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1、生物药物分析与检验氨基酸、多肽和蛋白质类药品检验全解基本内容基本内容第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验多肽因子类和蛋白质类药品检验第三节第三节 几种氨基酸、多肽和蛋白质药物的质量分析几种氨基酸、多肽和蛋白质药物的质量分析第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验氨基酸是氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱治疗蛋白质代谢紊乱、蛋白质缺损蛋白质缺损所引起的所引起的一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。目前氨基
2、酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创制了一些新的生化药物制了一些新的生化药物。如如甲基酪氨酸甲基酪氨酸治疗治疗嗜铬细胞瘤嗜铬细胞瘤氧苯丙氨酸氧苯丙氨酸用于用于类癌瘤综合征类癌瘤综合征偶氮丝氨酸偶氮丝氨酸治疗治疗白血病白血病乙酰羟脯氨酸乙酰羟脯氨酸用于用于治疗类风湿关节炎治疗类风湿关节炎第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验氨基酸为氨基酸为白色晶状体白色晶状体，熔点很高，多在熔融时分解，熔点很高，多在熔融时分解，都能溶解在强酸强碱中都能溶解在强酸强碱中，形成的盐多能溶于水。，形成的盐多能溶于水。氨基酸在氨基酸在等电点等电点（pIpI）时）时
3、溶解度最小溶解度最小，最稳定。，最稳定。中性中性pIpI值在值在5 56.36.3左右。左右。酸性酸性pIpI值在值在2.82.83.23.2左右。左右。碱性氨基酸的碱性氨基酸的pIpI值在值在7.67.610.810.8左右。左右。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验一、氨基酸的定性鉴别一、氨基酸的定性鉴别旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析、旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析、气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。1 1、化学鉴别法、化学鉴别法氨基酸的氨基酸的鉴别最常用的方法鉴别最常用的方法是根据所有氨基酸均能与是根据所有氨
4、基酸均能与茚三酮茚三酮显蓝紫色显蓝紫色。采用茚三酮显色法，中国药典（采用茚三酮显色法，中国药典（20102010年）二部对所收年）二部对所收载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验 茚三酮反应：茚三酮反应：茚三酮在酸性溶液中与茚三酮在酸性溶液中与-氨基酸共热，氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色物质。引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色物质。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验2 2、光谱鉴别法、光谱鉴别法（1 1）紫紫外外吸吸收收光光谱谱法法 在在2020种种天天然然氨氨基
5、基酸酸中中，只只有有酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸和和苯苯丙丙氨氨酸酸在紫外区有最大吸收在紫外区有最大吸收。酪氨酸酪氨酸的的 max275nm苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max257nm 色氨酸的色氨酸的 max280nm1 1：酪氨酸：酪氨酸2 2：色氨酸：色氨酸3 3：苯丙氨酸。：苯丙氨酸。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验这这三三种种氨氨基基酸酸可可以以通通过过紫紫外外吸收光谱吸收光谱加以鉴别。加以鉴别。精精密密称称取取酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、苯丙氢酸各适量苯丙氢酸各适量。用用水水制制成成每每1mL1mL含含20g20g（色色氨氨酸酸）、40g40g（酪酪氨氨酸酸）、200g200
6、g（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）。在在波波长长230230300nm300nm测测定定各各氨氨基酸的吸收光谱基酸的吸收光谱，如右图。，如右图。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）红红外外吸吸收收光光谱谱图图 氨氨基基酸酸在在红红外外区区都都有有特特性性图图谱谱，可可以以通通过过与与标标准准氨氨基基酸酸图图谱谱比比较较作作为为氨氨基基酸酸的的鉴鉴别别依依据。据。所所得得的的吸吸收收图图谱谱各各主主要要吸吸收收峰峰波波长长和和各各吸吸收收峰峰间间的的相相互强度关系互强度关系均应与对照的图谱一致。均应与对照的图谱一致。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验3 3、薄层色谱鉴别法
