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1、 高效液相色谱法：高效液相色谱法：高效液相色谱法：高效液相色谱法：特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。验技术建立的一种液相色谱分析法。第三章第三章 高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法 HPLC （High Pertormance Liquid ChromatographyHigh Pertormance Liquid Chromatog
2、raphyHigh Pertormance Liquid ChromatographyHigh Pertormance Liquid Chromatography，）3-13-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点（1）高压高压：150-350105 Pa：液相色谱法以液体为流动相：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。（2）高速高速：通常小于：通常小于1h。（可达。（可达1-10mL/mi
3、n30mL/h。）。）（3）高效高效：大于：大于30000塔板塔板/米米普通填充柱效普通填充柱效1000塔板塔板/m.近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。（4）高灵敏高灵敏：10-9g（紫外检测）、（紫外检测）、10-11g（荧光检测）（荧光检测）HPLCHPLC与与GCGC差别差别 1分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性
4、的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%2 2 2 2流动相差别的区别流动相差别的区别流动相差别的区别流动相差别的区别GCGC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。力，只与固定相有相互作用。HPLCHPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变
5、流动相极性和变流动相极性和pHpH值也对分离起到调控作用，当值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。也可以增大分离选择性。3 3 3 3操作条件差别操作条件差别操作条件差别操作条件差别GCGC：加温操作：加温操作HPLCHPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素基础基础理论理论n n热力学理论：塔板理论n n动力学理论：速率理论一、塔板理论一、塔板理论1.1.二、速率理论（与二、速率理论（与GCGC对比）对比）2 2）涡流扩
6、散项及其影响）涡流扩散项及其影响2.2.讨论：讨论：讨论：讨论：1 1）流动相流速对）流动相流速对HPLCHPLC板高的影响（与板高的影响（与GCGC对比）对比）3 3）传质阻抗项及其影响）传质阻抗项及其影响 1 1三、三、影响分离的因素影响分离的因素1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，约1ml/min 3.柱温的选择：选室温250C左右四、四、HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择3-33-3 高效液相色谱法主要类型及分离原理高效液相色谱法主要类型及分离原理
7、根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：1 液 液分配色谱法流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶，有一个明显的分界面。溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：液-液分配色谱与气-液分配色谱异同：同：分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大。异：液相色谱中流动相的种类对分配系数的影响很大，气相色谱中流动相性质对分配系数影响不大。液液色谱法中，为避免固定液流失，对于亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性，这种情况称为正相液-液色谱法。若流动相极性大于固定相极性，则称为反相液液色谱法。其出峰顺序与正相液液色谱法相反。色谱
8、分离过程中，由于固定液在流动相中仍有微量溶解，以及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液不断流失而导致保留行为的变化，柱效和分离选择性变坏等不良后果，为更好的解决固定液从载体上流失的问题，将各种不同的有机基团通过化学反应共价键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相，从而产生了化学键合固定相。！反相化学键合相色谱法，在高效液相色谱法中应用广泛。2 液 固色谱法流动相为液体，固定相为吸附剂。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是溶质分子(X)和溶剂分子（S）对吸附剂活性表面的竞争吸附。若溶剂分子吸附性更强，则被吸附的溶质分子将相应地减少。吸附剂对分配系数大的组分吸附
9、力强，相应的保留值也大。适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：非线性等温吸附会引起峰拖尾现象。3 离子对色谱法离子对色谱法离子对色谱法是将一种离子对色谱法是将一种(或多种或多种)与溶质分子电与溶质分子电荷相反的离子荷相反的离子(称为对离子或反离子称为对离子或反离子)加到流动相或加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。合物，从而控制溶质离子的保留行为。流动相中待分离的有机离子流动相中待分离的有机离子X+（或带负电荷的离子）（或带负电荷的离子）与
10、固定相或流动相中带相反电荷的对离子与固定相或流动相中带相反电荷的对离子Y-结合，形结合，形成离子对化合物成离子对化合物X+Y-，然后在两相间进行分配。，然后在两相间进行分配。平衡常数 KXY溶质分配系数 DX离子对色谱法离子对色谱法（流动相和固定相）正相离子对反相离子对反相离子对极性流动相（含Y-）（甲醇-水，乙腈-水等）试样离子X+疏水性离子对X+Y-X+Y-在固定相表面分配吸附。容量因子k滞留因子：Rs=1/(1+k)=us/u,tR=L/us可用于生化试样（核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱及药物等分离。可在离子对生成时，引入紫外吸收或荧光基团，从而提高检测灵敏度。4.离子交换色谱法离子交换色
