十分重要的作用。角质形成细胞培养可在体外进一步分化方法的成功建立以及分子生物学的发展，可提供纯的角质形成细胞来进行增殖和分化因子的研究，并可分离和纯化这些蛋白质和基因。体内外角质形成细胞突变蛋白的研究可为探明衰老的发生和诸多皮肤病的成因提供新的思路和方法。增殖仅限于表皮的基底层，但随着细胞从基底层向颗粒层、角质层推进过程中进行分化。分化过程与许多蛋白质的改变有关。K5、K15角蛋白表达见于基底层，而在颗粒层为K1、K10 形成角质包裹层45。角质形成细胞自然衰老时，分化相关的S
35、PR2(一种富含脯氨酸小分子蛋白)和IL1ra(白介素1受体拮抗物，具有竞争性抑制IL1、的作用)基因表达显著增加，原癌基因cfos基因表达减少46。培养的新生儿角质形成细胞cfos基因表达很弱，经生长因子刺激后迅速和大量表达；成人角质形成细胞也能诱导，但其强度弱得多。同样cmyc基因在40岁以上年龄者的表达水平比新生儿和年轻人表达低，EGFr(表皮生长因子受体)的mRNA在新生儿中刺激前也表达，且经刺激后表达迅速增加，成人细胞增加不明显。GADD(Growth arrest and DNA damage gene)基因mRNA在各种培养细胞中都表达，刺激后2小时新生儿的下调水平比成人大，成人
36、角质形成细胞在加入生长因子后14小时表达迅速增加并达最高水平，而新生儿生长因子刺激后24小时才表达，48小时达到高峰47。可见在角质形成细胞衰老过程中增殖有关的 基因表达迟缓，而损伤有关基因表达增加。机体皮肤角质形成细胞在紫外线照射后，fasmRNA及其蛋白质表达增加、且维持时间延长，这些结果表明fas系统在皮肤光老化过程中起着十分重要的作用。光老化过程中cfos基因的诱导增加；而此基因在自然老化过程中表达减少。光老化进程中IL1ra表达下降，在自然老化时增加。细胞分裂相关基因SP R2诱导也减少，自然老化时增加48,49。角质形成细胞衰老在皮肤衰老中的作用已越来越受到人们的重视，因为它在皮肤
37、保水、保湿、屏障以及皮肤病形成等多方面具有非常重要的调节作用。角质形成细胞衰老的基因表达改变明显，首先，G蛋白亚单位的活性和构成有变化，然后通过PKC、PTK等信号传导途径，影响原癌基因/抑癌基因的表达 ，最后影响角质形成细胞的增殖和分化。总之，皮肤衰老的研究，特别是有关皮肤自然衰老的研究并不深入，对其发生、发展的机理了解不多。皮肤衰老的预防和治疗仅仅以维甲酸为主，应当承认维甲酸在治疗皮肤光老化和角质过度增生性疾病具有一定的效果，可以降低皮肤表面的粗糙度、减少皱纹、降低皮肤的色素沉着，在组织学上可 增加颗粒层的细胞层数、增加表皮厚度50。但是对皮肤的自然衰老疗效不显著。加速有关皮肤衰老的研究不
38、仅可以阐明皮肤衰老的机制，同时也为老年皮肤病学的发展提供科学依据，可进一步指导临床用药和皮肤疾病的预防。4.双歧杆菌脂磷壁酸延缓细胞衰老的作用机制 为了探讨双歧杆菌脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）在延缓H2O2诱导细胞衰老中的作用，用H2O2诱导WI 38细胞衰老，半乳糖苷酶细胞化学染色计算衰老细胞百分率变化，RTPCR和Western印迹检测衰老细胞p21、细胞周期蛋白E（cyclin E）和周期蛋白依赖性蛋白激酶2（CDK2）表达水平的变化。结果发现双歧杆菌LTA处理后，半乳糖苷酶细胞化学染色阳性细胞百分率较衰老模型组降低（P0.01)。与年轻对照组相比，衰老模型组细
39、胞中p21的表达增高，cyclin E和CDK2表达降低，而双歧杆菌LTA能够逆转上述变化（P0.01)。因此，双歧杆菌能延缓H2O2诱导的细胞衰老,机制可能与改变p21，cyclin E和CDK2表达水平有关。 在体外，人胚肺二倍体成纤维细胞已成为经典的复制性细胞衰老模型，而多种刺激物能诱导年轻细胞出现与复制性衰老相似的特征，被称为应激诱导早熟性老化(stressinduced premature senescence，SIPS)，其中H2O2是最常用的氧化应激引发细胞SIPS诱导剂 51，52。双歧杆菌的表面分子脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)已被证实具有抗氧化的作用
40、，能够有效延缓衰老53，但其机制并不是很清楚。用H2O2诱导人胚肺成纤维细胞WI 38出现SIPS,观察双歧杆菌LTA是否具有抗细胞衰老的作用，以及WI 38细胞中p21、CDK2和cyclin E mRNA和蛋白表达水平的变化，探讨出双歧杆菌LTA抗细胞衰老的细胞周期调控机制。 氧化应激是指机体活性氧的产生过多或(和)机体抗氧化能力下降，活性氧(ROS)清除不足，导致ROS在体内增多并引起细胞氧化损伤的病理过程。ROS包括超氧阴离子(O2)、羟自由基(OH)、H2O2等。在体外,H2O2引发细胞氧化应激损伤,诱导细胞衰老,是最常用的诱导剂。经实验结果发现，用亚致死量的160 mol/L H2
