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1、第四章第四章 抗体技术抗体技术第七章第七章 抗体工程技术抗体工程技术1一一、抗体类型、抗体类型1 1、多克隆抗体、多克隆抗体(polyclonal antibody)早期人工制备抗体的早期人工制备抗体的主要主要方法，以方法，以相应抗原免疫动物，由此产生的抗体相应抗原免疫动物，由此产生的抗体是针对多种抗原决定簇（表位）的混是针对多种抗原决定簇（表位）的混合抗体，故称之为多克隆抗体。合抗体，故称之为多克隆抗体。2优点：来源广泛、制备容易优点：来源广泛、制备容易缺点：特异性不高、易发生交叉反应缺点：特异性不高、易发生交叉反应3多克隆抗体l1890年Behring和Kitasato发现白喉抗毒素，建立
2、免疫疗法，开创了抗体制药之先河。白喉外毒素免疫动物抗毒素治白喉Behring(德,18541917）4目前治疗性抗体产品：精制破伤风毒目前治疗性抗体产品：精制破伤风毒素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。绿脓免疫血浆抗体制剂绿脓免疫血浆抗体制剂5多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备n根据不同的免疫原，选择不同的免疫方案。n免疫方案免疫途径免疫程序动物选择6 细胞融合细胞融合，又称体细胞杂交是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有原来原来两个细胞基因信息的单个核细胞两个细胞基
3、因信息的单个核细胞，称为，称为杂交细胞杂交细胞（hybrid cell）。）。2、细胞融合技术和单克隆抗体、细胞融合技术和单克隆抗体7显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程8uMuller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uLuginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细
4、胞合并现象。u1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。细胞融合研究进展细胞融合研究进展9n19751975年，年，KohlerKohler和和MilsteinMilstein应用应用小鼠小鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞和绵羊细胞致敏和绵羊细胞致敏的小鼠的小鼠脾细胞脾细胞融合，得到的一部融合，得到的一部分融合杂交细胞既能继续生长，分融合杂交细胞既
5、能继续生长，又能分泌抗羊红细胞抗体，将这又能分泌抗羊红细胞抗体，将这种杂交细胞系统称为杂交瘤细胞，种杂交细胞系统称为杂交瘤细胞，应用这种方法可制备单一抗原决应用这种方法可制备单一抗原决定簇的单克隆抗体。定簇的单克隆抗体。10一、何谓单克隆抗体？一、何谓单克隆抗体？11 由一个识别一种抗原表位的由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆细胞克隆产生的同源抗体，称单克隆抗体产生的同源抗体，称单克隆抗体12131415 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与与经特定抗源免疫刺激的经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞淋巴细胞(antigen stimula
6、ted B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术交瘤技术(hybridoma technology）。）。16Niels K.Jerne G.Kohler C.Milstein 17杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理18 3 3、基因工程抗体、基因工程抗体 基因工程抗体即将抗体的基因按不基因工程抗体即将
7、抗体的基因按不同需要进行加工、改造和重新装配，同需要进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表然后导入适当的受体细胞中进行表达的抗体分子。达的抗体分子。19基因工程抗体与单克隆抗体相比的优点：基因工程抗体与单克隆抗体相比的优点：通过基因工程技术的改造，可以通过基因工程技术的改造，可以降低降低甚至消除甚至消除人体对抗体的排斥反应。人体对抗体的排斥反应。基因工程抗体的分子量较小，可以基因工程抗体的分子量较小，可以部部分降低抗体的鼠源性分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；根据血管壁，进入病灶的核心部位；根据治疗的需要，制备新型抗体。治疗的需要，制备
