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1、丹青不知老将至，贫贱于我如浮云。杜甫穷则独善其身，达则兼善天下。孟子硒的检测技术研究进展 硒的检测方法研究始于 20 世纪 90 年代，所研究和应用的方法有比色法、荧光分光光度法、原子吸收光谱法、石墨炉原子吸收光谱法、氢化物一原子吸收光谱法、氢化物一原子荧光光谱法、催化动力学法、高效液相一荧光法、气相色谱法、电感耦合等离子体一质谱法等，由于含硒样品种类繁多，且每种测定方法都有其优缺点，所以根据不同的分析样品，选择合适的测定方法，有着非常重要的意义。硒在生物体中的存在形式分为有机态和无机态，其检测方法的研究和发展也分为两个方面：一类总硒的检测，另一类是有机硒的形态分析检测，现将各种方法分别简述如
2、下：1 总硒的测定 1.1 比色法 3，3 一二氨基联苯胺（3，3-Diaminobenzidine）在酸性条件下与四价硒反应生成黄色化合物，在pH7左右时能被甲苯萃取，进行比色定量。水样需要经酸混合液消解后，将四价以下的无机和有机硒氧化成四价硒，再与盐酸反应将六价硒还原至四价硒，然后再测定总硒含量。该法样品中若存在大量铁、铜、钼及钒等重金属离子时，可用Na2-EDTA消除干扰，强氧化剂能将 3，3 一二氨基联苯胺试剂氧化产生棕红色，因此水样用混合酸消解时一定要加热至大量酸被赶掉，少量的强氧化剂可用盐酸羟胺消除。本法最低检出限为 2.5 g.L-1，测定上限为 50 g.L-1，灵敏度较低。1
3、.2荧光分光光度法 2，3 一二氨基萘（2，3-diaminonaphthalene，缩写为 DAN）在 pill.5-2.0的酸性溶液中，选择性地与四价硒离子反应生成 4，5 一苯并苤硒脑(4，5 一 ben-一寸光阴一寸金，寸金难买寸光阴。增广贤文吾日三省乎吾身。为人谋而不忠乎？与朋友交而不信乎？传不习乎？论语zopiaselenol)绿色荧光物质，被环已烷萃取后，以 368 nm 为激发波长，在 520 nm 处测定，所产生的荧光强度与四价硒含量成正比。水样经硝酸一高氯酸混合酸液消解，将四价以下的无机和有机硒氧化为四价硒，再经盐酸消解将六价硒还原为四价硒，然后测定总硒含量，本法最低检出量
4、为 0.005 g，取 20 mL水样测定，硒的最低检出浓度为 0.25 g.L-1，现为国家标准方法第二法。1.3氢化物一原子荧光法 样品消解后，将溶液中的硒还原成四价硒，用硼氢化钾(KBH4)作为还原剂，将四价硒在盐酸介质中还原成硒化氢(Sell4)，由载气（氩气）带入原子化器中进行原子化，在硒空心阴极灯照射下，基态硒原子被激发至高能态，再去活化回到基态时，发射出特征波长的荧光，其荧光强度与硒的含量成正比，与标准系列比较定量。该法在最佳条件下，方法检出限为每毫升 0.22 ng，相对标准偏差为 1.7%，样品测定硒的加标回收率为 97.7%一 100.9%。该方法操作简单，结果准确，能满足
5、日常对硒样品的检验要求，现为国家标准方法第一法。1.4火焰原子吸收法 消解样品中的硒元素被载气吸入火焰中，处于原子状态，让硒空心阴极灯发出的特定波长的光从其中通过，因原子数目的多少可以影响光被吸收的程度，所以测定吸光度可以度量出被分析元素的浓度。该法操作简单，但因硒空心阴极灯发射的特征谱线在 196.0 nm 处，接近真空范围，因此信号不稳定，易产生波动，灵敏度不高，现已被氢化物一原子吸收法代替。1.5氢化物一原子吸收法 样品经硝酸一高氯酸消化后，加入盐酸将六价态硒还原为四价态硒，以稀盐酸作载流液载带试样溶液，试样溶液在反应管中与硼氢化钾溶液混合并发生化学百学须先立志。朱熹人人好公，则天下太平
6、；人人营私，则天下大乱。刘鹗反应，四价态硒被还原为硒化氢气体，被载气带入电加热石英管原子化器中，硒被原子化成基态原子蒸气。当硒空心阴极灯发射的特征谱线(196.0 nm)通过石英管时，被基态原子所吸收。在一定实验条件下，其吸光度与试样溶液中硒浓度呈正比，与标准系列比较定量。其分析线波长 196.0 nm，光谱通带 0.4 nm，灯电流 5.0 mA，测量方式为峰高，硼氢化钾浓度 5g.L-1，盐酸载液浓度 0.5 mol.L-1，载气流速 200 ml/min，石英管加热电压 120v。该法检出限为每毫升 0.19 ng，线性范围为每毫升 0.8-28.0 ng，相对标准偏差为 3.0%-4.