11、谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。5.离子色谱法用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。洗脱反应则为交换反应的逆过程.6 空间排阻色谱法空间排阻色谱法以凝胶(gel)为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的
12、不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。可用于在流动相中可溶的，分子质量差别在10%以上的分子。3-4 液相色谱固定相液相色谱固定相1.液-液色谱法、键合色谱法及离子对色谱法固定相2.所用的担体可分为如下几类：(1)全多孔型担体是颗粒均匀的多孔球体。100m(2)表层多孔型担体 又称薄壳型微珠担体。从开始
13、的直径为 30 40 m 的实心核(玻璃微珠)，表层上附有一层厚度约为 1 2m 多孔表面(多孔硅胶)。(3)目前多为5-10 m的全多孔微粒担体，(4)缺点：固定液机械涂附在担体上，固定液流失不可避免。(5)为克服此缺点，出现新型固定相化学键合固定相化学键合固定相(3)化学键合固定相 即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。根据在硅胶表面(具有 Si OH 基团)的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型(Si O C)；硅氧硅碳键型(SiOSiC)硅碳键型（SiC）和硅氮键型（SiN）四种类型。化学键合固定相具有如下一些特点：.表面没有坑，比一般液体固定相传质快得多；.无固
14、定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；.可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；.有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。化学键合相色谱应用反相键合相固定相1 1分离机制：疏溶剂理论分离机制：疏溶剂理论 正相正相流动相与溶质排斥力强，流动相与溶质排斥力强，作用时间作用时间 ，kk，组分组分t tR R 反相反相流动相与溶质排斥力弱，流动相与溶质排斥力弱，作用时间作用时间，kk，组分组分t tR R 2 2固定相：固定相：极性小的烷基键合相极性小的烷基键合相极性小的烷基键合相极性小的烷基键合相 C C8 8柱，柱，C C1818柱（柱（ODSODS柱
15、柱HPLCHPLC约约80%80%问题）问题）3 3流动相：流动相：极性大的甲醇极性大的甲醇极性大的甲醇极性大的甲醇-水或乙腈水或乙腈水或乙腈水或乙腈-水水水水 流动相极性流动相极性 固定相极性固定相极性 底剂底剂 +有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂）例：水例：水 +甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，THFTHF4 4流动相极性与流动相极性与k k的关系：的关系：流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，kk，组分组分t tR R 5 5出柱顺序：极性大的组分先出柱出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱6 6适用：非极性适用：非极性 中等极性组分（中等极性组分（
16、HPLC80%HPLC80%问题）问题）正相键合相色谱1 1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力诱导力、或氢键作用力2 2固定相：极性大的氰基或氨基键合相固定相：极性大的氰基或氨基键合相3 3流动相：极性小（同流动相：极性小（同LSCLSC）底剂底剂 +有机极性调节剂有机极性调节剂 例：正己烷例：正己烷 +氯仿氯仿-甲醇，氯仿甲醇，氯仿-乙醇乙醇4 4流动相极性与流动相极性与k k的关系：的关系：流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，组分组分t tR R，kk5 5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱顺序：结构相近组
17、分，极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱出柱极性大的组分后出柱6 6适用：适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等分析极性大物质、糖类等2 液固吸附色谱法固定相采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。分为全多孔型和薄壳型。目前多为5-10m全多孔型硅胶微粒3 离子交换色谱法固定相（1）薄膜型离子交换树脂即以薄壳玻珠为担体，在它的表面涂约 1%的离子交换树脂而成。（2）离子交换键合固定相用化学反应将离子交换基团键合在惰性担
18、体表面。4 排阻色谱法固定相（1）软质凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水为流动相。（2）半硬质凝胶如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联聚苯乙烯凝胶）是应用最多的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂。（3）硬质凝胶如多孔硅胶、多孔玻珠等，多孔硅胶是用得较多的无机凝胶。3-5 液相色谱法流动相液相色谱法流动相 选择流动相时应注意下列几个因素。选择流动相时应注意下列几个因素。(1)(1)流动相纯度流动相纯度 （使用色谱纯试剂）（使用色谱纯试剂）(2)(2)应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂溶剂 (3)(3)对试样要有适宜的溶解度对试样要有适宜的溶解度
19、(4)(4)溶剂的粘度小些为好溶剂的粘度小些为好 (5)(5)应与检测器相匹配应与检测器相匹配 1 1贮液罐（滤棒，可滤贮液罐（滤棒，可滤贮液罐（滤棒，可滤贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质）去颗粒状物质）去颗粒状物质）去颗粒状物质）2 2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）3 3进样装置进样装置进样装置进样装置4 4色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分离分离分离分离5 5检测器检测器检测器检测器分析分析分析分析6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置记录装置记录装置3-6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效