8、新型抗体。可以采用原核细胞、真核细胞和植物可以采用原核细胞、真核细胞和植物等等多种表达方式多种表达方式，大量表达抗体分子，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。大大降低生产成本。20整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术 基因工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体小型化抗体”（单链抗体）（单链抗体）组合抗体库技术组合抗体库技术 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术 Ig Ig基因转基因小鼠基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体真核表达技术21 经过免疫的哺乳类动物经过免疫的哺乳类动物单一的单一的B
9、 B淋淋巴细胞巴细胞，可以合成分泌单一性的抗，可以合成分泌单一性的抗体，我们称这种具有体，我们称这种具有特异性特异性的的、同、同质性质性的抗体为单克隆抗体。的抗体为单克隆抗体。二、二、McAbMcAb技术基本原理技术基本原理22 改变改变B淋巴细胞遗传特性淋巴细胞遗传特性建立建立永久生长永久生长和和能分泌能分泌McAb细胞系的途径细胞系的途径 病毒转化病毒转化 细胞杂交细胞杂交23骨髓瘤细胞选择骨髓瘤细胞选择骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺
10、陷型（TK-）24*融合细胞的选择原理l l 1964年Litterlefield首先发明 HAT 选择性培养基。H：Hypoanthine 次黄嘌呤 A：Aminopterin 氨基喋呤 T：Thymidine 胸腺嘧啶脱氧核苷 原理：正常细胞不但具有利用培养液中的谷酰胺和尿核苷单磷酸合成DNA的能力,且当这条主要途径被氨基喋呤（A）阻断时，还具有利用培养液中现成的次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶脱氧核苷（T）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的作用下，借此替代通路来合成DNA的能力。25三、三、McAb技术的特点技术的特点1、高度特异性高度特异性2、高度稳定性、高度稳定性 3、高抗体活性
11、、高抗体活性 4 4、不可知性不可知性 5 5、过于单一性过于单一性26四四 、McAMcA制备的基本方法制备的基本方法（一）一）抗原提纯与动物免疫抗原提纯与动物免疫 27（二）（二）骨髓瘤细胞及饲养细胞骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备的制备 n对数生长期的骨髓瘤细胞SP20(HGPRT缺陷株)的准备n脾细胞的准备28融合前骨髓瘤细胞:细胞状态浑圆透亮、大小均一、边缘清晰、排列整齐、呈半致密分布29（三）（三）细胞融合细胞融合n融合过程须注意问题融合过程须注意问题n1 1、细胞比例：、细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞比例为1：4n2 2、反应时间：、反应时间：混合细胞的离心管中30s内加入1ml 37预
12、温的50PEG，边加边轻轻摇动离心管，作用90s，然后加入预温的37的DMEM不完全培养液终止PEG作用，800r/min离心6min，弃上清。n3 3、培养液成分、培养液成分30（四）筛选和克隆（四）筛选和克隆有限稀释法有限稀释法(稀释至稀释至0.80.8个细胞个细胞/孔孔)（五）（五）单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的制备和冻存（六）（六）单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化（制备方法：体内培养、体外培养）（制备方法：体内培养、体外培养）（盐析、凝胶过滤、离子交换层析、（盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、酸沉淀）亲和层析、酸沉淀）31四四 、McAMcA制备的基本方法制备的基本方法 32
13、五五 、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用1 1、作为亲合层析的配体、作为亲合层析的配体2 2、作为生物治疗的导向武器作为生物治疗的导向武器3 3、作为免疫抑制剂作为免疫抑制剂 通过亲和层析可从复杂的混合物中通过亲和层析可从复杂的混合物中分离、纯化某一特定成分分离、纯化某一特定成分McAbMcAb所带药物只作用于靶组织器官所带药物只作用于靶组织器官 抗人的抗人的T T淋巴细胞单抗用于临床治疗自身淋巴细胞单抗用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应免疫疾病和抗器官移植的排斥反应334 4、作为研究工作中的探针、作为研究工作中的探针5 5、增强抗原的免疫原性、增强抗原的免疫原性6 6、作为医