7、1%，样品加标回收率为 89.9%-99.3%。方法具有灵敏度高，选择性好，简便快速，试剂和样品用量少，精密度和准确度均较高等优点，能够满足常规样品的分析。1.6石墨炉一原子吸收法 将试样或消解处理过的试样直接注入石墨炉，在石墨炉中形成的基态原子对特征电磁辐射产生吸收，将测定的试样吸光度与标准溶液的吸光度进行比较，确定试样中被测元素的浓度。该方法检测限为 0.003 mgL-1，测定范围为0.015-0.2 mgL-1，但在金属离子和非金属离子达到一定浓度时均会对硒的测定产生干扰。1.7催化动力学光度法 在盐酸介质中痕量 Se()能催化 H202氧化甲基红退色，由此建立了一种测定痕量硒的催化动
8、力学新方法。该方法的最大吸收波长为 520 nm，线性范围为 0-52t g.L-1，检出限为 1.6 g.L-1。该法用于茶叶等样品中硒的测定，结果满意。1.8高效液相色谱法 以铜为镜，可以正衣冠；以古为镜，可以知兴替；以人为镜，可以明得失。旧唐书魏征列传云路鹏程九万里，雪窗萤火二十年。王实甫四价硒离子与 2，3 一二氨基萘反应生成 4，5 一苯并苤硒脑绿色荧光物质，被环已烷萃取后，在乙腈一水体系中的荧光强度比在甲醇一水体系中的荧光强度强，在 100%乙腈中荧光强度最强，且峰分离最好，灵敏度最高，所以选用 100%乙腈为流动相，选用适当的检测波长，硒含量在 0-20 g 范围内与峰高呈线性关
9、系，加样回收率为 94.3%-103%。采用该法的优势在于：通过色谱柱能够将4，5 一苯并苤硒脑与其它杂质产生的荧光物质分离，消除了杂质与 2，3 一二氨基萘形成的荧光物质的干扰，从而使检测结果更准确。其次，有研究者采用微波消解法对试验样品进行消解，分别通过 ICP-MS法、HPLC/荧光法和 3，3 一二氨基联苯胺比色法三种方法测定了富硒蛹虫草菌丝体中硒的含量，对上述几种硒含量测定方法的工作条件、检出限和精确度进行了对比研究。实验结果表明：ICP-MS法、HPLC/荧光法和 3，3 一二氨基联苯胺比色法的检出限分别为 0.2607，0.1821和 10.4859 g.L-1ICP-MS 法的
10、检出限最低，3，3 一二氨基联苯胺比色法的检出限最高。在精密度方面，对同一样品以 ICP-MS 法测硒的标准差为最低，以 3，3 一二氨基联苯胺比色法测硒为最高。建议当分析样品中硒含量很低时，可选用 HPLC/荧光法和 ICP-MS法，如分析样品含硒量相对较大，可采用 3，3 一二氨基联苯胺比色法。2 有机硒的检测方法 硒在生物体内主要以有机硒化合物的形态存在，主要包括硒氨基酸、硒蛋白、硒核酸和硒多糖等。硒代氨基酸最主要的是硒代胱氨酸(Se-Cys)和硒代蛋氨酸(Se-Met)，其次是硒甲基半胱氨酸，其检测方法发展很快，主要进展如下：2.1 高效液相色谱(HPLC)法 云路鹏程九万里，雪窗萤火
11、二十年。王实甫勿以恶小而为之，勿以善小而不为。刘备硒代氨基酸也是氨基酸，能够与 6 一氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基一氨基甲酸酯(AQC)、邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯(PICT)等多种衍生剂反应生成具有紫外吸收和荧光的衍生物，通过高效液相色谱仪分离，利用紫外或荧光检测器进行检测。利用该方法我实验室也做了大量的研究工作，发现存在的主要问题是样品水解后会产生大量的非含硒氨基酸，不论是采用柱前衍生还是柱后衍生的方法，都无法消除其它氨基酸的干扰，其它氨基酸的大峰会使实际样品中的含硒氨基酸无法检测，尽管有研究者采用电磁消解的方法来增强含硒氨基酸的检测信号，因此，该法适合于硒代氨基酸原料药的检测，
