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1、微生物学学检验实实验指导导 2200997一、微微生物学学检验实实验目的的要求1通过过实验验验证理论论知识，并并掌握比比较全面面的微生生物学基基本操作作技术。2在微微生物学学实验过过程中建建立无菌菌观念，掌掌握无菌菌操作技技术。3通过过实验进进一步掌掌握临床床常见病病原微生生物的生生物学性性状、分分离培养养和鉴定定的方法法、各种种临床标标本的微微生物学学检验程程序和方方法。4在实实验过程程中逐渐渐培养独独立思考考问题、分分析问题题和解决决问题的的能力。二、微生生物学实实验室规规则及实实验室意意外处理理方法1微生生物学实实验室规规则由于微生生物学实实验是以以病原微微生物为为研究对对象，在在实验过
2、过程中任任何疏忽忽大意都都有可能能引起实实验人员员的自身身感染或或实验室室和周围围环境的的污染。因此，实实验中应应严格遵遵守实验验规则，建建立无菌菌观念，严严格无菌菌操作，防防止实验验过程中中出现意意外情况况，并确确保实验验结果的的准确。（1）试试验前须须预习实实验内容容，了解解实验目目的、方方法和注注意事项项，做到到心中有数数，避免免发生错错误，提提高实验验效率。（2）进进入实验验室必须须穿工作作服，必必要时还还须戴口口罩、帽帽子和手手套，并并做好实实验前的的各项准准备工作作。（3）非非必需物物品禁止止带入实实验室，带带入实验验室的物物品应远远离操作作区，放放在指定定的区域域。（4）实实验室
3、内内不准大大声喧哗哗、嬉戏戏，应保保持实验验室的安安静、整整洁和有有序。不不准在实实验室内内吸烟、饮饮水和进进食，尽尽量避免免用手触触摸头、面面部，防防止感染染，尽量量减少室室内活动动，以免免引起风风动。（5）实实验中注注意节约约试剂，爱爱护仪器器，避免免有菌材材料的污污染，如如有传染染性材料料污染桌桌面、地地面、手手、衣服服或发生生其他意意外情况况，应立立即报告告老师及及时作适适当处理理。（6）用用过的污污染物品品应放到到指定的的地点，经经专人消消毒灭菌菌之后再再进行清清洗，切切勿乱丢丢或冲入入水池中中。禁止止将本实实验室的的物品带带出实验验室外。需需送温箱箱培养的的物品，应应标记清清楚后送
4、送到指定定地点。（7）实实验完毕毕后应将将桌面整整理清洁洁，试剂剂、仪器器放回原原处，并并用浸有有消毒液液的抹布布将操作作台擦拭拭干净，打打扫卫生生，关好好水、电电、门窗窗。（8）离离室前脱脱下工作作服，反反折放在在指定的的地方；双手在在2来来苏液中中浸泡55minn左右，再再用肥皂皂、清水水洗净，方方可离开开实验室室。2实验验室意外外的紧急急处理方方法（1）发发生皮肤肤破损或或刺伤：首先用用肥皂和和水冲洗洗伤口，尽尽量挤出出损伤处处的血液液，并用用70%乙醇或或其他皮皮肤消毒毒剂进行行消毒，立立即进行行医疗处处理。（2）化化学药品品腐蚀伤伤：若为为强酸，用用大量清清水冲洗洗后再以以5%碳碳酸
5、氢钠钠溶液中中和；若若为强碱碱，用大大量清水水冲洗后后再以55%醋酸酸或5%硼酸溶溶液中和和；若受受伤处是是眼部，经经上述方方法处理理后，再再滴入橄橄榄油或或液体石石蜡12滴。（3）烧烧伤：局局部涂凡凡士林、55%鞣酸酸或2%苦味酸酸。（4）菌菌液误入入口中：立即将将菌液吐吐入消毒毒容器中中，再用用110000高锰锰酸钾或或3%过过氧化氢氢漱口，根根据菌种种服用适适当抗生生素预防防感染。（5）菌菌液污染染环境：将适量量233%来苏苏或0.1%新新洁尔灭灭浸泡污污染面半半小时后后除去，如如手上有有菌污染染，也可可浸泡于于上述消消毒液中中355minn，之后后用肥皂皂和清水水洗净。三、生物物安全防