7、、薄层色谱鉴别法在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基酸。酸。（1 1）薄层板的制备薄层板的制备第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）十十一一种种氨氨基基酸酸混混合合液液（色色、蛋蛋、亮亮、异异亮亮、甘甘、赖、苏、缬、苯丙、组、精）与赖、苏、缬、苯丙、组、精）与对照液对照液的的制备制备。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（3 3）点点样样、展展开开和和显显色色 吸吸取取混混合合液液和和对对照照液液各各3L3L，分别点于同一薄层板上，分别点于同一薄层板上。以以正正丁丁醇醇-水水-异异丁丁酸酸-醋醋酸酸（50505
8、0505 57 7）之之上上层层作作展展开开剂剂，进进行行单单向向三三次次展展开开，展展开开约约15cm15cm，每每次次必必须须待溶剂挥发尽待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开后，再进行下一次展开。喷喷以以显显色色剂剂（吲吲哚哚醌醌1g1g，溶溶于于100mL100mL无无水水乙乙醇醇和和10mL10mL冰醋酸中）置冰醋酸中）置100100干燥干燥5 510min10min至显色完全为止至显色完全为止。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验本本层层析析系系统统中中，由由于于分分离离的的程程度度与与各各种种氨氨基基酸酸显显出出不不同同的的颜颜色色，可可以以区别十一种氨基酸。区别十一种氨基酸
9、。用用茚茚三三酮酮-硝硝酸酸钠钠试试剂剂亦亦能能显显出出不不同同颜颜色色的的色色斑，且灵敏度较高斑，且灵敏度较高。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验4 4、旋光性旋光性 除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有旋光性旋光性，且每，且每种氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作为氨种氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作为氨基酸药物的鉴别指标。基酸药物的鉴别指标。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验二、氨基酸特殊杂质及安全性检查二、氨基酸特殊杂质及安全性检查1 1、特殊杂质检查、特殊杂质检查氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类氨基酸原料药
10、所含有的特殊杂质一般为一些其他种类的氨基酸的氨基酸。用用薄层色谱法薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的进行限量检查：将样品配成一定浓度的供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在同一硅胶同一硅胶G G薄板上，一般用薄板上，一般用正丁醇水冰醋酸正丁醇水冰醋酸（3 31 11 1）展开晾干后，喷）展开晾干后，喷茚三酮茚三酮的的丙酮溶液丙酮溶液显色，规定显色，规定供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点，以此限制其他氨基酸的含量。以此限制其他氨基酸的含量。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药
11、品检验2 2、安全性检查、安全性检查影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要为热原的含量。为热原的含量。中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。采用采用家兔法家兔法，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内观察内，在规定时间内观察家兔体温升高家兔体温升高的情况，以判定的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。供试品中所含热原的限度是否符合规定。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验三、氨基酸含量测定三、氨基酸含量测定1 1、茚三酮
12、法、茚三酮法茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。当当茚三酮茚三酮在在酸性条件酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧下和氨基酸反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分子茚三酮进一步缩合生成子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色物蓝紫色物，最大吸收值的波，最大吸收值的波长为长为570nm570nm。茚三酮反应为一切茚三酮反应为一切-氨基酸氨基酸所共有，反应灵敏，根所共有，反应灵敏，根据反应所生成