41、O2处理WI38细胞可诱导细胞SIPS，其半乳糖苷酶细胞化学染色阳性细胞百分率较年轻对照组明显增高,而用双歧杆菌LTA处理后，半乳糖苷酶阳性细胞百分率较模型组明显降低，其中尤以5 、10 g/ml双歧杆菌LTA处理组降低最为明显，而20 g/ml双歧杆菌处理组无明显变化，显示出一定的浓度依赖性，表明双歧杆菌LTA能延缓H2O2诱导的细胞衰老。 细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。细胞周期沿着G1期S期G2期M期的顺序进行运转。G1期是启动细胞周期循环的关键，当细胞复制性衰老时，生长停滞，主要分布在G1期。当细胞被诱导衰老时，也具有相同的
42、特征。Gorbunova等54认为H2O2诱导的细胞衰老主要是由于DNA损伤引起。对DNA损伤所引起的反应细胞阻滞于G1期。在整个G1期，细胞在不同时相受到各自周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依赖激酶(CDK)的凋节，其中cyclin E是调控细胞周期从G1期进入S期的关键。cyclin E首先激活CDK2，cyclin ECDK2的磷酸化活性使Rb磷酸化，释放转录因子E2F，促使DNA合成，导致细胞由G1期进入S期，进行有序的运转。因此，提高cyclin E和CDK2的表达，可以促进细胞由G1期进入S期。而抑制CDK2的活性，也能阻止细胞进入S期55。p21作为一个广谱的CDK抑制剂和细胞
43、周期的负调控因子，能抑制cyclin ECDK2的磷酸化活性，使细胞停滞在G1期，从而诱发细胞衰老的特征性改变56。本研究发现，经H2O2诱导的WI38细胞出现SIPS，其细胞中p21表达明显增加，cyclin E和CDK2表达显著下降，而双歧杆菌LTA能够明显逆转上述细胞周期调节因子的变化，表明其可以通过增强细胞周期的正向调节并抑制细胞周期的负向调节，从而发挥延缓细胞衰老的作用。 5.对于如何减少细胞衰老的研究总括 来自美国威斯康辛州大学遗传学与医学遗传学系，日本东京大学等处的研究人员发现了一种可以防止细胞衰老的关键酶，这有利于解释许多导致人类衰老的现象，也可以帮助研究人员开发抗衰老的药物。
44、这一研究成果公布在Cell杂志上。 领导这一研究的是威斯康辛州大学John M. Denu和Tomas A. Prolla，其中后者Tomas A. Prolla从事基因抗衰老研究多年，致力于解析营养素，热量限制与老化之间的关联，并且发表了多篇文章，比如在Science杂志上曾在恒河猴上通过基因调控控制衰老的速度。 早在20世纪30年代，美国科学家Mckay就发现，限制大鼠喂食可延长其寿命。后续研究表明，这种寿命延长作用与食物成分无关，而与食物中的卡路里（热量）含量有关，因此这种现象被称为“卡路里限制”或“饮食限制”。 之后麻省理工学院Lenny Guarente及其同事用酵母菌进行衰老研究，
45、他们发现酵母菌中的Sir2基因有重要的调节衰老作用，不仅如此，Sir2还能被卡路里限制激活，从而介导卡路里限制的抗衰老作用。高等生物有7个与Sir2类似的Sirtuin基因（Sirt1-7），其中Sirt1、Sirt6和Sirt7的蛋白产物存在于细胞核内，Sirt2编码的蛋白通常在细胞质内，而Sirt3、Sirt4和Sirt5的产物则位于线粒体内。Sir2及其相关蛋白具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性组蛋白去乙酰基转移酶活性。 最新的这篇文章中，研究人员发现了另外一种Sirtuin基因：Sirt3表达的酶的重要作用，这也是首次获得了明确的证据证实Sirtuin在哺乳动物中的抗衰老作用。
46、研究人员发现这种酶能对线粒体产生了影响在低卡路里条件下，Sirt3酶水平增高，通过影响线粒体改变了新陈代谢，并减少了氧自由基生成。我们都知道自由基会伤害细胞，加速老化，导致皮肤变粗、变皱、下垂，关节也会愈来愈僵硬。因此研究人员认为Sirt3是一种重要的抗衰老元素。 一些活动，比如抽烟，吃煎炸类食物，细菌感染，压力过大都会产生过量自由基，多吃富含抗氧化物质的绿色叶菜类、全麦面包等则可中和自由基，减少自由基的伤害。 另外各种Sirtuin家族成员都具有重要的代谢调控功能，比如Sirt1通过修饰底物PGC-1、FOXO1、转录信号转导子与激活因子（STAT）3及CREB调节的转录共激活子（CRTC）
47、2调控肝脏葡萄糖的产生，还能通过肝脏X受体（LXR）调节胆固醇及脂肪代谢平衡，此外，Sirt1还能通过激活磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）来调控肝脏功能。 Sirtuin基因表达及活性受到饮食摄入、环境温度、昼夜节律和氧化应激等影响。此外，Sirtuin可以去除多种底物蛋白的乙酰化基团，从而调节其底物蛋白的功能。仅Sirt1底物蛋白至今已被发现多于40个，包括肿瘤抑制基因p53、叉头转录因子（FOXO）、核因子（NF）B和共激活因子1（PGC-1）。 细胞衰老的研究正在一步步深化，对于临床有着重要意义。通过对细胞衰老因素的了解，更好的探知生命体衰老与灭亡的本质，有针对性的解决临床问题。相信在不久的将来，人类在此方面的研究上会有更大的突破。 内容总结（1）细胞衰老概括【引言】人体衰老的实质即为细胞衰老，当前科学家无不探究着生命的奇迹意欲找出防止细胞衰老而延缓生命的方式，然而细胞衰老一方面对人体有着不可替代的作用，领一方面 又不为人们所接受