淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究和酶的纯化11744.docx

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1、淀粉酶菌菌株的选选育、发发酵工艺艺的研究究和酶的的纯化摘要:淀淀粉酶是是最早用用于工业业生产并并且迄今今仍是用用途最广广、产量量最大的的酶制剂剂产品之之一,为为了提高高淀粉酶酶的生产产水平,首先通通过淀粉粉培养基基从土壤壤中筛选选出产淀淀粉酶的的活性菌菌株,对对菌株初初步鉴定定后进行行紫外线线诱变,筛筛选出产产量高、性性状优良良的突变变菌株,再再用正交交试验的方方法对其其发酵条条件进行行优化,实验最最后采用用硫酸铵铵沉淀法法初步纯纯化发酵酵得到的的淀粉酶酶并对酶酶活性进进行了测测定。关键词:淀粉酶酶;分离离筛选;紫外线线诱变;优化;提纯1、 引言淀粉酶是是能够分分解淀粉粉糖苷键键的一类类酶的总

2、总称,包包括-淀粉酶酶、-淀淀粉酶、糖糖化酶和和异淀粉粉酶,是是最早用用于工业业生产并并且迄今今仍是用用途最广广、产量量最大的的酶制剂剂产品之之一。淀淀粉酶种种类繁多多,特点各各异,在造纸纸、印染染、酿造造、果汁汁和食品品加工、医医药、洗洗涤剂、工工业副产产品及废废料的处处理、青青贮饲料料及微生生态制剂剂等多种种领域具具有广阔阔的用途途。我国是传传统的农农业大国国,发展淀淀粉深加加工工业业是解决决当前淀淀粉生产产积压的的好出路路,而几几乎所有有淀粉深深加工工工业的基基础都是是以淀粉粉质原料料的水解解作为第第一步,因因此淀粉粉质原料料的液化化情况直直接关系系到产品品后期的的加工工工艺和产产品的质

3、量。所以,改进淀淀粉液化化工艺也也是降低低生产成成本,提提高产品品市场竞竞争能力力的一种种重要手手段。显然,改改进淀粉粉液化工工艺首要要任务就就是提高高淀粉酶酶的生产产水平。那如何提提高淀粉粉酶的生生产水平平呢?我我们知道道,现在在淀粉酶酶主要来来源于植植物和微微生物,并通过过发酵完完成生产产,因此此筛选出出高产、稳稳定的淀淀粉酶产产生菌是是淀粉酶酶生产的的头等大大事。本本文试图图从土壤壤中分离离出产淀淀粉酶的的枯草杆菌菌,通过过紫外线线诱变育育种及发发酵条件件优化来来得到高高产、稳稳定的淀淀粉酶产产生菌株株,并对对发酵得得到的淀淀粉酶进进行初步步提纯,以达达到加深深对发酵酵工程上上游技术术中

4、菌种种选育的的认识、掌掌握紫外外线诱变变育种的的原理和和方法、了了解发酵酵条件对对产物形形成的影影响、熟熟悉发酵酵条件的的优化方方法、掌掌握分光光光度法法测液化化型淀粉粉酶活力力的基本本原理和和方法、掌掌握初步步纯化淀淀粉酶的的方法的的实验目目的。2、材料料与方法法2. 11 实验验材料211 样品:贵贵师大综综合楼附附近的土土壤212 培养基基和试剂剂:淀粉培培养基、牛牛肉膏蛋蛋白胨(斜斜面)、牛肉膏蛋白胨(液体)种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液213 仪器设备备:全自自动高压压灭菌锅锅、培养养皿、恒恒温培养

5、养箱、超净工工作台、恒恒温摇床床、离心心机、分分光光度度计、恒恒温水浴浴锅、移移液管、PPH试纸纸、吸耳耳球、玻玻璃棒、量量筒、试试管、试试管架、酒酒精灯、电电子天平平、三角角烧瓶、洗洗瓶、接接种针、接接种环、直直尺、记记号笔等等。2. 22 实实验方法法221 细菌的分分离与初初步鉴定定:将土土壤系列列稀释,把把10-3 、10-44、100-5分别别涂布到到淀粉培培养基上上,27倒置培培养2天天,将长出出的菌落落接入斜斜面。将将细菌从从斜面接接种到淀淀粉培养养基培养养2天,用用碘液染色色,记录透透明圈大大小和菌菌落直径径,计算算D/d值。保保菌供下下次实验验用。222 紫外线线诱变育育种:

