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1、生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武生物竞赛-生物化学-44重组DNA技术-杨荣武生物化学原理(第二版)(三)生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武提纲提纲1重组DNA技术简介2基因克隆的详细步骤3基因克隆的应用4聚合酶链式反应5蛋白质工程6研究核酸与蛋白质相互作用的主要方法7研究蛋白质之间相互作用的主要方法8SELEX技术9生物芯片技术10基因组学研究概述生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武重组重组DNA重组DNA也称为基因克隆或分子克隆，是通过某种手段将不同来源的DNA片段连接起来形成嵌合体分子，并进行扩增和纯化以供进一步研究的技术。有效的基因克隆至少满足
2、五个条件：（1）具有容纳外源基因或序列的载体；（2）具有将外源基因或序列导入载体的工具；（3）具有合适的宿主细胞；（4）具有将重组DNA引入到宿主细胞的途径；（5）具有选择和筛选重组体的方法。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武重组重组DNA技术的基本步骤技术的基本步骤 生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因克隆的载体基因克隆的载体载体的作用是容纳被克隆的目标基因，以便将它们带入到特定的宿主细胞中进行扩增或表达。一种理想的载体至少包括：大多数载体含有原核细胞DNA复制起始区，以便于在原核系统中的扩增；某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便在真核细胞内的自主复制
3、；含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆位点，以方便各种克隆片段的插入和建立DNA文库；带有抗生素抗性基因或其它选择性标记，有利于克隆的筛选和鉴别；某些载体含有可诱导的或组织特异性的启动子或增强子序列，有利于控制被插入的基因在转染细胞或转基因动物内的表达；现代的载体一般含有多功能的结构元件，同时兼顾到克隆、DNA测序、体外突变、转录和自主复制。目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武pUC18/19质粒的基本结构质粒的基本结构生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武噬菌体载体的构建、重组和包装噬菌体载体的构建、重组和包装生物竞赛生
4、物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武细菌人工染色体的结构和外源细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入的插入生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武酵母人工染色体的结构和外源酵母人工染色体的结构和外源DNA的插入的插入生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武将外源基因或序列导入载体的工具将外源基因或序列导入载体的工具将外源基因或序列导入到载体需要特殊的工具酶，其中以限制性内切酶（RE）和连接酶最为重要，此外，有时还需要DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶和S1核酸酶等。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶实际上是一类特殊的具有高度位点特异
5、性的DNA内切酶，它们识别双链DNA分子内部特殊的碱基序列（通常为46 bp的回文序列），切开DNA的两条链，产生特定的末端。已发现三类限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切割性质上有如下差别：1.类：由3种不同的亚基组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别位点周围400700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；2.类：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；3.类与类
6、相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp30bp范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA技术中提到的限制性内切酶都属于此类。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武II类限制性内切酶的三种切割方式类限制性内切酶的三种切割方式生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武粘端之间的退火粘端之间的退火生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武宿主细胞宿主细胞宿主细胞是接受、扩增和表达重组DNA的场所。理论上，任何活细胞都可以作为宿主细胞，但最为常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母、草地贪夜蛾的培养细胞和哺乳动物的培养细胞等。大肠杆菌是最常用的原