14、学检验试剂、作为医学检验试剂（1 1）诊断各类病原体）诊断各类病原体（2 2）肿瘤特异性抗原和相关抗原检测）肿瘤特异性抗原和相关抗原检测（3 3）检测淋巴细胞表面标志）检测淋巴细胞表面标志（4 4）机体微量成分的测定）机体微量成分的测定34CJ PEB1CJ PEB1重组蛋白的表达及重组蛋白的表达及单克隆单克隆/多克隆抗体的制备鉴定多克隆抗体的制备鉴定35 课题的思路及目的课题的思路及目的诱导培养基因工程菌E.coli BL21(DE3)高效表达CJ PEB1重组蛋白镍琼脂糖层析柱纯化表达后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠制备单抗免疫新西兰兔制备多抗为建立血清学方法检测CJ创造条件 36一、SD
15、S-PAGE鉴定纯化后的PEB1蛋白1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 101 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10图图1.SDS1.SDSPAGEPAGE鉴定纯化后的鉴定纯化后的PEB1PEB1蛋白蛋白 表达的蛋白通过表达的蛋白通过镍琼脂糖凝胶层镍琼脂糖凝胶层析柱纯化后，经析柱纯化后，经SDS-PAGESDS-PAGE鉴定，鉴定，蛋白质分子量大蛋白质分子量大小与预计的理论小与预计的理论值相符，和本室值相符，和本室前期的研究结果前期的研究结果一致，一致，PEB1PEB1重组重组蛋白纯度高蛋白纯度高 。1 12 2：咪唑浓度为：咪唑浓度为50mmol/L50mmol/L时洗脱的蛋白时洗脱
16、的蛋白3 34 4：咪唑浓度为：咪唑浓度为100mmol/L100mmol/L时洗脱的蛋白时洗脱的蛋白5 56 6：咪唑浓度为：咪唑浓度为200mmol/L200mmol/L时洗脱的蛋白时洗脱的蛋白M M ：蛋白质标准分子量：蛋白质标准分子量7 78:8:咪唑浓度为咪唑浓度为300mmol/L300mmol/L时洗脱的蛋白时洗脱的蛋白9 910:10:咪唑浓度为咪唑浓度为400mmol/L400mmol/L时洗脱的蛋白时洗脱的蛋白97.4kd66.2kd42.7kd31kd14.4kd37 PEB1 PEB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 常规免疫常规免疫BALB/C小鼠
17、制备单克隆抗体小鼠制备单克隆抗体38-a a-b b-c c-d d-a -b -c -d抗原抗原决决定定簇簇BALB/BALB/C Ca ab bb bc cd d 脾脾脏产生各种脏产生各种 B B 細胞細胞与佐剂乳化与佐剂乳化免免疫疫采采血血收集收集血清血清作为筛选时阳性对照作为筛选时阳性对照无菌取无菌取脾脾脏脏收集收集B B细细胞胞抗原通常有多抗原通常有多个个抗原抗原决决定定簇簇免免疫疫后后的脾的脾脏脏约约在在两两月內月內注射注射四四次次PEB1PEB1蛋白蛋白39-d d-a a-b b-c c-d dPEB1PEB1蛋白蛋白ELISAELISAHATHATPEG PEG 细胞融合细胞
18、融合杂交瘤细杂交瘤细胞胞（亚克隆亚克隆）(确确定只有定只有单个细单个细胞胞)-d d-c c-b b-a a-d dSP2/0SP2/0骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞B cellB cell脾脾细细胞胞培培养筛选养筛选只识别一个抗原决定簇只识别一个抗原决定簇 a ab bb bc cd d合合合合混混混混胞胞胞胞细细细细选选选选筛筛筛筛抗抗抗抗单单单单40 单克隆抗体的获得及鉴定单克隆抗体的获得及鉴定 细胞克隆的形成和杂交瘤细胞的筛选细胞克隆的形成和杂交瘤细胞的筛选 图图2.2.融合后第二天骨髓融合后第二天骨髓瘤细胞对照孔瘤细胞对照孔图图3.3.融合后第二天融合后第二天 细胞融合孔细胞融合孔41图图4.
19、4.融合后第三天融合后第三天细胞融合孔细胞融合孔图图5.5.融合后第八天融合后第八天 细胞融合孔细胞融合孔42 图图6.6.间接间接ELISAELISA筛选抗体阳性孔筛选抗体阳性孔 43 通过有限稀释法和通过有限稀释法和ELISAELISA法进行连续克隆筛法进行连续克隆筛选后获得两株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞选后获得两株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为株，分别命名为1D1D7 7A A5 5株和株和5G5G2 2B B3 3株。株。44 图图8.1D8.1D7 7A A5 5株分泌抗体的亚型株分泌抗体的亚型 图图9.5G9.5G2 2B B3 3株分泌抗体的亚型株分泌抗体的亚型45 1D1
20、D7 7A A5 5株和株和5G5G2 2B B3 3株杂交瘤细胞诱生的腹水株杂交瘤细胞诱生的腹水经间接经间接ELISAELISA法检测，腹水中的抗体效价分别法检测，腹水中的抗体效价分别为为1:81:810104 4和和1:51:510104 4。两株杂交瘤细胞诱生的腹水经双向琼脂扩两株杂交瘤细胞诱生的腹水经双向琼脂扩散试验检测，腹水中的抗体效价均为散试验检测，腹水中的抗体效价均为1:81:8。46运用小鼠单抗分型试剂盒确定杂交瘤细胞所分运用小鼠单抗分型试剂盒确定杂交瘤细胞所分泌的单抗的亚型。泌的单抗的亚型。将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水。将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水。应用间