6、取活化化后的菌菌种配成成菌悬液液、稀释;倒倒淀粉培培养基平平板,将将菌悬液液涂布其表表面;用用紫外线线处理平平板0、22minn、4miin、66minn、8mmin、110miin,每个处处理2次次重复;放到黑黑暗中倒倒置培养养,377培养488h,分分别计数数诱变组组和对照照组平板板上的菌菌落数,并计算算致死率率;加入入碘液,分分别测量量诱变组组和对照照组菌落落的透明明圈直径径和菌落落直径,计计算D/d值;将D/d值最最大的菌菌种保存存到斜面面培养基基上。223 生产菌菌株摇瓶瓶发酵条条件的优优化22311 培培养基初初始pHH值和装装液量对对产酶的的影响:用1mmol/L盐酸酸或1mmo

7、l/L氢氧化化钠调节节培养基基pH值值,使培培养基的的pH值值为5.0、77.0、99.0,分分装至2250mmL三角角瓶中,每每瓶255mL,灭灭菌,冷冷却后编编号1、22、3,再再接种,37下恒温摇床培养48h(摇瓶装液量分别30、40、50),最后测定发酵液酶活。 编号号处理项1号2号3号PH579装液量304050A660010-1110-222.2.3.22 培培养基碳碳源对产产酶的影影响:在在不含可可溶性淀粉的培养基基中,分别别加入00.5的各种种碳源(可可溶性淀粉、葡葡萄糖、蔗蔗糖),以以硝酸铵铵作为唯唯一氮源源,进行行碳源对对产酶的的影响的的发酵试试验。 处处理结果可溶性淀淀粉

8、葡萄糖蔗糖A660010-1110-222.2.3.33 正正交试验验设计:通过三因因素两水水平的正正交试验验对高产产菌的发发酵条件件进行优优化,建建立高产产菌株的的最佳摇摇瓶发酵酵条件。因素处理接种量淀粉含量量蛋白胨含含量处理一35g/LL5g/LL处理二310g/L10g/L处理三55g/LL10g/L处理四510g/L5g/LL224 淀粉粉酶的初初步提纯及酶活活性的测测定2.2.4.11 淀淀粉酶的的初步提纯:收集集发酵液液,30000rr/minn离心110miin,去去除菌体体,在上上清液中中加入665饱和度度的硫酸酸铵,待待硫酸铵铵充分溶溶解后于于4盐析22h,然然后50000r

9、r/minn离心220miin,得得到初步步纯化的的淀粉酶酶。2.2.4.22 标标准曲线线的制作作和酶活活性的测测定:将将可溶性淀粉稀释释成0.2、0.5、1、1.5和2的稀释液液,按下下表进行行标准曲曲线的制制作和酶酶活性的的测定。管号12345671727374淀粉稀释释液/mL2(0)2(0.2)2(0.5)2(1)2(1.5)2(2)2(2)2(2)2(2)2(2)缓冲液/mL111111111140水水浴保温温5miin蒸馏水/mL1111110000粗酶液/mL000000111140水水浴保温温30mmin,然然后加入入0.55moll/L乙酸100 mLL,混均均吸取反反应液

10、11 mLL碘液/mmL10101010101010101010A6600(平均值值)(711、72、773、774中中加入的的粗酶液液,即为为正交试验验设计中中处理一一、处理理二、处处理三、处处理四所所得的淀淀粉酶液液)注:前前6组的的数据用用于标准准曲线的的制作:以淀粉粉浓度为为横坐标标,吸光光度为纵纵坐标,作作标准曲曲线;后4组组的数据据用于酶酶活性的的测定:测得吸吸光度后后,可从从标准曲曲线中查查出相应应的淀粉粉浓度,求求出被消消耗的淀淀粉量,这这里的酶酶活即为为每毫升升粗酶液液于400,PH6.0的条条件下,每每小时液液化可溶溶性淀粉粉的毫克克数【mmg可溶溶性淀粉粉/mLLh】。3