6、防护知识识简介医学检验验工作人人员长期期接触有有潜在传传染性的的血液、粪粪便、体体液等标标本，这这些标本本往往是是各种细细菌、病病毒等病病原微生生物的传传播载体体，无论论是实验验人员感感染，还还是造成成实验室室和周围围环境的的污染，都都将导致致严重的的后果。因因此实验验室工作作人员在在实验过过程中必必须高度度重视实实验室生生物安全全防护，强强化生物物安全意意识，熟熟悉生物物安全防防护有关关知识，严严格无菌菌操作。1微生生物的分分类等级级根据世界界卫生组组织（WWHO）出出版的实实验室生生物安全全手册，将将微生物物分为四四个不同同危险度度等级：危险度度1级是是指不能能引起人人或动物物致病的的微生
7、物物，此类类微生物物无或仅仅具有极极低的个个体和群群体危险险；危险险度2级级的病原原体具有有中度个个体危险险，低度度群体危危险，能能引起人人或动物物致病，但但对实验验室工作作人员、社社区、家家畜或环环境不易易导致严严重危害害，所引引起的感感染具有有有效的的预防和和治疗措措施，并并且疾病病传播的的危险有有限；危危险度33级的病病原体具具有高度度个体危危险，低低度群体体危险，通通常能引引起人或或动物的的严重疾疾病，但但一般不不会发生生感染的的播散，并并且对感感染具有有有效的的预防和和治疗措措施；危危险度44级的病病原体具具有高度度的个体体危险和和群体危危险，通通常能引引起人或或生物的的严重疾疾病，
8、并并且很容容易发生生个体之之间的直直接或间间接传播播，对感感染一般般没有有有效的预预防和治治疗措施施。基于以上上划分标标准，结结合微生生物的致致病性、传传播方式式、目前前所具有有的预防防和治疗疗措施等等因素，我我国卫生生部于220066年制定定了人人间传染染的病原原微生物物名录，对对各种病病原微生生物的危危害程度度及其相相关实验验活动需需要达到到的生物物安全实实验室级级别做了了详细分分类，各各实验室室进行有有关实验验均需参参照此标标准。2生物物安全实实验室分分级与要要求由于各种种病原微微生物的的危险度度等级不不同，因因此实验验室必须须达到相相应的生生物防护护等级才才能开展展有关实实验。根根据W
9、HHO实实验室生生物安全全手册和和我国卫卫生部220022年颁布布的微微生物和和生物医医学实验验室生物物安全通通用准则则，实实验室从从生物安安全防护护的角度度共分为为四级：一级生生物安全全防护实实验室（BBSL-1）为为实验室室结构设设施、安安全操作作规程、安安全设备备适用于于危险度度1级的的微生物物，依据据标准操操作程序序可进行行开放性性操作，如用于于教学的的普通微微生物实实验室即即属此类类。二级级生物安安全防护护实验室室（BSSL-22）适用用于对人人或环境境具有中中等潜在在危害的的微生物物，即危危险度22级的病病原体，该该级别实实验室应应具备生生物安全全柜和密密封的离离心管，以以免发生生
10、泄漏和和产生气气溶胶。三三级生物物安全防防护实验验室（BBSL-3）适适用于有有明显危危害、可可以通过过空气传传播的病病原微生生物（如如结核杆杆菌、伯伯氏立克克次体等等），通通常已有有预防传传染的疫疫苗，该该级别实实验室除除了有严严格的一一级和二二级安全全设施要要求外，还还需具备备合适的的空气净净化系统统。四级级生物安安全防护护实验室室（BSSL-44）适用用于对人人体具有有高度的的危险性性，通过过气溶胶胶途径传传播或传传播途径径不明，目目前尚无无有效的的疫苗或或治疗方方法的致致病微生生物及其其毒素。BBSL-4实验验室必须须与其他他实验室室隔离，并并具备特特殊的空空气和废废物处理理系统，实实