13、的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。本法可允许的测定范围是本法可允许的测定范围是0.50.550g50g氨基酸氨基酸。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验2 2、酸碱滴、酸碱滴定法定法谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸赖氨酸（赖氨酸（lysinelysine）片中赖氨酸的测定）片中赖氨酸的测定取取本本品品2020片片，精精密密称称定定，研研细细，精精密密称称取取适适量量（约约相相当当于于赖赖氨氨酸酸0.15g0.15g）置置烧烧杯杯中中，加加水水25mL25mL，滴滴加加氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mo
14、l/L），用用酸酸度度计计调调节节至至pHpH值值为为7.07.0，加加入入预预先先调调节节至至pHpH值值9.09.0的的甲甲醛醛溶溶液液15mL15mL，搅搅匀匀，再再用用氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）滴滴定定至至pHpH值值为为9.09.0，并持续，并持续30s30s。按按加加入入甲甲醛醛液液后后所所耗耗用用氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）体体积积计计算算，每每毫毫升升氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）相相当当于于9.132mg9.132mg的的C C6 6H H1414N N2 2O O2
15、2HClHCl。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验3 3、非水溶液滴定法、非水溶液滴定法中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药物，除物，除谷氨酸谷氨酸用用氢氧化钠氢氧化钠为标准溶液的酸碱滴定法，为标准溶液的酸碱滴定法，其余均根据其结构特性，采用了其余均根据其结构特性，采用了非水酸碱滴定法非水酸碱滴定法。用用冰醋酸作溶剂冰醋酸作溶剂，高氯酸高氯酸作作标准溶液滴定，电位法或标准溶液滴定，电位法或指示剂法确定终点。指示剂法确定终点。适用于适用于常量氨基酸常量氨基酸的含量测定。的含量测定。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验4
16、 4、定氮法定氮法精氨酸和天冬酰胺精氨酸和天冬酰胺的原料及其制剂可以采用定氮法测的原料及其制剂可以采用定氮法测定含量定含量。将被测药物置于凯式烧瓶中，加浓硫酸、硫酸盐及适将被测药物置于凯式烧瓶中，加浓硫酸、硫酸盐及适量的催化剂，加热进行有机物的破坏，其中所含的氮量的催化剂，加热进行有机物的破坏，其中所含的氮完全转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵与强完全转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵与强碱反应，放出氨，将其蒸出，吸收于定量酸溶液，酸碱反应，放出氨，将其蒸出，吸收于定量酸溶液，酸碱滴定法滴定，从而计算出氮的含量并换算成被测药碱滴定法滴定，从而计算出氮的含量并换算成被测药物的含量。物的含
17、量。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验5 5、HPLCHPLC对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前较多地采用了高效液相色谱法（较多地采用了高效液相色谱法（HPLCHPLC）。）。因大多数氨基酸因大多数氨基酸没有紫外吸收没有紫外吸收，不能用紫外检测器测，不能用紫外检测器测定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需进行进行化学衍生化化学衍生化。衍生方式包括衍生方式包括柱后衍生法柱后衍生法和和柱前衍生法柱前衍生法。柱后衍生法是将样品经离子交换柱分离后进行衍生柱后衍生法是将样品经离子交
18、换柱分离后进行衍生；柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行HPLCHPLC分分离离。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验多肽因子类和蛋白质类药品检验蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。多肽因子类药物多肽因子类药物指分子量不算太大的，在体内含量极微，指分子量不算太大的，在体内含量极微，但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细