11、、结果果与分析析3. 11 菌落落的形态态特征菌落在以以淀粉为为唯一碳碳源的分分离培养养基中生生长,培培养488 h形成成白色圆圆形菌落落,菌落落背面乳乳白色,边边缘不光光滑,形形态规则则,质地地较密,有有透明圈圈,无沉沉淀。3. 22 计计算D/d值321 分离筛筛选时,大大部分菌菌落水解解圈都粘粘连在一一起,无无法准确确测得DD/d值,只只得到少少部分数数据:单菌落透明圈直直径/mm(D)菌落直径径/mm(d)D/d4.03.01.314.007.12.0表A 透明圈直径和菌落直径及比值分析:无无法准确确测得DD/d值,可可能是所所采土样样中产淀淀粉酶的的细菌含含量较多多,涂平平板之前前稀

12、释倍倍数不够够导致单单菌落过过于密集集,水解解圈粘连连;也可可能是实实验操作作不当所所致。322 紫外诱诱变后,得得到单菌菌落的透透明圈直直径和菌菌落直径径及比值值:单菌落透明圈直直径/mm(D)菌落直径径/mm(d)D/d4.83.01.66.45.51.214.887.42.016.004.93.311.884.52.69.84.02.525.005.05.08.84.02.214.007.81.8分析:通通过结果果,可看看出经过过紫外诱诱变后,有有的菌株株产酶活活能力有有所提高高,有的的减小,筛筛选产酶酶活能力力最高的的菌株,保保存供后后续试验验使用。我我们挑号菌,将将其保存存到斜面面培

13、养基基上供后后续试验验使用。3. 33 计算算菌株紫外外诱变的的致死率率对菌株分分别用紫紫外线处处理,得得到下表表:诱变时间间/minn菌落数/个致死率(平均值值)09800210-1130663.3310-22414410-1112482.3310-22223610-112596.7710-2240810-11599.3310-229100100由此数据据,可作作出紫外外线诱变变的致死死曲线分析:由由图可知知,淀粉粉酶菌株株对紫外外线比较较敏感,而而且致死死率与诱诱变剂剂剂量存在在正相关关。当紫紫外线照照射时间间为6mmin时时,致死死率为996.77,进一一步提高高照射时间,则则致死率率随

14、之上上升,当当照射110miin时,致致死率为为1000。一般般认为,进进行紫外外诱变时时,致死死率为995左左右时突突变效果果最好。因因此,紫紫外线诱诱变的最最适剂量量为6mmin。3. 44 菌菌株发酵酵条件的的优化341 培养基基初始ppH值和和装液量量对产酶酶的影响响: 编号号处理项1号2号3号PH579装液量304050A660010-11无无无10-22无无无分析:未未得到数数据的原原因有三三点:操作不不当,可可能是取取液过程程中加错错体积,也也可能是是将试管管序号弄弄混了;将发酵酵液从摇摇床取出出的过程程中有少少量溢出出,导致致浓度降降低,影影响实验验结果;发酵过过程中有有杂菌产

15、产生,发发酵液被被污染了了。342 培养基基碳源对对产酶的的影响: 处处理结果可溶性淀淀粉葡萄糖蔗糖A660010-1100111096690644510-22016641266812004分析:由由上表数数据可知知,培养养基的碳源为为葡萄糖糖时酶活活性最大大。从而而得出结结论:三三种碳源源中最佳佳碳源是是葡萄糖糖。343 标准曲线线的制作作:分析:标标准曲线线的精确确度不高高,原因因主要有有三点:淀粉浓浓度为00.5%时,AA6600明显偏偏高,可可能是稀稀释淀粉粉的时候候操作不不当所致致;在测酶酶活时,还还未等到到分光光光度计稳稳定就开开始读数数,造成成测量结结果有误误差;由于操操作失误误

16、,忘记记每个试试管做平平行测量量,造成成测量结结果不精精确。344 正交试验验酶活力力的测定定试管编号号1(对照照)71727374A660000.00040.04470.01190.0663酶消耗的的淀粉浓浓度(%)01.99991.93301.95531.9775酶活力(mg /mLh)039.99838.66039.00639.550表1 试验号因素酶活力(mg /mLh)ABC111139.998212238.660321239.006422139.550表2 试验结果分析分析:对对正交试试验结果果进行方方差分析析,可知知最佳培培养基配配方为AA1B1C1,即接种种量3%、淀粉粉含量5