20、液相色谱仪典型结构示意图1 1高压泵：要求流量稳定、平稳、无脉动。高压泵：要求流量稳定、平稳、无脉动。直接影响柱效，峰面积重现性和定量分析的精密度。直接影响柱效，峰面积重现性和定量分析的精密度。恒压泵：流量精度不稳恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用恒流泵：常用（）往复式柱塞泵 当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。（2）气动放大泵 其工
21、作原理是：压力为 p1 的低压气体推动大面积（SA）活塞 A，则在小面积（SB）活塞 B 输出压力增大至 p2 的液体。压力增大的倍数取决于 A 和 B 两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为 50:1，则压力为 5 105Pa的气体就可得到压力为 250 105Pa的输出液体。这是一种恒压泵。2 梯度洗提梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素(容量因子和选择性因子），以提高分离效果。梯度洗提可以分为低压梯度（也叫外梯度）：在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入
22、色谱柱。高压梯度(或称内梯度系统)：将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，混合后送入色谱柱。3 3进样装置进样装置 1 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）进样室）GCGC系统压力较小，可以系统压力较小，可以 HPLCHPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）系统压力太大，必须停泵进样（早期）2 2）阀进样：不必停泵，六通阀）阀进样：不必停泵，六通阀六通阀示意图六通阀示意图4 4色谱柱：色谱柱：常常用用的的标标准准柱柱型型是是内内径径为为 4.6 4.6 或或 3.9mm 3.9mm，长长度度为为 15 15 30cm 30cm 的的直直形形不不锈锈钢钢柱
23、柱。填填料料颗颗粒粒度度 5 5 1010 m m，柱柱效以理论塔板数计大约效以理论塔板数计大约 7000 7000 10000 10000。柱效评价：色谱系统适应性试验柱效评价：色谱系统适应性试验 R R，n n，f fs s（拖尾因子）拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗柱再生：维护、保养、柱子的冲洗5 5检测器检测器 1 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质，它的作用原理）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质，它的作用原理是基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，是基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定
24、律。2 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质，荧光检测器）荧光检测器：只能分析自身发光的物质，荧光检测器是一种很灵敏和选择性好的检测器。荧光检测器的结构及是一种很灵敏和选择性好的检测器。荧光检测器的结构及工作原理和荧光光度计相似。工作原理和荧光光度计相似。灵敏度高。灵敏度高。3 3）示差折光检测器：借连续测定流通池中溶液折射率的方）示差折光检测器：借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。溶液的折射率是纯溶剂（流法来测定试样浓度的检测器。溶液的折射率是纯溶剂（流动相）和纯溶质（试样）折射率乘以各物质的浓度之和。动相）和纯溶质（试样）折射率乘以各物质的浓度之和。因此溶有试样的流
25、动相和纯流动相之间折射率之差表示试因此溶有试样的流动相和纯流动相之间折射率之差表示试样在流动相中的浓度。灵敏度低，温度要求严格样在流动相中的浓度。灵敏度低，温度要求严格 4 4）电导检测器：其作用原理是根据物质在某些介质中电离）电导检测器：其作用原理是根据物质在某些介质中电离后所产生电导变化来测定电离物质含量。后所产生电导变化来测定电离物质含量。液相色谱仪操作视频资料液相色谱仪操作视频资料3-7 高效液相色谱分离类型选择高效液相色谱分离类型选择如何应用高效液相色谱对试样分离、分析：因综合考虑各种因素：1.试样的性质（相对分子质量、化学结构、极性、溶解度等化学和物理性质）。2.液相色谱分离类型的
26、特点及应用范围。3.实验室条件（仪器、色谱柱等）4.液相色谱分离类型选择参考表3-8 高效液相色谱应用实例高效液相色谱应用实例简单分析教材中提到的实例，解释原因。制备色谱：是以色谱技术来分离、制备大量纯组分的方法。液相制备色谱优点：分离条件较温和、分离检测中通常不导致试样破坏，试样易于回收。3-9 液相制备色谱液相制备色谱1.色谱柱柱容量（柱负载）：分析型色谱柱柱容量：指在不影响柱效能情况下最大进样量。通常进样量小于1mg/g吸附剂，保留值k和柱效H不随进样量改变而变化。超过此进样量，色谱柱超载，柱效大幅度降低，峰形变宽，分离度变差，保留值也发生变化。进样量越大柱效越低，分离度越差，是制备色谱
27、主要限制之一。制备色谱柱柱容量：指在不影响收集物纯度前提下最大进样量。制备柱允许过载，但柱效降低不宜过半或容量因子中减少超过10%。2.液相制备色谱方法A、欲分离组分呈现一个单峰n在分析型HPLC上进行试验，n利用色谱分离基本方程，通过k、，n值的优化提高分离度。n增加进样量直到色谱峰发生重叠，在柱负荷极限内，扩大柱径，以提高允许最大试样量，并扩大输液泵流量，分离出纯组分。n若要获得更大量的纯物质，可使柱超载运行，此时产生峰重叠，按中心切割法收集少量馏分，以分析型HPLC或薄层色谱检验纯度。B、要求分离的物质是微量或痕量组分n在色谱柱负荷极限时的痕量组分，用前述方法在达到最佳分离度后，利用柱超载进行富集n在所期望的洗脱区收集要求分离的组分，将含有这种痕量组分浓度较高的馏分合并，n使用相近于A情况对这一富集的试样进行纯化制备。3 3、液相制备色谱仪、液相制备色谱仪输液泵流量20-100mL/min制备色谱柱内径20-50mm长 50cm自动馏分收集器可将试样组分按顺序以固定体积收集在玻璃管内。典型液相制备色谱仪构造及流路3-10 毛细管电泳毛细管电泳自学作业作业(04)：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10