19、胞介其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞介素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术生产素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术生产的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组乙肝疫的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组乙肝疫苗等。苗等。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验一、多肽因子类药物的定性鉴别一、多肽因子类药物的定性鉴别基因重组多肽因子类药物的基因重组多肽因子类药物的鉴别鉴别主要采用主要采用SDS-PAGESDS-PAGE法法和和免疫印迹法免疫印迹法。1 1、SDS-PAGESDS-PAGE法法用用SDS-PAGESDS-PAGE鉴别
20、生物样品必须是该品有鉴别生物样品必须是该品有极纯的标准对极纯的标准对照品照品，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标准品有准品有相同的迁移率相同的迁移率，从而鉴别该品。，从而鉴别该品。缺点缺点：必须有标准品；：必须有标准品；凝胶中多肽凝胶中多肽需需保留生物活性，保留生物活性，或能或能够复性够复性，或电泳前可将检测配基，或电泳前可将检测配基与待与待测多肽共价测多肽共价交联交联。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验2 2、蛋白质蛋白质免疫印迹免疫印迹电泳电泳法（转移电泳、法（转移电泳、western blotwester
21、n blot）原原理理：借借助助聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶技技术术，将将生生物物活活性性物物质质高高效效分分离离，分分离离后后的的样样品品可可以以原原位位、定定量量驱驱动动或或吸吸印印在在另另一一种种固固相相载载体体（通通常常用用醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜，简简称称NCNC膜膜）上上，能能保保持持原原有有的的生生物物活活性性，可可以以进进行行各各种种生生物物检检测测、免疫识别、扫描、积分和保存。免疫识别、扫描、积分和保存。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（1 1）基本操作）基本操作 分分3 3个部分个部分：聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳；转转移电
22、泳移电泳（即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸上上）；检测或鉴定检测或鉴定薄膜上的薄膜上的多肽条带多肽条带。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 先将先将待待分离样品进行凝胶电泳分离样品进行凝胶电泳分离。分离。凝胶可用凝胶可用琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶，也可用，也可用聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶，可以，可以是是均一均一的，也可用的，也可用梯度梯度凝胶，凝胶缓冲体系中可含有凝胶，凝胶缓冲体系中可含有各种各种变性剂变性剂，如，如SDSSDS、LDSLDS、尿素等，可进行、尿素等，可进行单向或双单向或双向电泳向电泳，也可用，也可用等电聚焦电泳等电聚焦电泳。第二节第二
23、节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验转移电泳转移电泳 将将湿湿醋酸纤维素（醋酸纤维素（NCNC）薄膜薄膜紧贴紧贴凝胶凝胶，凝，凝胶与薄膜之间胶与薄膜之间不能有气泡不能有气泡，否则在气泡所在部位的条，否则在气泡所在部位的条带将不能转移，在带将不能转移，在NCNC膜和凝胶的另一侧放上膜和凝胶的另一侧放上两层湿滤两层湿滤纸纸，也，也不能有气泡不能有气泡，再在两边，再在两边贴上海绵贴上海绵，最后用，最后用塑料塑料网框架网框架夹紧，插入夹紧，插入电泳槽电泳槽，根据凝胶中样品，根据凝胶中样品所带电荷所带电荷的性质的性质，决定有，决定有NCNC膜的一边是靠近膜的一边是靠近正极正极还是
24、靠近还是靠近负极负极一侧。一侧。电泳条件取决于凝胶类型、转移装置和蛋白质本身性电泳条件取决于凝胶类型、转移装置和蛋白质本身性质等。一般采用质等。一般采用低电压低电压和和低电流低电流（2mA/cm2mA/cm2 2以内以内）。）。缓冲液中一般含有缓冲液中一般含有2020的甲醇或乙醇的甲醇或乙醇，其作用主要是，其作用主要是保持凝胶的几何形状。保持凝胶的几何形状。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验检测或鉴定检测或鉴定 NC NC膜膜借助借助非共价键非共价键吸附蛋白质吸附蛋白质，经转移，经转移后蛋白质条带就固定在后蛋白质条带就固定在NCNC膜上，膜上，完全保留完全保