11、验操作作须在级生物物安全柜柜内或全全身穿戴戴特制的的正压防防护服。根据以上上定义，医医院内的的临床实实验室因因接触可可能含有有致病微微生物的的标本，通通常应达达到二级级生物安安全防护护实验室室要求。根据实实验室生生物安全全认可准准则，二二级生物物安全实实验室结结构设施施需符合合以下几几点：（11）实验验室需具具有防止止节肢动动物和啮啮齿动物物进入的的设计，有有可开启启的窗户户，有纱纱窗，实实验室门门有可视视窗带锁锁并能自自动关闭闭。（22）每个个实验室室均应设设置洗手手池，宜宜设置在在靠近出出口处。（33）实验验室工作作区域外外有足够够的存储储空间及及摆放个个人衣物物的设施施。（44）实验验室
12、内墙墙壁、地地面应平平整、防防滑、易易于清洁洁，不适适宜用地地毯。（55）实验验台面应应能防水水、耐腐腐蚀、耐耐热。（66）实验验室内应应保证工工作照明明，避免免反光和和强光。（77）在实实验室内内应穿戴戴隔离衣衣、帽、手手套，必必要时戴戴防护眼眼镜。实实验室应应备有生生物安全全柜。（88）有适适当的消消毒设施施，如高高压蒸汽汽灭菌器器，并设设置洗眼眼装置、应应急喷淋淋装置、急急救药箱箱、灭火火器等。（99）有可可靠的电电力供应应和应急急照明。（110）在在实验室室出口处处设有在在黑暗中中可明确确辨认方方向、通通道的标标识。（111）在在实验室室入口处处和装有有传染性性物质的的设备表表面贴有有
13、生物危危险标志志。3实验验室生物物安全管管理制度度实验室生生物安全全制度建建设对于于临床实实验室而而言是生生物安全全防护的的核心，实实验室生生物安全全管理制制度应包包括：实实验室准准入制度度、生物物安全培培训制度度、生物物安全责责任制和和责任追追究制度度、生物物防护与与安全制制度、安安全检查查制度、个个人防护护制度、实实验室管管理制度度、清洁洁消毒制制度、安安全计划划审核制制度、废废弃物处处理制度度、事故故报告制制度、生生物安全全防护应应急预案案、标准准操作程程序等。建立健全全了各项项生物安安全制度度，还应应成立生生物安全全管理领领导小组组，加强强生物安安全制度度实施情情况的监监督管理理，实验
14、验室入口口处须粘粘贴生物物安全标标志，注注明危险险因素，生生物安全全级别，负负责人姓姓名和电电话，进进入实验验室的特特殊要求求及离开开程序，禁禁止非工工作人员员进入实实验室，如如需参观观实验室室等特殊殊行为需需经实验验室负责责人的批批准后方方可进入入。4实验验室常见见生物危危险实验室生生物污染染的途径径包括：空气传传播（临临床标本本中的污污染源在在空气中中传播、微微生物气气溶胶的的吸入）、直直接传播播（工作作中偶然然刺伤、割割伤，碎碎玻璃划划伤直接接感染）、皮皮肤粘膜膜接触（临临床标本本中的传传染源通通过破损损皮肤粘粘膜接触触造成的的感染）、其其他不明明原因的的实验室室相关感感染。实验室伤伤害
15、以及及与工作作有关的的感染主主要是由由于人为为失误不良实实验技术术以及仪仪器使用用不当造造成的。因因此，实实验室人人员必须须提高生生物安全全意识，认真学习生物安全相关的各种法规和文件，定期进行生物安全防护知识培训，熟悉生物防护有关知识，加强基本技能的培养，严格执行操作规程。实验室管理者应对实验室的风险级别进行分析，尤其对风险级别较高的、接触高危标本几率较大的区域如微生物和分子生物学室予以高度重视，保护实验室工作人员和环境的安全。5生物物废弃材材料的管管理实验室内内所有用用过的样样本、培培养物及及其他生生物性材材料等废废弃物，严严禁未经经处理就就随意丢丢弃，应应置于贴贴有生物物危害标标志的专专用