17、5g/LL、蛋白白胨含量量5g/L。3. 55 淀淀粉酶的的初步提提纯正交试验验得到酶酶液分别别加入665饱和度度的硫酸酸铵,待待硫酸铵铵充分溶溶解后于于4盐析22h,然然后50000rr/minn离心220miin,去去除上清清液,再再加水稀稀释测酶酶活。试管编号号1(对照照)71727374A660000.01150.09970.04490.0333酶消耗的的淀粉浓浓度(%)01.98811.84491.92261.9552酶活力(mg /mLh)039.66236.99838.55239.004表3 分析:实实验的目目的旨在在掌握初初步纯化化淀粉酶酶的方法法和进一一步掌握握分光光光度法测

18、测液化型型淀粉酶酶活力的的基本原原理和方方法。表表3 AA6600和表11相比,71、72、73均比表1大,74却比表1小,可能是加水稀释时混合不均匀所致。4、讨论论本实验的的设计方方案具有有一定的的理论依依据,如如果操作作得当,各各方面条条件满足足,会得得到产淀淀粉酶的的枯草杆杆菌高产产菌株,及及该菌株株的最佳佳摇瓶发发酵条件件。但操操作过程程存在很很多缺陷陷,主要要问题有有:分离筛筛选淀粉粉酶菌株株时,稀稀释度不不够导致致水解圈圈粘连;在进行行pH值值和装液液量对产产酶影响响的实验验过程中中,取液液操作不不当,将将试管序序号都弄弄混了;发酵过过程中有有杂菌产产生,发发酵液被被污染;制作标标

19、准曲线线时,由由于操作作失误,忘忘记每个个试管做做平行测测量,造造成测量量结果不不精确;在测酶酶活时,还还未等到到分光光光度计稳稳定就开开始读数数,造成成测量结结果有误误差;由于考考虑到时时间的限限制,实实验过程程中分离离时的复复筛及突突变后的的复筛都都没做,若若要得到到精确可可靠的实实验数据据,应该该操作完完善。此外,紫紫外线诱诱变育种种简便易易行、对对条件和和设备要要求较低低并能较较好地提提高代谢谢产物的的产量,故故在微生生物育种种中仍广广泛应用用。但实实验中发发现紫外外线诱变变存在很很大的不不确定性性,为使使诱变效效率提高高,运用用分子生生物学技技术对菌菌株进行行基因操操作和定定向改造造

20、,会使使菌株选选育朝着着快捷、高高效的方方向发展展。以上几点点可以作作为今后后该实验验改进的的几点建建议,及及操作过过程中应应注意的的问题。附录(一)、培培养基的的配制1、淀粉粉培养基基:蛋白胨胨10gg,氯化化钠5gg,牛肉肉膏5gg,可溶溶性淀粉粉2g,蒸蒸馏水110000mL,琼琼脂200g,pH 77.22、牛肉肉膏蛋白白胨培养养基:蛋白胨胨10gg,氯化化钠5gg,牛肉肉膏3gg,蒸馏馏水10000mmL,琼琼脂155200g,ppH7.077.2(二)、试试剂1、碘液液:碘0.0022gg,碘化化钾100g,先用用少量蒸蒸馏水使使碘完全溶解解后定容至至250mL,置于棕色瓶瓶中待用用。2、2%淀粉溶溶液:称称取2g淀粉,在在少量水水中调匀匀后倾入入沸水中中,加热热煮沸至至透明为为止,冷冷却后定定容至1100mml。3、磷酸酸氢二钠钠-柠檬檬酸缓冲冲液:称取磷酸酸氢二钠钠4.52g和柠檬酸酸0.8807gg,用蒸蒸馏水溶溶解并定定容至1100mmL,配好好后应以以酸度计计校正ppH。4、标准准糊精溶液液:称取糊精精0.006g,在少少量水中中调匀后后倾入990mLL沸水中中,冷却却后定容容至1000mll。

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