12、在农副产品中应用依然十分困难。2.2 液质联用(LC-MS)法 2.2.1高效液相色谱一电感耦合等离子体质谱(RP-IPHPLC)法 用反相离子对高效液相色谱(RP-IPHPLC)分离含硒化合物，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)在线分析硒含量，与标准化合物的色谱图和工作曲线对照进行定性和定量分析，可以实现对硒酸钠、亚硒酸钠、硒代胱氨酸、硒代胱胺、硒代蛋氨酸、硒代尿素和三甲基硒离子等 7 种生物体常见的含硒小分子的分析，检出限为 0.11.5 g.L-1；线性范围为 1-100 g.L-1，应用于人血清、尿、肝组织细胞质溶胶等样品中含硒小分子的形态分析，所需进样量仅 50 L，各含硒化合物
13、加标回收率在 93%-117%。本方法操作简便，灵敏度高，重现性好，适合于各种生物样品中含硒小分子的形态分析。也有研究者采用反相离子对缓冲盐3 个色谱系统的高效液相色谱与电感耦合等离子质谱联用(RP-HPLC-ICP-MS)法，研究了海带对硒的富集总量及硒化学形态转变，测定了亚硒酸钠、硒甲基半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)三种硒形态。丹青不知老将至，贫贱于我如浮云。杜甫百学须先立志。朱熹2.2.2液相色谱一串联质谱法(LC-MS MS)以反相 C18色谱柱为分离柱，甲醇+0.1%七氟丁酸水溶液(35+65)流动相，流速为 500 L/min；以氮气为碰撞气，利用多反应离子监
14、测方式测定 SeMet(MRM m/z 198.1 181.0，198.1152.0)和 SeCys(MRM m/z 337.0 248.0,337.088.2)信号。SeCys和 SeMet检出限分别为每毫升 2.0 ng和 0.5 ng，该方法能够使 2 种含硒化合物在一次进样中实现完全分离和在线测定，能够满足快速准确检测 SeCys和 SeMet含量要求。2.3液相色谱一双通道原子荧光联用法 以 10 mmolL-1 NH4H2P04溶液（pH 5.6，添加 2.5%的甲醇）为流动相，以高效液相色谱对样品中的硒代胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)和四价硒Se()分离后，用双通
15、道原子荧光进行检测，检出限分别为 4、18 和 3 g.L-1，可用于尿样及药品中硒形态的日常分析。2.4 气相色谱(GC)法 将硒半胱氨酸(SeCysH)甲基化，硒胱氨酸(Se-Cys)还原后再甲基化。它们生成的甲基硒半胱氨酸(CH3 SeCysH)能与溴化氰(CNBr)发生专一性反应，定量生成的硒氰酸甲酯(CH3 SeCN)可用气相色谱法(GC)测定。此法简称 CNBr-GC法，检测限 4 10-8g SeCys，准确度 89.5%，相对标准差2.1%，非含硒氨基酸不干扰。此法适于样品中微量硒氨基酸（SeMet，SeCysH和 seCys）的测定。2.5 气一质联用(GC-MS)法 将提取
16、的蛋白样品在 6 molL-1HC1溶液中，超声处理 20 min，离心分离后，以丁醇及三氟乙酸酐为衍生化试剂对硒蛋氨酸进行衍生化，采用选择离子监测模式对衍生物进行 GC-MS测定，硒蛋氨酸的回收率为 97.6%-105.2%，相对标准偏差为 1.7%-3.6%，检出限为 0.3 mg-L-1，该法样品前处理简单，测定好学近乎知，力行近乎仁，知耻近乎勇。中庸谋事在人，成事在天！增广贤文快速，结果准确，灵敏度高，可用于植物样品中硒蛋氨酸含量的测定。另有研究者以氯甲酸乙酯作衍生化试剂，利用串联质谱技术在多离子监测模式下对硒甲基硒半胱氨酸和硒蛋氨酸衍生物进行 GC-MS/MS测定，方法的线性范围为