16、废弃弃物处理理容器内内，注意意容器的的充满量量不能超超过其设设计容量量，利器器（如针针头、小小刀、玻玻璃等）应应置于耐耐扎锐器器盒内，在在去污染染或最终终处置前前应存放放在指定定的安全全地方，经经过高压压灭菌或或其他无无害化处处理后再再安全运运出实验验室；有有害气体体、气溶溶胶、污污水、废废液等均均需经无无害化处处理后排排放；动动物尸体体、组织织的处置置和焚化化应符合合国家相相关要求求。处理理危险废废弃物的的人员需需经过专专业培训训，并使使用适当当的防护护设备。第一章 微生生物学检检验基本本技术实验一 细菌菌的形态态结构观观察及显显微镜油油镜的使使用【目的和和要求】1熟悉悉微生物物实验室室规则
17、并并自觉遵遵守。2掌握握细菌基基本形态态和特殊殊结构的的观察方方法。3掌握握光学显微微镜油镜镜的使用用和维护护方法，了了解荧光光显微镜镜和暗视视野显微微镜的构构造和使使用方法法。【试剂与与器材】1示教教片：各各种球菌菌、杆菌菌、弧菌菌、荚膜膜、鞭毛毛、芽胞胞的示教教片。2器材材及其他他：光学学显微镜镜、载玻玻片、擦擦镜纸、香香柏油、脱脱油剂等等。【实验内内容】一、细菌菌基本形形态和特特殊构造造的观察察1细菌菌的基本本形态（各各种球菌菌、杆菌菌、弧菌菌等）观察要点点：注意意细菌的的染色性性、相对对大小、形形状及排排列方式式。2特殊殊结构的的观察（荚膜、芽胞、鞭毛）观察要点点：注意意这些特特殊结构
18、构的大小小、形状状及其在在菌体中中的位置置，均有有助于细细菌的鉴鉴定。二、光学学显微镜镜油镜的的使用1光学学显微镜镜的构造造光学显微微镜是观观察细菌菌形态最最常用的的一种仪仪器，其其构造分分为机械械部分和和光学部部分，机机械部分分包括：镜座、镜镜臂、载载物台、镜镜筒、镜镜头转换换器、调调焦装置置等；光光学部分分包括：接物镜镜、接目目镜、反反光镜、聚聚光器、光光圈等（见见图1-1）。图1-11 光光学显微微镜的构构造显微镜的的接物镜镜有低倍倍镜、高高倍镜、油油镜三种种，放大大倍数依依次增高高，其识识别方法法为：（1）低低倍镜：镜头标标志为110或或10/0.225，镜镜头最短短，其上上常刻有有黄
19、色环环圈。（2）高高倍镜：镜头标标志为440或或40/0.665，镜镜头较长长，其上上常刻有有蓝色环环圈。（3）油油镜：镜镜头标志志为1000或或 1000/11.300，镜头头最长，其其上常刻刻有白色色环圈，或或“oiil”字字样。 2油镜镜的使用用原理图1-22 显显微镜油油镜的使使用原理理油镜的放放大倍数数高而透透镜很小小，自标标本片透透过的光光线，因因玻片和和空气的的折光率率不同（玻玻璃n=1.552，空空气n=1.00），部部分光线线经载玻玻片进入入空气后后发生折折射，不不能进入入接物镜镜，致使使射入光光线较少少，物象象不清晰晰。在油油镜和载载玻片之之间滴加加和玻璃璃折光率率相近的的
20、香柏油油（n=1.5515），则则使进入入油镜的的光线增增多，视视野光亮亮度增强强，物象象清晰（见见图1-2）。3使用用方法（1）采采光：使使用显微微镜时必必须端坐坐，将显显微镜放放在胸前前适当位位置。将将低倍镜镜转到中中央并对对准下面面的聚光光器，打打开光圈圈，转动动反光镜镜，使光光线集中中于聚光光器（以以灯光为为光源时时，使用用凹面反反光镜，以以自然光光为光源源时用平平面反光光镜）。根根据所观观察的标标本，通通过升降降聚光器器和缩放放光圈以以获得最最佳光度度。当用用低倍镜镜或高倍倍镜观察察时，应应适当缩缩小光圈圈，下降降聚光器器；当用用油镜观观察时，光光线宜强强，应把把光圈完完全打开开，并
21、将将聚光器器上升到到最高位位置。（2）低低倍镜调调焦：将将欲观察察的标本本置载物物台上，用用弹簧夹夹和推进进器固定定，将待待检部位位移至视视野正中中央，上上升载物物台至不不能升高高为止。用左眼眼观察接接目镜，缓缓慢调节节粗调节节器，使使载物台台下降，待待看到模模糊的图图像时，再再调节细细调节器器，直至至看到清清晰的图图像为止止。（3）油油镜的使使用：低低倍镜找找到物象象并调至至清晰之之后，转转开物镜镜头，在在玻片的的标本上上滴加11滴香柏柏油，将将油镜头头转换至至中央，缓缓慢调节节粗调节节器，使使镜头浸浸入油中中，当油油镜头几几乎接触触玻片时时停止转转动（从从侧面观观察），边边观察接接目镜边边