25、留凝胶中的凝胶中的蛋蛋白谱白谱，可，可直接直接用考马斯亮蓝、氨基黑用考马斯亮蓝、氨基黑10B10B等等染色染色。如果利用蛋白质生物活性，或用蛋白质生物探针来检如果利用蛋白质生物活性，或用蛋白质生物探针来检测，就要测，就要先用先用1 13 3的牛血清蛋白的牛血清蛋白或血红蛋白，或或血红蛋白，或非离子去垢剂非离子去垢剂（0.30.3吐温吐温-20-20）等）等处理处理NCNC纸纸，以封闭以封闭NCNC纸上未吸附蛋白质区域，使其不再能吸附蛋白质。纸上未吸附蛋白质区域，使其不再能吸附蛋白质。使用非离子去垢剂比较经济，但有可能把使用非离子去垢剂比较经济，但有可能把NCNC纸上的某纸上的某些蛋白质洗掉，同
26、时还要将些蛋白质洗掉，同时还要将NCNC纸反复洗涤以去除变性纸反复洗涤以去除变性剂，剂，第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验二、多肽因子类药物的检查二、多肽因子类药物的检查1 1、分子量检查、分子量检查常用还原型常用还原型SDS-PAGESDS-PAGE法检查分子量，用量约法检查分子量，用量约1g1g。也可采用也可采用凝胶过滤法，例如凝胶过滤法，例如SephadecxSephadecx系列（系列（G-75G-75，-100100）；waters 1waters 16060，125125，250250；Backman TSK Backman TSK 2000SW
27、2000SW，3000SW3000SW，4000SW4000SW。凝胶过滤凝胶过滤是测定是测定完整蛋白质分子完整蛋白质分子的分子量，而的分子量，而SDS-SDS-PAGEPAGE是测定是测定蛋白质亚基蛋白质亚基的分子量，的分子量，同时同时用这用这二种方法二种方法测定同一蛋白质的分子量，可以方便地判断样品蛋白测定同一蛋白质的分子量，可以方便地判断样品蛋白质是否是寡聚蛋白质。质是否是寡聚蛋白质。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验2 2、等电点测定、等电点测定等电点是蛋白质的物理化学常数，它表示蛋白质的带等电点是蛋白质的物理化学常数，它表示蛋白质的带电性质。电性质
28、。一般采用一般采用凝胶等电聚焦电泳凝胶等电聚焦电泳技术测定等电点。技术测定等电点。3 3、紫外吸收、紫外吸收不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收，对于某种不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收，对于某种蛋白质或多肽来说，它的蛋白质或多肽来说，它的最大吸收波长是固定最大吸收波长是固定的。的。紫外吸收光谱紫外吸收光谱是检查蛋白质的一个重要指标。是检查蛋白质的一个重要指标。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验4 4、纯度、纯度基基因因工工程程产产品品蛋蛋白白质质纯纯度度是是一一项项重重要要指指标标，但但它它也也是是一项相对的指标，需一项相对的指标，需根据实际要求而定根
29、据实际要求而定。蛋蛋白白质质纯纯度度一一般般是是指指是是否否含含有有其其他他杂杂蛋蛋白白，而而不不包包括括盐、缓冲液离子、盐、缓冲液离子、SDSSDS等小分子在内。等小分子在内。目目前前较较常常用用的的是是HPLCHPLC法法（包包括括凝凝胶胶过过滤滤、各各种种反反相相HPLCHPLC、离离子子色色谱谱、疏疏水水色色谱谱等等）、非非还还原原SDS-PAGESDS-PAGE凝凝胶电泳法胶电泳法、毛细管电泳法毛细管电泳法（CECE）、）、等电聚焦电泳等电聚焦电泳，此外也应用一些化学方法，观察末端是否均一。此外也应用一些化学方法，观察末端是否均一。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白
30、质类药品检验品检验至至少少应应用用两两种种以以上上的的方方法法，而而且且是是两两种种不不同同分分离离机机理理的方法来判定蛋白质的纯度才比较可靠。的方法来判定蛋白质的纯度才比较可靠。常常发发现现某某一一样样品品在在凝凝胶胶过过滤滤中中是是纯纯的的，而而在在离离子子色色谱谱中却分辨为二个组分，反之亦然。中却分辨为二个组分，反之亦然。又又如如一一种种样样品品用用凝凝胶胶过过滤滤法法和和SDS-PAGESDS-PAGE电电泳泳证证明明是是纯纯的，但这仍不充分，因为这的，但这仍不充分，因为这两两者者机理相同机理相同。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验三三、蛋白质类药物
31、的鉴别和检查、蛋白质类药物的鉴别和检查1 1、蛋白质类药物的鉴别、蛋白质类药物的鉴别蛋蛋白白质质类类药药物物可可根根据据其其各各自自的的物物理理、化化学学性性质质、生生理理作用等采用不同的方法进行鉴别。作用等采用不同的方法进行鉴别。（1 1）茚茚三三酮酮反反应应 组组成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸都都能能与与茚茚三三酮酮反反应应生生成成紫紫色色化化合合物物，因因此此蛋蛋白白质质也也有有此此反反应应，这这是是蛋蛋白质鉴别的最常用方法。白质鉴别的最常用方法。（2 2）福福林林酚酚反反应应或或双双缩缩脲脲反反应应 这这两两种种常常用用来来测测定定蛋蛋白质的含量，但有时也用于蛋白质的鉴别。白质的含量