7、核宿主菌，原因是对它比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造过的昆虫杆状病毒载体。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武将重组将重组DNA引入到宿主细胞的途径引入到宿主细胞的途径1.转化2.转染3.电穿孔4.脂质体介导5.弹道基因转移生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武重组体的选择和筛选重组体的选择和筛选 直接筛选根据抗生素敏感性和抗性变化进行筛选 根据营养需要进行筛选根据噬菌斑类型进行筛选蓝白斑选择 间接筛选核酸杂交法PCR法免疫化学受体/配体的结合性质Southwestern/Northw
8、esternDNA限制性内切酶图谱分析DNA序列分析生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武蓝白筛选法图解蓝白筛选法图解生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因克隆的详细步骤基因克隆的详细步骤1.获得外源DNA序列和目的基因；2.将目的基因与载体相连；3.将重组体导入特定的宿主细胞；4.目的基因序列克隆的筛选与鉴定。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武获取目的基因的手段获取目的基因的手段1.人工合成2.使用酶切将目的基因直接从另一种克隆载体中释放出来3.反转录4.PCR生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接将外源
9、序列或目的基因插入载体，主要是靠DNA连接酶和其它工具酶的配合使用。根据末端的性质，它们的连接方式主要有三种：（1）载体和目的基因具有相同的粘性末端；（2）载体和目的基因均为平端；（3）载体和目的基因各有一个粘性末端和一个平端。选择哪一种连接方式主要取决于载体的性质（特别是MCS的性质）和目的基因的来源。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因克隆的应用基因克隆的应用1.文库建立2.序列分析3.表达外源蛋白4.制备转基因动物和植物5.基因治疗6.基因敲除7.基因敲减8.寻找未知基因。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武文库的建立文库的建立基因克隆中的文库是指克隆到某种载
10、体上能够代表所有可能序列并且可以稳定维持和使用的DNA片段的集合。根据序列的来源，文库可分为基因组文库和cDNA文库。建立文库的主要目的在于使用合适的方法，从文库中鉴定出特定的目的序列，并进行扩增分离，此过程被称为文库筛选；也可以在鸟枪序列分析中，随机选择一个克隆对其进行鉴定。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因组文库和基因组文库和cDNA文库的比较文库的比较文库类型文库类型基因组文库基因组文库cDNA文库文库来源基因组DNAmRNA变化物种物种，组织，不同的发育阶段插入大小12kb20kb0.2kb6kb代表性均等与表达水平有关类型只有一种两种（表达型和非表达型）探针DNAD
11、NA、蛋白质或抗体用途基因结构，推断蛋白质性质表达的蛋白质，推断蛋白质性质生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因组文库的构建基因组文库的构建生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武cDNA文库的构建文库的构建生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武DNA序列分析的基本流程序列分析的基本流程生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武克隆基因在宿主细胞中的表达克隆基因在宿主细胞中的表达要使克隆基因在宿主细胞中表达，首先需要将目的基因亚克隆到带有基因表达所必需的各种元件的载体之中，这些载体通称为表达载体。目的基因可以放在不同的宿主细胞中表达。针对不同的表达系统，需
12、要构建不同的表达载体。表达载体可分为融合载体和非融合载体两类，前者在插入位点上“预装”了另外一个蛋白质或多肽的基因，因此，插入的外源基因将会与它发生融合，表达出来的是一种融合蛋白。使用融合载体的主要好处是方便了目的蛋白的纯化。理想的表达系统应该满足以下条件：（1）表达载体具有合适的MCS，以便使外源基因能够插入到正确的表达位置，或者至少是含有3个以上阅读框架的系列；（2）能够形成正确的翻译后修饰和三维结构，以形成有活性的或有功能的分子；（3）为可诱导的表达系统，允许细胞生长和诱导表达，防止毒性蛋白质的积累；（4）易于分离和纯化；（5）最好能分泌到胞外。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学
13、杨荣武胰岛素在大肠杆菌体内的表达胰岛素在大肠杆菌体内的表达生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武凝血因子凝血因子VIII高表达载体的构建和及其原理高表达载体的构建和及其原理生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武转基因动物和植物转基因动物和植物克隆的基因不仅可以导入细菌或培养的细胞，而且能转入动植物体内，整合到基因组内，使其所有的细胞都带有特定的外源基因，从而根本上改变其遗传特性。转基因动物或转基因植物就是指在其基因组内稳定地整合有外源基因、并能遗传给后代的动物或植物。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武培育转基因动物的基本步骤培育转基因动物的基本步骤1.准备供体