17、0.01-25 mgL-1，线性相关系数 r O.998 8；方法检出限分别为硒甲基硒半胱氨酸(Met-Se-cys)4 g.L-1、硒蛋氨酸(Se-Met)2 g.L-1;Met-Se-Cys的方法回收率为 82%-97%，RSD小于 6.3%，Se-met的方法回收率为 100%-109%，RSD小于 7.5%。该方法简单、快速、准确，并能有效排除基质的干扰，适合于食品中硒甲基硒半胱氨酸和硒蛋氨酸的定性定量分析。3 结语 有机硒的分析近来得到了很大的发展，但均以总硒和硒代氨基酸的检测方法为主，有机硒主要以硒蛋白、硒氨基酸的形式存在外，还以硒多糖、硒甲醚等其它形式存在，难以分离提取或完全提取
18、，单独检测其中的某一种或几种成分，不能代表有机硒的含量。因此，现仍以采用总硒减去无机硒的方法得到有机硒的含量较为合理，但采用该法不能检测有机硒的形态。各实验室应根据自己研究和企业产品开发的需要，选择适合的检测方法。氨基酸和生物资源 2010.2 食用茵病毒脱毒方法的比较 张朝辉，刘映淼，戚元成，高玉千，申进文，邱立友(河南农业大学 生命科学学院，郑州 450002)摘要：应用 dsRNA技术从平菇天达 300（Pleurotus ostreatus TD300）菌丝中提取到 4 条 dsRNA条带，大小分别是 8.2、2.5、2.1和 1.lkb。采用菌丝尖海纳百川，有容乃大；壁立千仞，无欲则
19、刚。林则徐人不知而不愠，不亦君子乎？论语端脱毒法、原生质体再生法、冷冻真空干燥法和单孢杂交法进行脱毒，各得到一株脱毒菌株，分别是 HTC8、PR15、FL01和 SSHll。脱毒菌株 HTC8仅残留有低含量的 8.2kb dsRNA，PR15和 SSH11完全脱去 dsRNA，而 FL01仍残留有低浓度的8.2kb和 2.5 kb dsRNA。该 4 株脱毒菌株的菌丝生长速度和漆酶活力均比出发菌种有不同程度的提高，尤其是 HTC8和 PR15，菌丝生长速度比出发菌种分别提高22.73%和 18.18%，漆酶活力比出发菌种分别提高 145.83%和 134.38%o。综合比较此 4 种脱毒方法，
20、菌丝尖端脱毒法和原生质体再生脱毒法比冷冻真空干燥法和单孢杂交法脱毒效果好，制备脱毒菌株用时短、效率高。关键词：平菇；脱毒；菌丝生长速度；漆酶 1948年，美国宾夕法尼亚州 La Franch兄弟，在双孢蘑菇（Agaricus bisporus）菇床上发现了一种菌柄有黑色斑点和水渍状的蘑菇病害，这就是著名的法兰西蘑菇病。1960年 Holling第一次从病蘑菇的子实体中分离出并在电镜下发现了3 种类型的病毒颗粒。此后，在香菇（Lentinus edodes）、平菇（Pleurotus ostreatus）、金针菇（Flammulina velutipes）等多种食用菌中发现病毒。食用菌感染病毒严
21、重影响其产量和质量。双孢蘑菇罹患法兰西病导致菌丝退化、生长缓慢，菌丝体褐色，子实体畸形、质地改变、腐烂，孢子变小、萌发快等。罹患蘑菇病毒 X(MVX)病导致床层中出现一些区域没有子实体形成，或子实体畸形、呈褐色等。平菇感染病毒同样导致菌丝生长缓慢，出菇延迟，子实体畸形，严重减产。防治食用菌病毒病的最有效的方法是预防，在生产的全过程做好清洁卫生工作，制备和应用脱毒菌种也是防治食用菌病毒病的有效措施。制备脱毒菌种的方法已报道的有菌丝尖端脱毒法和原基组织脱毒法。菌丝尖端脱毒法是切取尖端菌以家为家，以乡为乡，以国为国，以天下为天下。管子牧民常将有日思无日，莫待无时思有时。增广贤文丝进行继代培养，如此反