21、接应用间接ELISAELISA法和双向琼脂扩散试验检测的腹法和双向琼脂扩散试验检测的腹水中单抗的效价。通过水中单抗的效价。通过Western-blotWestern-blot和玻片和玻片凝集试验检测单抗的特异性。凝集试验检测单抗的特异性。47n免疫印迹试免疫印迹试验结果显示：验结果显示：2 2株杂交瘤株杂交瘤细胞分泌的细胞分泌的单抗，可以单抗，可以与与PEB1PEB1蛋白蛋白特异性结合。特异性结合。通过通过DABDAB显显色出现特异色出现特异性条带并且性条带并且无杂带出现无杂带出现。1234M 1 12 2：未经纯化的：未经纯化的PEB1PEB1蛋白与单抗特异性结合蛋白与单抗特异性结合3 34
22、 4：纯化的：纯化的PEB1PEB1蛋白与单抗特异性结合蛋白与单抗特异性结合M M ：蛋白质标准分子量：蛋白质标准分子量图图10.western-blot10.western-blot检测单抗特异性检测单抗特异性97.4kd66.2kd43kd31kd20kd14.4kd48细菌名称细菌名称杂交瘤细胞杂交瘤细胞诱生的腹水诱生的腹水SP2/0细胞细胞诱生的腹水诱生的腹水空肠弯曲菌空肠弯曲菌+大肠杆菌大肠杆菌痢疾杆菌痢疾杆菌伤寒杆菌伤寒杆菌产气荚膜杆菌产气荚膜杆菌变形杆菌变形杆菌葡萄球菌葡萄球菌表表1.玻片凝集试验检测单抗的特异性结果玻片凝集试验检测单抗的特异性结果49三、PEB1PEB1蛋白多克
23、隆抗体的制备及鉴定蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 免疫新西兰兔制备多克隆抗体。免疫新西兰兔制备多克隆抗体。501 12 23 34 41 12 24 43 31 12 23 34 4PEB1PEB1蛋白蛋白与佐剂完与佐剂完全乳化全乳化待血凝完全离待血凝完全离心收集血清心收集血清盐析法粗提兔盐析法粗提兔IgG抗体抗体51应用间接应用间接ELISAELISA法和双向琼脂扩散试验检测法和双向琼脂扩散试验检测多克隆抗体抗体的效价。多克隆抗体抗体的效价。通过通过Western-blotWestern-blot和玻片凝集试验检测多和玻片凝集试验检测多克隆抗体的特异性。克隆抗体的特异性。52 多克隆抗体的效价检
24、测及鉴定多克隆抗体的效价检测及鉴定动物动物编号编号0W0W2W2W4W4W6W6W7W7W8W8W兔兔1 10 01:101:101:101:10 2 2 1:61:610103 31:81:810103 31:1.51:1.5 10 104 4兔兔2 20 01:101:101:51:51010 2 2 1:81:810103 31:11:110104 41:21:210104 4兔兔3 30 01:101:101:51:51010 2 21:81:810103 31:1.21:1.210104 41:2.51:2.510104 4 表表2.2.间接间接ELISAELISA检测兔血清的效价变
25、化检测兔血清的效价变化 间接间接ELISAELISA检测兔血清的效价变化检测兔血清的效价变化 53表表3.双向琼脂扩散试验检测免疫后的抗体效价变化双向琼脂扩散试验检测免疫后的抗体效价变化 动物动物编号编号0W2W4W6W7W8W兔兔101:11:21:41:81:8兔兔201:11:41:81:161:16兔兔301:11:41:81:161:16双向琼脂扩散检测免疫后的抗体效价变化双向琼脂扩散检测免疫后的抗体效价变化 54nWestern-blot试验检测多抗的特异性试验检测多抗的特异性1 2 M1 2 M1 1：未经纯化的：未经纯化的PEB1PEB1蛋白与单抗特异性结合蛋白与单抗特异性结合
26、2 2：纯化的：纯化的PEB1PEB1蛋白与单抗特异性结合蛋白与单抗特异性结合M M：蛋白质标准分子量：蛋白质标准分子量 免免疫疫印印迹迹试试验验结结果果证证实实：所所获获得得的的多多抗抗 与与 PEB1蛋蛋白白特特异异性性结结合合。通通过过DAB显显色色出出现现特特异异性性条条带带并并且且无无杂杂带出现。带出现。图图11.western-blot11.western-blot检测多抗特异性检测多抗特异性97.4kd66.2kd43kd31kd20kd14.4kd55 第三节第三节 抗体蛋白的分离纯化抗体蛋白的分离纯化一、一、抗体蛋白的提取抗体蛋白的提取水溶液提取法、有机溶剂提取法水溶液提取法、有机溶剂提取法二、二、抗体抗体蛋白的分离纯化蛋白的分离纯化1 1、溶解度不同分离、溶解度不同分离蛋白质的盐析蛋白质的盐析等电点沉淀法等电点沉淀法低温有机溶剂沉淀法低温有机溶剂沉淀法2 2、分子量大小分离、分子量大小分离透析与超滤透析与超滤凝胶过滤（分子筛层析）凝胶过滤（分子筛层析）3 3、带电性质不同、带电性质不同电泳法电泳法离子交换层析法离子交换层析法4 4、配体特异性亲和色谱法、配体特异性亲和色谱法56盐析沉淀n用中性盐类使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。n沉淀蛋白质所需盐类浓度视蛋白质种类而异。n常用的有：硫酸铵硫酸铵、硫酸镁、氯化钠57