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1、生物：生物：5.35.3血血红蛋白的提取和蛋白的提取和分离分离课件件(新人教版新人教版选修修1)1)一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）具多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：、原理
2、：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（），移动速），移动速度（度（），而（），而（）的蛋）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（）移动，路程（），移动速度（），移动速度（），），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快4、具体过程、具体过程凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理
3、 1、概念：在一定的范围内，能对抗外、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）的对溶液）的对溶液的（的（）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（就
4、可以制得（）使用的）使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内人体血液中缓冲液人体血液中缓冲液:NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3电泳：电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。生迁移的过程。2、原理：许多重要的生物大分子，如（、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有）等都具有()在在()下下，这些基团会带上（，这些基团会带上（）。在。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子
5、本身（）以及分子本身（）、（）、（）的）的不同使带电分子产生不不同使带电分子产生不同的（同的（），从而实现样品中各），从而实现样品中各种分子的分离。种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH分类：分类：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和和聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定（测定（）通）通常用十二烷基硫酸钠（常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀聚丙稀酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶
6、为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用的作用下会解聚成单条肽链，下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合复合物，物，SDS所所带带负电荷负电荷的量大大超过了蛋白质分的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取
7、决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸带负电荷核酸带负电荷，在电场中向正极移动。，在电场中向正极移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下
8、，发出橙红色荧光。根据荧光的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以对其鉴条带的粗细和分布的位置，可以对其鉴定。定。说明：说明：电泳检测结果电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳（四）血红蛋白（四）血红蛋白在红细胞的组成中，在红细胞的组成中，约约90%是血红蛋白。是血红蛋白。它由它由四个肽链四个肽链组成，组成，包括两个包括两个肽链和和两个两个肽链。每条。每条肽链环绕一个一个亚铁血血红素素基基团，可携，可携带一分子氧或一分一分子氧或一分子二氧化碳子二氧化碳。血。血红蛋白因含蛋白因含血血红素而素而呈呈现红色。色。二、实验操作二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的
9、提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。鉴定。二二 实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋
10、白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链90（一）样品处理（一）样品处理1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯作用下，
11、红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。斗分出红色透明液体。4、透析：、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透）透析。析。红细胞的洗涤红细胞的洗涤分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对