32、，但有时也用于蛋白质的鉴别。（3 3）紫紫外外吸吸收收 由由于于组组成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸中中，酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸在在紫紫外外区区的的光光吸吸收收特特性性，因因此此可可利利用此种特性鉴别蛋白质。用此种特性鉴别蛋白质。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验五、蛋白质含量测定和效价测定五、蛋白质含量测定和效价测定1 1、蛋白质含量测定、蛋白质含量测定蛋蛋白白质质的的定定量量可可用用化化学学方方法法如如凯凯氏氏定定氮氮法法、双双缩缩脲脲法法、福福林林酚酚法法、紫紫外外光光吸吸收收法法来来测测定定；也也可可用用染染色色法法，如如氨氨基
33、基黑黑、考考马马斯斯亮亮蓝蓝测测定定；此此外外还还可可用用荧荧光光激激发发、氯氯胺胺T T、放射性核素计数放射性核素计数等灵敏度较高方法。等灵敏度较高方法。上上述述方方法法中中凯凯氏氏定定氮氮法法、福福林林酚酚法法、紫紫外外光光吸吸收收法法最最为常用，它们操作简单、设备便宜。为常用，它们操作简单、设备便宜。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（1 1）凯凯氏氏定定氮氮法法 凯凯氏氏定定氮氮法法常常用用来来测测定定有有机机物物的的含含氮氮量。量。原原理理：A A、含含氮氮有有机机物物的的消消化化 当当含含氮氮有有机机物物与与硫硫酸酸共共热热时，分解出氮、二氧化碳
34、、水。时，分解出氮、二氧化碳、水。氮转变出的氨与硫酸化合生成氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵硫酸铵。分分解解反反应应进进行行得得很很慢慢，可可加加入入硫硫酸酸铜铜及及硫硫酸酸钾钾或或硫硫酸酸钠钠促促进进反反应应，其其中中硫硫酸酸铜铜为为催催化化剂剂，硫硫酸酸钾钾或或硫硫酸酸钠钠可提高沸点。可提高沸点。过氧化氢过氧化氢也能加速反应。也能加速反应。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验B B、铵铵离离子子的的生生成成 消消化化完完了了以以后后，在在凯凯氏氏定定氮氮瓶瓶中中加加入入强强碱碱（氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液）消消化化液液，使使硫硫酸酸铵铵分分解解，放放出出氨。
35、氨。用用水水蒸蒸汽汽蒸蒸馏馏法法，将将氨氨蒸蒸入入过过量量的的硼硼酸酸溶溶液液中中，氨氨与与溶溶液液中中的的氢氢离离子子结结合合，生生成成铵铵离离子子，使使溶溶液液中中氢氢离离子子浓度降低。浓度降低。C C、测测定定 用用强强酸酸滴滴定定，直直至至恢恢复复溶溶液液中中原原来来的的氢氢离离子子浓浓度为止。度为止。所用强酸的摩尔数即相当于被测样品中氨的摩尔数所用强酸的摩尔数即相当于被测样品中氨的摩尔数。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（2 2）紫紫外外吸吸收收法法 280nm280nm光光吸吸收收法法 由由于于蛋蛋白白质质中中酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸残残基
36、基的的苯苯环环含含有有共共轭轭双双键键，因因此此蛋蛋白白质质在在275275280nm280nm波波长长处处有有一一个个紫紫外外吸吸收收高高峰峰，在在一一定定范范围围内内，蛋蛋白白质质溶溶液液在在280nm280nm波波长长处处的的光光吸吸收收度度值（值（A A280280）与其浓度成正比，因此可作定量测定）与其浓度成正比，因此可作定量测定。该法测定范围为该法测定范围为0.010.010.1mg/mL0.1mg/mL。该该法法简简单单、灵灵敏敏、快快速速、不不消消耗耗样样品品，低低浓浓度度的的盐盐类类不不干干扰扰测测定定，因因此此在在蛋蛋白白质质和和酶酶的的生生化化制制备备中中广广泛应用。泛应
37、用。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验280nm280nm和和260nm260nm光光吸吸收收差差法法 若若样样品品中中含含有有嘌嘌呤呤、嘧嘧啶啶等等核核酸酸类类吸吸收收紫紫外外光光的的物物质质，在在用用来来测测定定蛋蛋白白质质浓度时，会有较大的干扰。浓度时，会有较大的干扰。由由于于核核酸酸在在260nm260nm波波长长处处的的光光吸吸收收比比280nm280nm波波长长处处更更强强，因因此此可可利利用用280nm280nm和和260nm260nm的的吸吸收收差差来来计计算算蛋蛋白白质浓度。质浓度。常用下列经验公式估算：常用下列经验公式估算：蛋蛋白白质质浓