14、动物，分离受精卵；2.准备注射用转基因DNA溶液；3.将转基因DNA显微注射到一个受精卵的雌性原核之中，进入的DNA通过非同源重组插入到基因组之中；4.将受精卵移植到代孕母鼠的子宫之中；5.对出生的小鼠进行筛选，挑出转基因小鼠。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因治疗基因治疗基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞，表达有功能的蛋白质，以纠正目的基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治病目的的一种治疗方法。根据治疗的细胞对象，基因治疗分为性细胞基因治疗和体细胞基因治疗两种类型。性细胞基因治疗，是在患者的性细胞中进行操作，用来彻底根除并使其后代从此再也
15、不会得这种遗传疾病。然而，由于目前的技术水平有限，难以解决关键的基因定点整合（或称基因打靶）问题，加之相关的伦理学问题，以及愿意接受治疗的志愿患者甚少，还不能进入临床试验。根据治疗途径，基因治疗可分为体内基因治疗和回体基因治疗。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因敲除基因敲除基因敲除是上个世纪80年代后半期随DNA同源重组原理发展起来的一门新技术，它是指在分子水平上，使用特定的手段，将一个结构已知但功能不详的基因去除，或用其它顺序相近的基因取代，使原基因功能丧失，然后从整体观察实验动物的表型变化，进而推断相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的思
16、路相似。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武使用同源重组进行基因敲除的基本步骤使用同源重组进行基因敲除的基本步骤生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因敲减（基因敲减（gene knockdown）基因敲减也称为基因抑制，是一项降低或者抑制一种生物的某个或者某些基因表达的技术，以区别传统的“基因敲除”。敲减的手段可以在DNA 水平上，通过对DNA 的修饰来抑制基因的转录，也可以使用人工设计的核酶（主要是锤头核酶），定向切割特定的目标基因转录出来的mRNA，或者在翻译水平上，通过RNAi 技术或者依赖于核糖核酸酶H 的反义核酸技术，来抑制特定mRNA 的翻译。如果是在DN
17、A 水平上进行基因敲减，就可以将其与转基因技术结合起来，得到转基因敲减生物。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武未知基因的寻找未知基因的寻找1.从基因的终产物开始鉴定新基因2.从核酸水平上寻找新基因3.根据同源序列搜索和寻找4.基因标签法5.消减杂交技术。6.差异显示PCR技术7.RNA随机引物聚合酶链式反应 8.外显子捕获。9.与CG岛有关的技术10.噬菌体展示11.酵母双杂交系统生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）PCR是由Kary Mullis于1984年发明的一种简单、快速、灵敏地在体外选择和特异性扩增特定DNA序列或片段
18、的方法。PCR的原理并不复杂：理论上，DNA分子数目经复制呈指数增长，如果提供足够的引物和dNTPs，1分子DNA复制n次后，可产生2n个DNA分子。但与体内DNA复制不一样的是：PCR的解链反应使用的是热变性，而不是解链酶；PCR使用的引物是人工合成寡聚DNA，而不是像体内由引发酶合成的RNA；为了增加DNA聚合酶的稳定性，PCR使用的是耐热的DNA聚合酶。整个PCR反应由多个循环组成（3040次），每循环一次，DNA复制一次。每一个循环由三步反应组成：（1）DNA变性采取热变性，使模板DNA在95左右的高温下解链；（2）退火降低温度（通常在50 65），以使引物与模板DNA配对；（3）延伸
19、反应在DNA聚合酶催化下的，在引物的3端合成DNA，温度通常在72左右。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武聚合酶链式反应的基本过程聚合酶链式反应的基本过程生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析产物琼脂糖凝胶电泳分析生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武蛋白质工程蛋白质工程蛋白质工程就是使用遗传和化学手段，从改变或合成基因入手，改变一种蛋白质的结构与功能，从而产生具有特殊的、符合人们意愿性质的新产物的一项技术。蛋白质工程的目的：（1）改变催化性质。（2）改变结构性质；（3）创造新系统。改造蛋白质的主要手段是体外突变。突变有随机突变和定
20、点突变。无论是何种突变，最后都面临一个筛选的问题。现在有两种非常有用的筛选方法，一个是噬菌体展示，另一个就是核糖体展示生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武寡核苷酸引导的定点突变寡核苷酸引导的定点突变生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因混排基因混排也叫基因改组，实际上是一种体外同源重组技术。具体操作是将来源不同但功能相同的一组同源基因（来源于不同物种的同源基因或含有不同突变的基因），用DNA 酶I 消化成随机片段，由这些随机片段组成一个文库，使之互为引物和模板进行PCR 扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板互换，重组从而发生，导入体内后，选择正突
21、变体作为新一轮的体外重组。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因混排基因混排生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武PCR突变的基本流程突变的基本流程生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武核糖体展示核糖体展示 生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武研究核酸与蛋白质相互作用的主要方法研究核酸与蛋白质相互作用的主要方法1.电泳泳动变化分析2.DNA亲和层析3.DNA酶I-足印分析4.染色质免疫沉淀技术（ChIP）。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武染色质免疫沉淀流程示意图染色质免疫沉淀流程示意图生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武