22、复 4 5 次进行脱毒，电镜观察没有发现菌丝中含有病毒粒子。原基组织脱毒法是取原基组织进行分离培养得到脱毒菌种，但脱毒效果没有检测。周素静应用该方法制备平菇新 931和豫 6 脱毒菌种，用 dsRNA技术检测发现只能脱去部分 dsRNA条带。Mdrquez等采用冷冻真空干燥法可完全脱去植物共生菌管突弯孢（Curvulzzria protuberate）所含的 dsRNA，方法是将菌丝先经-80冷冻 30 min，然后真空干燥过夜，得到的菌丝片段液体培养后进行平板分离，对单菌落进行 dsRNA检测，从中选择不含 dsRNA的菌株。该方法是否适用于食用菌菌种的脱毒尚未见报道。van der Len
23、de等报道在制备的平菇原生质体再生菌株中有少数菌株不含有dsRNA，且生长速度显著高于出发菌种和含有 dsRNA的菌株。因此，从原生质体再生菌株中也可以得到脱毒菌株进行菌种脱毒。一般认为食用菌的孢子带有病毒，是病毒的主要传播者，但平菇 Shin-Nong菌株的担孢子萌发形成的单核菌丝经检测仅 26%含有病毒。所以，利用不带病毒的担孢子形成的单核菌丝经单孢杂交亦可能制备脱毒菌种。本文分别应用菌丝尖端脱毒法、原生质体再生法、冷冻真空干燥法和单孢杂交法制备了平菇天达 300的脱毒菌种，并对脱毒菌种的生物学特性进行了比较。材料与方法 1 菌株 平菇天达 300（Pleurotus ostreatus
24、TD300），河南农业大学生命科学学院微生物实验室保存。我尽一杯，与君发三愿：一愿世清平，二愿身强健，三愿临老头，数与君相见。白居易老当益壮，宁移白首之心；穷且益坚，不坠青云之志。唐王勃2 培养基 PDA加富培养基：马铃薯 2009（马铃薯加水煮沸 0.5h，双层纱布过滤，取汁），蛋白胨 19，葡萄糖 209，酵母膏 19，硫酸镁 29，磷酸二氢钾 29，琼脂 209，补加蒸馏水至 1 000ml。马铃薯液体培养基：马铃薯 2009（马铃薯加水煮沸 0.5h，双层纱布过滤，取汁），葡萄糖 209，补加蒸馏水至 1000ml。RCM再生培养基：蛋白胨 29，酵母膏 2.0g，硫酸镁 0.5g，磷
25、酸二氢钾 0.46g，磷酸氢二钾 19，葡萄糖 209，琼脂 209，甘露醇 109.3g，蒸馏水 1 000ml。试管固体培养基：棉籽壳 909，麸皮 109，水 110ml，pH6.5。3 脱毒菌种的制备 3.1 菌丝尖端脱毒 平菇天达 300斜面菌种接种在 PDA加富培养基平板中，25培养 5d，切取菌落最边缘的尖端 2 mm幼嫩菌丝，接种在相同培养基的乎板中，25培养 5d 后再切取尖端菌丝进行继代培养，如此连续 8 次，移接 PDA斜面培养、4 保存，检测是否含有病毒 dsRNA。3.2原生质体再生脱毒 采用李成等的方法制备平菇天达 300的原生质体，将原生质体涂布在 RCM再生培养
26、基平板中，25培养 7d，挑取再生菌落接种于 PDA平板中，25培养 5d，选择生长快、镜检菌丝具锁状联合的菌落移接PDA斜面培养、保存，检测是否含有病毒 dsRNA。3.3 单孢杂交法 按赵柏叶等的方法采集平菇天达 300担孢子，用无菌水洗涤收集器，得到的孢子悬液进行梯度稀释后涂 PDA平板，25培养 7d，挑取单菌落移接至 PDA试管，25培养，镜检无锁状联合者即为单核菌株。将检测不含病毒 dsRNA的单核菌株两两对峙接种在 PDA平板中，取交接的菌丝镜检，移接存在锁状联合者至 PDA斜面中培养、4 保存，检测是否含有病毒 dsRNA。宠辱不惊，看庭前花开花落；去留无意，望天上云卷云舒。洪