12、蛋白、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小
13、的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物
14、生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数分子数和和CO2分子数分别是分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序分层顺序自上而下自上而下是：是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀；http:/m.jiezhong.org/info-8874/http:/m.jiezhong.org/info-8874/龙王传说龙王传说 hxh03kyd hxh03kyd 也算了，
15、如何反帮她？帮她，为何还要偷偷的？可太便宜她了！也算了，如何反帮她？帮她，为何还要偷偷的？可太便宜她了！”明秀笑道：明秀笑道：“虽然不害她，实在却是在帮你。虽然不害她，实在却是在帮你。”福珞讶声道：福珞讶声道：“如何是帮了我如何是帮了我？”明秀颇有些恨铁不成钢的样子，问道：明秀颇有些恨铁不成钢的样子，问道：“你说她买这些花，是做什么呢？你说她买这些花，是做什么呢？”“”“席上添香啊！席上添香啊！”福珞道，福珞道，“一团团茉莉添香，多么雅致，从没一团团茉莉添香，多么雅致，从没见人摆过，难得她怎么想得出来。见人摆过，难得她怎么想得出来。”明秀眼神并不认同，福珞声音越说越低，转念一想，忽想通了：明秀
16、眼神并不认同，福珞声音越说越低，转念一想，忽想通了：“哎呀！吃这顿饭，又是大鱼、又是大肉的，哎呀！吃这顿饭，又是大鱼、又是大肉的，各种大菜香味，跟清雅花香一冲混，南辕北辙，怎生尴尬？原来不是前人放着这好主意不想，却是本不该用的！吃大菜，席上本不能近着人用茉各种大菜香味，跟清雅花香一冲混，南辕北辙，怎生尴尬？原来不是前人放着这好主意不想，却是本不该用的！吃大菜，席上本不能近着人用茉莉、丁香、龙涎之属。莉、丁香、龙涎之属。”“”“你总算知道！你总算知道！”明秀点头道，明秀点头道，“我等虽不害人，她要自往绝路上走，也犯不着拦着。珞儿，我等虽不害人，她要自往绝路上走，也犯不着拦着。珞儿，”暖融融拉她手
17、道，暖融融拉她手道，“你你心地太宽诚，我总怕你会吃亏呢！心地太宽诚，我总怕你会吃亏呢！”福珞一团感动：福珞一团感动：“表姊说得是！表姊说得是！”一发听信明秀。宝音屋里，传出的命令渐渐多起来，一下子问酱油、一下一发听信明秀。宝音屋里，传出的命令渐渐多起来，一下子问酱油、一下子问水果、一会儿订蒸笼、一忽儿又叫拿一摞椅褥子来。乐韵报说，宝音只在簿子上乱涂，翻来翻去，咬着笔头给命令。明秀便哂笑：这算什么子问水果、一会儿订蒸笼、一忽儿又叫拿一摞椅褥子来。乐韵报说，宝音只在簿子上乱涂，翻来翻去，咬着笔头给命令。明秀便哂笑：这算什么呢？急昏头了么！一个劲儿捣鼓这些有的没有的，却不去抢做大菜的好师傅、不挑块锦
18、上添花的好桌布！不由得不把宝音看得很轻。老太太寿宴呢？急昏头了么！一个劲儿捣鼓这些有的没有的，却不去抢做大菜的好师傅、不挑块锦上添花的好桌布！不由得不把宝音看得很轻。老太太寿宴那天，老太爷苏小横要来，太守家的几位夫人也要来，明秀自己也要费尽心思琢磨自己那天的打扮举止，也就不把很多精力放在宝音那边了。老那天，老太爷苏小横要来，太守家的几位夫人也要来，明秀自己也要费尽心思琢磨自己那天的打扮举止，也就不把很多精力放在宝音那边了。老太太寿辰是十二月十三，不是正十大寿，老太太吩咐了，不准大作，十三号一早才准拜寿，最多唱一天的戏，多了，她不依！十二号早晨，鸡才太太寿辰是十二月十三，不是正十大寿，老太太吩咐
19、了，不准大作，十三号一早才准拜寿，最多唱一天的戏，多了，她不依！十二号早晨，鸡才叫，宝音已经起来了，太阳未升，已经传下好几条命令去，拘了好几个家人媳妇在岗，自个儿浅描眉、淡梳妆，毫无奢糜之嫌，却额边特拈了丹叫，宝音已经起来了，太阳未升，已经传下好几条命令去，拘了好几个家人媳妇在岗，自个儿浅描眉、淡梳妆，毫无奢糜之嫌，却额边特拈了丹鹤鸣松的花钿，露出喜庆意思，看曙色不迟不早透了红，叫洛月捧好小盆，往老太太这边来。老太太原未起，正在床沿挨磨，嘉颜挡宝音道：鹤鸣松的花钿，露出喜庆意思，看曙色不迟不早透了红，叫洛月捧好小盆，往老太太这边来。老太太原未起，正在床沿挨磨，嘉颜挡宝音道：“姑娘请宽坐，老太太
20、即刻便起来。姑娘请宽坐，老太太即刻便起来。”“”“烦嘉颜姐姐回老太太一声，烦嘉颜姐姐回老太太一声，”宝音恭敬道，宝音恭敬道，“笙儿捧来这东西，就是伺候老太太盥洗的。笙儿捧来这东西，就是伺候老太太盥洗的。”老太太听得，老太太听得，果然好奇，便叫进来。洛月弯腰奉棉草暖好的小木盆在老太太床边，宝音亲自掀起盖子，原来是一盆暖水，水色清澄，不见加了什么，却有一股果然好奇，便叫进来。洛月弯腰奉棉草暖好的小木盆在老太太床边，宝音亲自掀起盖子，原来是一盆暖水，水色清澄，不见加了什么，却有一股透鼻的馨香出来，仿佛是四月天春月融动。老太太惊喜道：透鼻的馨香出来，仿佛是四月天春月融动。老太太惊喜道：“茉莉？茉莉？”
21、宝音笑着点头，要卷袖子，嘉颜忙替她挽起来。宝音便亲自伺候老太太沃宝音笑着点头，要卷袖子，嘉颜忙替她挽起来。宝音便亲自伺候老太太沃面。老太太畏寒、又怕烫，这一盆水暖得正正好，含笑看一眼宝音的打扮，沃了面，呼出一口气：面。老太太畏寒、又怕烫，这一盆水暖得正正好，含笑看一眼宝音的打扮，沃了面，呼出一口气：“这必是茉莉香精，否则无以这样清浓。这必是茉莉香精，否则无以这样清浓。”“”“老太太真懂行！老太太真懂行！”宝音赞道，宝音赞道，“果然是茉莉蒸出来的香精油。那样一大桶，只蒸出来两滴，正好滴在这水里。果然是茉莉蒸出来的香精油。那样一大桶，只蒸出来两滴，正好滴在这水里。”“”“奢享太奢享太此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