22、研究蛋白质之间相互作用的主要方法研究蛋白质之间相互作用的主要方法1.免疫共沉淀、2.亲和层析、共价交联3.荧光共振能量转移（FRET）、4.生物发光共振能量转移（BRET）5.酵母双杂交6.蛋白质芯片 生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武酵母双杂交系统酵母双杂交系统是一项专门用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的技术，它首先由Fields S和Song OK于1989年提出。这项新技术在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与特定靶蛋白呈特异性作用的候选蛋白的研究中已经得到了广泛的应用。其可行性和有效性已被证实，并被推广到了诸如信号传导、细胞周期调控、肿瘤基因表达等多个研究领域，受到越来越多
23、的重视。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武酵母双杂交系统的原理酵母双杂交系统的原理酵母双杂交系统技术使用蛋白质的两种具有特别功能的结构域：一种是与DNA结合的结合结构域（简称BD），另一种是激活DNA转录的激活结构域（简称AD）。研究表明，这两种结构域并不需要一定在同一个蛋白质上才起作用。事实上，一个含有BD的蛋白质在与另一个含有AD的蛋白质结合以后就可以激活转录，该原理构成了酵母双杂交技术的基础。在双杂交系统中，两种融合蛋白被表达：一种是目标蛋白X，它有时被形象地称为诱饵蛋白。X在它的N-端与BD融合在一起；另一种是潜在的能够与X结合的目标蛋白Y。Y与AD融合在一起。如果X与Y
24、相互作用，那么XY的结合就形成一种完整的活性转录激活物。如此形成的转录激活物能够驱动一个容易检测的报告基因的表达。于是，报告基因的表达量可以用来作为测定X与Y相互作用的尺度。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武酵母双杂交系统的原理图解酵母双杂交系统的原理图解生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统的建立1.选择载体2.将“诱饵”蛋白X的基因和目标蛋白Y的基因分别插入到BD载体和AD载体之中，以形成BD-X和AD-Y融合蛋白3.转染：使用特定的手段将重组后的BD-X载体和AD-Y载体转染到特定的营养缺陷型酵母宿主细胞；4.筛选：利用双营养缺陷
25、型的恢复筛选出同时含有BD载体和AD载体的细胞；5.活性检测。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基于基于Gal4的的BD和和AD构建的双杂交系统构建的双杂交系统(图中的图中的2 ori代表酵母的代表酵母的2m质粒复制起始区质粒复制起始区)生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因芯片基因芯片基因芯片也叫DNA芯片、DNA微阵列或寡核苷酸阵列，它采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固定在支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对生物样品进行快速、并行和高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且
26、在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。基因芯片以其无可比拟的信息量、高通量、快速和准确地分析基因的本领，在基因组功能研究、临床诊断及新药开发等方面显示出巨大的威力，已成为人类研究和维护生命的一大利器，因此，被誉为是基因功能研究领域最伟大的发明之一。一般说来应用基因芯片分5步进行：（1）生物学问题的提出和芯片设计与制备；（2）样品制备；（3）生物杂交反应；（4）结果探测；（5）数据处理和建模。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武基因芯片的应用基因芯片的应用1.基因表达分析2.基因型、基因突变和多态性分析3.基因诊断4.药物筛选。5.大规模DNA测序6.新基因发
27、现7.药物基因组图8.中药物种鉴定9.DNA计算机研究 生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武使用基因芯片进行基因表达分析的基本流程使用基因芯片进行基因表达分析的基本流程生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武使用基因芯片对正常细胞和癌细胞进行基因表达分析比较使用基因芯片对正常细胞和癌细胞进行基因表达分析比较生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武SELEX技术技术SELEX是指指数富集式配体系统进化，它是一项将寡核苷酸扩增和体外筛选结合在一起的技术，已被广泛用于分离能与靶蛋白或小分子高亲和力结合的RNA和DNA分子，筛选到的寡核苷酸序列被称为适体或智能配体。能与靶蛋白分子作用的适体可用硝酸纤维素滤膜捕获或以初始聚丙烯酰胺凝胶分离，而能与小分子结合的适体则可用亲和层析分离。该技术不仅可用于研制核酸药物，还可用于研制新的核酶。生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武SELEX技术筛选技术筛选ATP结合结合RNA流程流程生物竞赛生物化学原理（分子生物学）南京大学杨荣武此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