27、应明丈夫志四方，有事先悬弧，焉能钧三江，终年守菰蒲。顾炎武3.4冷冻真空干燥法参考 Mdrquez等的方法。将平菇天达 300菌丝接种到马铃薯液体培养基中，25静置培养 5 7d，用无菌镊子取少量表层边缘的菌丝，转移到一只无菌的 50ml三角瓶中，加入 500ul10%脱脂牛奶，80冷冻 30min，然后放人冷冻真空干燥器中干燥，至水分基本抽干，一般 4 6h。将干燥的菌丝稍打碎，先接种马铃薯液体培基进行培养，在观察到菌丝开始生长时即转移到PDA平板上，25培养 3 5d，随后转移至 PDA斜面试管上培养、4 保存，并检测所得的菌株是否含有病毒 dsRNA。4 dsRNA技术检测菌丝体中的 d
28、sRNA 按 Morris和 Dodds21和邱立友等方法。取 3.0g平菇天达 300菌丝，加入 3ml提取缓冲液(0.2 mol/L甘氨酸，0.lmol/L Na2 P04，0.6mol/L NaC1，pH 9.5)，在研钵中充分研磨后，加入 3ml饱和酚、1.5ml氯仿异五醇(25：1)、0.03rnl 10%的 SDS和 0.03ml B一巯基乙醇，研磨成匀浆，在冰上放 30min，偶尔轻轻摇动以形成乳浊液。研磨的混合物在 8 000 g/min(4)，离心 20min，保留淡黄色的上层水相，加入无水乙醇至终浓度为 15%(v/v)。称取 1.5gCF-11纤维素粉末(Sigma)，添
29、加至上述混和物中，混匀后倒入 10 ml 注射器内（注射器乳头顶部垫有玻璃纤维）；用 150ml含 15%乙醇的 1 STE缓冲液(0.2 mol/LNaC1、0.1 mol/L Tris、0.002 mol/L EDTA，pH 7.0)进行洗脱（直到 260 nm吸光值为零），弃去洗脱液，再用 10ml 1STE缓冲液洗脱，收集洗脱液，加入 2 倍体积无水乙醇和 1/10体积的 2 mol/L乙酸钠(pH6.0)溶液，20过夜析出 dsRNA。12 000 r/min，4，离心 20 min，收集核酸沉淀，室温下干燥，然后重悬于 100ul双蒸水中。用 1%琼脂糖凝胶电泳(恒压 60V)，至
30、溴酚蓝前沿接近胶板下边缘为止。然后用 0.5g/ml溴化乙锭溶液染忍一句，息一怒，饶一着，退一步。增广贤文常将有日思无日，莫待无时思有时。增广贤文色 1030min，观察 dsRNA带型。DNA分子量标记是 Hind III digest DNA Marker(TaKaRa).5 菌丝生长速度的测定分别取源自不同脱毒菌株的直径 lcm的菌块接入 PDA加富平板中心，25培养，从第 3d 起通过每天划线测定平板中菌丝生长速度，设置未脱毒的出发菌种作为对照。各菌株重复 3 板。6 脱毒菌株漆酶活力的比较 分别取取源自不同脱毒菌株的直径 1 cm的菌块接入含有 100 ml马铃薯液体培养基的 500
31、ml三角瓶中，25以 200 r/min振荡培养 9d，取培养液上清，按胡平平等的方法测定漆酶活力。各菌株重复 3 瓶。7 统计分析脱毒菌株及其出发菌株的菌丝生长速度和漆酶活力值均为三次重复的平均值，差异显著性分析采用 t 测验。结 果 1 四种脱毒方法得到的脱毒菌种中 dsRNA检测结果 食用菌和真菌病毒绝大多数属于 dsRNA病毒。正常真菌细胞中并不含有大分子 dsRNA，如检测出含有 dsRNA就表明受到了病毒感染。应用 dsRNA技术检测，并经 DNase和 RNase A酶切验证，平菇天达 300出发菌种含有 4 个 dsRNA条带，根据 BioCaptMW软件计算，其大小分别是 8