22、轻轻转转动粗调调节器（此此时只能能上升镜镜头，不不能下降降，防止止压坏玻玻片及损损坏物镜镜），待待看到模模糊物象象时改调调细调节节器，直直至找到到清晰物物象。镜检时应应将标本本按一定定方向呈呈“弓”形形移动，直直至整个个标本观观察完毕毕，以防防漏检。观观察时应应将两只只眼睛同同时睁开开，左眼眼观察，右右眼用于于绘图或或记录。标标本观察察完毕后后，先将将物镜头头移开，再再转动粗粗调节器器使载物物台下降降，取下下载玻片片，立即即用擦镜镜纸将镜镜头上的的香柏油油擦净。4注意意事项（1）显显微镜是是精密光光学仪器器，在搬搬放时应应右手紧紧握镜臂臂，左手手稳托镜镜座，平平端在胸胸前，轻轻拿轻放放。（2）
23、显显微镜放放到实验验台上时时，先放放镜座的的一端，再再将镜座座全部放放稳，切切不可使使镜座全全面同时时与台面面接触，这这样震动动过大，透透镜和微微调节器器的装置置易损坏坏。（3）避避免强酸酸、强碱碱、氯仿仿、乙醚醚、酒精精等化学学药品与与显微镜镜接触，避避免日光光直射，显显微镜须须经常保保持清洁洁，勿使使油污和和灰尘附附着。（4）接接目镜和和接物镜镜不要随随便卸下下，必须须抽取接接目镜时时，须将将镜筒上上口用布布遮盖，避避免灰尘尘落入镜镜筒内。更更换接物物镜时，卸卸下后应应倒置在在清洁的的台面上上，并随随即装入入木箱的的置放接接物镜的的管内。（5）细细调节器器是显微微镜最精精细而脆脆弱的部部分
24、，不不要向一一个方向向连续转转动数周周，应轻轻微地来来回旋转转。（6）镜镜头必须须保持清清洁，油油镜使用用完后应应立即用用擦镜纸纸拭去香香柏油。若若油镜镜镜头上的的油迹未未擦干净净，应先先将1:1醇醚醚混合液液或二甲甲苯滴在在擦镜纸纸上擦拭拭镜头，再再用干净净擦镜纸纸将镜头头上残留留的醇醚醚混合液液或二甲甲苯擦净净。（7）显显微镜擦擦净后，取取下标本本片，下下降聚光光器，再再将物镜镜转成“品品”字形形，送至至显微镜镜室放入入镜箱内内。三、暗视视野显微微镜1构造造与原理理：在显显微镜上上安装一一个特制制的聚光光器一暗暗视野聚聚光器。此此聚光器器中央为为一黑板板所遮，光光线不能能直接通通向镜筒筒，
25、使视视野背景景黑暗。这这样，从从聚光器器周边斜斜射到载载玻片上上细菌等等微粒上上的光线线，就因因散射作作用而发发出亮光光，反射射到镜简简内。故故在强光光照射下下，可在在黑色的的背景中中看到发发亮的菌菌体。正正如我们们在暗室室内，能能看到从从隙缝漏漏入的阳阳光内，有有无数颗颗尘埃微微粒跳跃跃飞舞一一样。2使用用方法：（1）将将显微镜镜聚光器器御下，装装上暗视视野聚光光器，置置暗室，使使用人工工光源。（2）先先用低倍倍物镜观观察，调调节光环环置中央央后，在在暗视野野聚光器器表面滴滴上香柏柏油（或水），再将将标本夹夹在移动动尺上。（3）调调节暗视视野聚光光器，使使之油滴滴（或水滴滴）与镜台台上的载载
26、玻片底底面接触触，（4）其其余操作作同光学学显微镜镜。四、荧光光显微镜镜1构造造：（1）荧荧光显微微镜光源源：能发发射丰富富的紫外外线光和和紫兰光光，常用用15002000瓦高压压汞灯。（2）滤滤光片：1）激发发滤光片片装于光光源与聚聚光器之之问，可可选择性性使紫外外光及紫紫兰光通通过，激激发荧光光素发出出荧光；2）吸收收滤光片片装于物物镜与目目镜之间间，可吸吸收紫外外光及紫紫兰光，仅仅让荧光光通过，以以便观察察标本和和保护眼眼睛。2荧光光显微镜镜的使用用方法：（1）将将荧光显显微镜置置暗室，开开启光源源，待光光源稳定定并达到到一定亮亮度（约5110miin）后后，对准准光轴。（2）装装好配对