38、浓度度（mg/mLmg/mL）=1.45=1.45A A2802800.740.74A A260260（假假设设1mg/mL1mg/mL蛋白质溶液的蛋白质溶液的A A280280为为1.01.0）第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（3 3）考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250G-250染染色色法法 考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250G-250在在酸酸性性溶溶液液中中为为棕棕红红色色，当当它它与与蛋蛋白白质质通通过过疏疏水水作作用用结结合后变为合后变为蓝色蓝色，可在，可在595nm595nm波长处进行比色测定波长处进行比色测定。该该法法反反应应快快、操操作作简简便便、消
39、消耗耗样样品品少少，但但不不同同蛋蛋白白质之间差异较大，且质之间差异较大，且标准曲线线性较差标准曲线线性较差。测定范围为测定范围为0.010.011.0mg/mL1.0mg/mL蛋白质蛋白质。高高浓浓度度的的TrisTris、EDTAEDTA、尿尿素素、甘甘油油、蔗蔗糖糖、丙丙酮酮、硫硫酸酸铵铵、去去垢垢剂剂对对测测定定有有干干扰扰，缓缓冲冲液液浓浓度度过过高高或或改变测定液的改变测定液的pHpH也会影响显色。也会影响显色。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验A A、溶溶液液的的配配制制 标标准准蛋蛋白白质质溶溶液液 0.10.1或或1.0mg/mL1.0mg
40、/mL牛牛血清白蛋白。血清白蛋白。染染色色液液 称称取取100mg100mg考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250G-250溶溶解解于于50mL 50mL 9595乙乙醇醇中中，加加100mL 100mL 8585的的磷磷酸酸，加加水水稀稀释释到到1000mL1000mL。该该染染色色液液可可保保存存数数月月。若若不不加加水水可可长长期期保保存存，临临用用前前再稀释。再稀释。B B、标标准准曲曲线线 在在试试管管中中分分别别加加标标准准蛋蛋白白质质溶溶液液0 0、6 6、1212、2424、3636、4848、60L60L，用用水水补补足足至至60L60L，加加3mL3mL染染色色液液，混混匀匀后后在
41、在室室温温（20202525）保保温温15min15min，在在595nm595nm波波长长处处进进行行比比色色测测定定，以以标标准准蛋蛋白白质质浓浓度度为为横横坐坐标，以吸收度值为纵坐标作标准曲线。标，以吸收度值为纵坐标作标准曲线。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验C C、样样品品测测定定 取取60L60L样样品品溶溶液液同同上上测测定定，然然后后从从标标准准曲线上查得其浓度。曲线上查得其浓度。当当样样品品中中蛋蛋白白质质浓浓度度较较稀稀时时（0.010.010.1mg/mL0.1mg/mL），可可在在3ml3ml染染色色液液中中加加0.3mL0.3mL样
42、样品品溶溶液液，同同时时作作标标准准曲曲线线，测测595nm595nm波长处的光吸收度值。波长处的光吸收度值。0.05mg/mL0.05mg/mL牛血清白蛋白溶液的牛血清白蛋白溶液的A A595595约为约为0.290.29。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验2 2、蛋白质的效价测定、蛋白质的效价测定蛋白质的效价测定较多地采用蛋白质的效价测定较多地采用生物检定法生物检定法。（1 1）小小鼠鼠血血糖糖法法测测定定胰胰岛岛素素效效价价 在在给给小小鼠鼠注注射射胰胰岛岛素素后后，以以其其降降低低血血糖糖为为反反应应指指标标，用用适适宜宜的的方方法法如如葡葡萄萄糖糖
43、氧氧化化酶酶过过氧氧化化酶酶法法测测定定血血糖糖值值，能能直直接接反反映映其其降血糖的药理作用。降血糖的药理作用。此此法法用用动动物物少少并并为为微微量量反反应应，反反应应指指标标更更接接近近于于临临床床，设设备备简简单单、操操作作方方便便，克克服服了了小小鼠鼠惊惊厥厥法法判判断断指指标标易易受受主主观观因因素素影影响响、实实验验误误差差较较大大、专专属属性性差差且且需需特特定定的恒温设备等缺点。的恒温设备等缺点。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（2 2）HPLCHPLC法法分分析析蛋蛋白白质质和和多多肽肽 HPLCHPLC技技术术已已发发展展为为检检测测
44、蛋白质结构和纯度的重要分析工具。蛋白质结构和纯度的重要分析工具。SmithSmith用用RP-HPLCRP-HPLC法法测测定定了了胰胰岛岛素素效效价价，大大大大缩缩短短了了分分析析时时间间，样样品品用用量量少少，同同时时还还能能获获得得对对胰胰岛岛素素纯纯度度评评估必不可少的杂质种类及含量信息。估必不可少的杂质种类及含量信息。李李湛湛君君等等对对比比了了RP-HPLCRP-HPLC法法和和在在体体生生物物测测定定法法（小小鼠鼠血血糖糖法法），证证明明两两种种方方法法测测定定结结果果基基本本吻吻合合，差差异异无无显显著性意义著性意义。在在高高纯纯、单单峰峰胰胰岛岛素素产产品品的的质质量量控控制制中中，理理化化方方法法可可代代替替生生物物测测定定法法。BPBP和和USPUSP对对人人胰胰岛岛素素的的鉴鉴别别和和效效价价测测定定及及其其中中的的高高分分子子蛋蛋白白、脱脱氨氨胰胰岛岛素素和和相相关关蛋蛋白白的的限限量测定，均采用量测定，均采用HPLCHPLC法。法。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