32、.2kb、2.5kb、2，lkb和 1.lkb。其中1.lkb条带的量很少，是否出现有较大的偶然性。8.2kh条带为双线(doublet)，也就是有两个大小非常相近的片段，在琼脂糖凝胶电泳中不易分开（图 1）。应用菌丝尖端脱毒经过 5 8 代，菌丝中 dsR-NA的含量明显减少，尤其是8.2kb条带，但并不能完全脱去（图 2）。通过原生质体再生法得到多个再生菌株，有的菌株完全脱去 8.2kb条带（如 PR09），有的菌株完全脱去 8.2kb条带和 2.lkb条带(如 PR22)，有的菌株则完全脱去 8.2kb、2.5kb和 2.lkb三条带古之立大事者，不惟有超世之才，亦必有坚忍不拔之志。苏轼
33、忍一句，息一怒，饶一着，退一步。增广贤文（如 PR15）（图 3）。所以，该方法为我们进一步研究不同 dsRNA条带对菌株的影响创造了条件，从中可能寻找出导致病毒病暴发的关键 dsRNA条带。用 dsRNA技术检测了平菇天达 300的 23 株担孢子萌发形成的单核菌丝，发现仅有 2 株带有 dsRNA条带。将不含 dsRNA的单核菌丝两两配对，得到 2 株双核菌株 SSH06和 SSH11，经检测该 2 菌株不含任何 dsRNA条带（图 4），但这种方法制备的脱毒菌株要进一步进行出菇实验才能得到可以用于生产的菌株。采用冷冻真空干燥法得到 4 株脱毒菌株，菌株 FL04含有 3 条 dsRNA条
34、带，FL01、2 脱毒菌种菌丝生长速度的比较 在 PDA加富平板中培养采用不同脱毒方法制备的脱毒菌种，其生长速度测定结果见图 6。从图 6 可以看出，菌丝尖端脱毒菌株 HTC8、原生质体再生脱毒菌株PR15和单孢杂交脱毒菌株 SSH11生长速度显著高于出发菌种(P0.01)，分别比出发菌种提高 22.73%、18.18%和 17.27%，而冷冻真空干燥脱毒菌株 FL01生长速度与出发菌种没有差异。另外，脱毒菌株 HTC8生长速度显著高于 PR15和SSHll(P0.01)，后二者之间则没有差异。3 脱毒菌种漆酶活力的比较 漆酶是食用菌主要的胞外蛋白，与菌丝生物量和子实体产量呈显著正相关。4 株
35、脱毒菌株的漆酶活力均显著高于出发菌种(P0.01或 P0.05)，比出发菌种分别提高 145.83%、134.38%、32.64%和 17.71%。4 株脱毒菌株之间漆酶活力相比较，尖端脱毒菌株 HTC8最高，显著高于另 3 株脱毒菌株(P0.01)，其次是原生质体再生脱毒菌株 PR15，酶活力显著高于单孢杂交脱毒菌株 SSHI1和冷冻真空干燥脱毒菌株 FL01(P%0.01)（图 7）。讨 论 古之立大事者，不惟有超世之才，亦必有坚忍不拔之志。苏轼云路鹏程九万里，雪窗萤火二十年。王实甫平菇病毒病和平菇病毒主要存在于中国和韩国。周素静在平菇豫 6 和新 831中均发现含有 8.2kb、2.5k
36、b和 1.lkb的 3 个 dsRNA条带，比我们从平菇天达 300中提取的 dsRNA条带仅少 l 条。从韩国平菇佛罗里达菌株(Postreatus var.florida)中提取得到 5 个 dsRNA条带，大小分别是 8 kb、2.4 kb、2.1 kb、1.9 kb 和 1.7kb。从另一来自韩国的平菇菌株 ASI2596中分离得到 2 个 dsRNA条带，大小分别是 2.3kb和 2.2kb。另一韩国的平菇菌株 ASI 2504中含有 3 个 dsRNA条带，大小分别是 2.0 kb、1.84 kb 和 1.82 kb。对平菇天达 300所含 3 个 dsRNA条带 8.2kb、2.
37、5kb和 2.lkb的碱基序列分析表明，已测定的 8.2kb条带的部分序列与平菇球状 ssRNA病毒(OMSV)的核酸同源性最高，达 95%;已测定的 2.5kb和 2.lkb条带的部分序列分别与平菇 dsR-NA病毒 PoVI的 RNA1和 CP 蛋白基因序列的核酸同源性最高，分别是 83%和 73%。由于真菌病毒主要是通过孢子和同种间具亲和性的菌丝融合进行传播，所以真菌病毒传播的寄主范围狭窄。以上结果证明了这一点，同时还表明我国平菇栽培菌种间及我国与韩国平菇栽培菌种间可能存在很高的同源性，具有相同的起源。采用菌丝尖端脱毒法、原生质体再生法、冷冻真空干燥法和单孢杂交法均可有效地脱去平菇天达
38、300所含的 dsRNA病毒，尤其是原生质体再生法和单孢杂交法，可完全脱去 dsRNA病毒(图 2 图 5)。脱毒菌株菌丝生长速度和漆酶活力与出发菌种相比，均有不同程度的提高，尤其是菌丝尖端脱毒菌株 HTC8和原生质体再生脱毒菌株 PR15，菌丝生长速度比出发菌种分别提高 22.73%和 18.18%，漆酶活力比出发菌种分别提高145.83%和 134.38%。这些脱毒菌株能否正常出菇、菇产量是否提高还有待进一步实验。百学须先立志。朱熹先天下之忧而忧，后天下之乐而乐。范仲淹菌丝尖端脱毒法、原生质体再生法和单孢杂交法脱毒的机理可能相同，即均为菌丝尖端脱毒，与植物根尖和茎尖脱毒机理相同。菌丝尖端脱
39、毒法如能与热处理相结合，其脱毒效果将更好。单孢杂交法所利用的单核菌丝是来自担子的顶端细胞形成的担孢子。原生质体再生法得到的脱毒菌株亦主要是来自菌丝尖端细胞口胡。Magae等从平菇原生质体再生菌株中随机选取 6 个菌株，均能形成子实体，其中 5 株的产量比出发菌种高，认为是在原生质体再生过程中发生了有益的突变。我们认为可能是原生质体再生脱毒的结果。单孢杂交法脱毒菌株 SSH11尽管不含有任何 dsRNA，但其菌丝生长速度和漆酶活力则低于菌丝尖端脱毒菌株 HTC8和原生质体再生脱毒菌株 PR15，其原因可能还与其基因组与出发菌种有差异有关。另外，由源自同一子实体的不同担孢子形成的单核菌丝杂交产生的
40、双核菌丝在生长速度和漆酶活力方面存在较大差异，有些子代比亲本高，有些子代则比亲本低。冷冻真空干燥法的脱毒机理则是冷冻真空干燥能够破坏真菌菌丝中的病毒颗粒，从而得到脱毒菌种。我们利用该方法得到脱毒菌株 FL01除含有 8.2kb条带外，还含有其他脱毒菌株不含有的 2.5kb条带，脱毒效果比其他三种方法要差，这也可能是 FL01菌株生长速度和漆酶活力低于其他 3 株脱毒菌株的原因。从脱毒方法的简便易行方面进行比较，菌丝尖端脱毒法和单孢杂交法具有优势，不需要复杂的仪器设备；从脱毒效果和制备脱毒菌株的时间方面进行比较，菌丝尖端脱毒法和原生质体再生脱毒法具有优势。综合以上分析，平菇菌种菌丝尖端脱毒法和原生质体再生脱毒法比冷冻真空干燥法和单孢杂交法脱毒效果好，制备脱毒菌株用时短、效率高，对其他食用菌脱毒菌种制备亦有借鉴意义。陈永波，薛仁梅，马作江，向常青，王尔惠，刘二喜 常将有日思无日，莫待无时思有时。增广贤文云路鹏程九万里，雪窗萤火二十年。王实甫（湖北省恩施州农科院组织培养检测中心湖北，恩施 445000）病毒学报 2010.3