27、对的激发发滤光片片和吸收收滤光片片后再作作观察。操操作同光光学显微微镜。3注意意事项（1）荧荧光显微微镜如用用高压汞汞灯作光光源，使用时时一经开开启不宜宜中断，断电后后需待汞汞灯冷却却后（约约15mmin）方能再启用。（2）使使用荧光光显微镜镜观察标标本时间间不宜太太长因因标本在在高压汞汞灯下照照射超过过3miin，即即有荧光光减弱现现象。【结果记记录和报报告】实验二 细菌菌的形态态学检查查【目的和和要求】1熟悉悉细菌染染色的常常用染料料和一般般程序。2掌握握革兰染染色的方方法、原原理、结结果观察察及意义义。3熟悉悉不染色色标本检检查法（压压滴法和和悬滴法法）的方法与结结果观察察。4熟悉悉细菌
28、的的特殊染染色法。【试剂与与器材】1菌种种：葡萄萄球菌、大大肠埃希希菌。2试剂剂：革兰兰染色液液、细胞胞壁染色色液、芽芽胞染色色液、鞭鞭毛染色色液、生生理盐水水等。3其他他：载玻玻片、接接种环、酒酒精灯、显显微镜、香香柏油、蜡蜡笔、擦擦镜纸、脱脱油剂等等。【实验内内容】一、细菌菌染色的的一般程程序细菌染色色法分单单染法和和复染法法。单染染法是用用一种染染料去染染，所有有细菌都都染成一一种颜色色；复染染法是用用多种染染料对细细菌进行行染色，不不同细菌菌可染成成不同的的颜色。大部分细细菌染色色的基本本程序相相同，即即：涂片片干燥燥固定定染色色，根据据实验目目的选择择不同的的染色方方法，在实际际工作
29、中中，应用用最广泛泛的是革革兰染色色法。二、革兰兰染色1染色色原理（1）等等电点学学说：革革兰阳性性菌的等等电点（ppI23）比比革兰阴阴性菌（ppI45）低低，在同同一pHH条件下下革兰阳阳性菌带带负电荷荷比革兰兰阴性菌菌要多，与与带正电电荷的碱碱性染料料（结晶晶紫）结结合性牢牢固，不不易脱色色。（2）化化学学说说：革兰兰阳性菌菌含有大大量的核核糖核酸酸镁盐，与与进入胞胞浆内的的结晶紫紫和碘牢牢固结合合成大分分子复合合物，不不易被995%酒酒精脱色色；而革革兰阴性性菌含此此种物质质少，故故易被乙乙醇脱色色。（3）通通透性学学说：革革兰阳性性菌细胞胞壁结构构较致密密，肽聚聚糖层较较厚，含含脂质
30、少少，脱色色时，乙乙醇不易易进入，而而且955乙醇醇可使细细胞壁脱脱水，细细胞壁间间隙缩小小，通透透性降低低，阻碍碍结晶紫紫和碘复复合物渗渗出。 而革兰兰阴性菌菌细胞壁壁结构疏疏松，肽肽聚糖层层较薄，含含脂质多多，易被被乙醇溶溶解，致致使细胞胞壁通透透性增高高，细胞胞内的结结晶紫与与碘复合合物易被被溶出而而脱色。2方法法 （1）涂涂片：取取清洁无无油迹的的载玻片片1张，用用蜡笔划划线将其其分成左左右两格格。用接接种环先先挑取生生理盐水水122环于载载玻片每每格中央央，再分分别挑取取大肠杆杆菌和葡葡萄球菌菌少许菌菌落与生生理盐水水研匀，涂涂成直径径约1.5cmm的菌膜膜。（2）干干燥：让让涂片自
31、自然干燥燥，也可可在酒精精灯火焰焰较远处处微微加加热烘干干，但切切勿靠近近火焰。（3）固固定：干干燥后的的标本片片在酒精精灯火焰焰上来回回通过33次（以以钟摆的的速度），冷冷却后染染色。固固定的目目的在于于杀死细细菌，并并使菌膜膜与玻片片牢固粘粘附，避避免染色色过程中中被水冲冲洗掉，通通过固定定还可凝凝固细胞胞质，改改变细菌菌对染料料的通透透性，使使细菌易易与染料料结合而而着色。（4）染染色：分分以下四四步：1minn，水洗洗 11minn，水洗洗 约约0.55minn，水洗洗0.55minn，水洗洗结晶紫卢卢戈碘液液95乙醇稀稀释石炭炭酸复红红待干、镜镜检（初染） （媒染染） （脱脱色） （
32、复染染）3结果果：革兰兰阳性菌菌染成紫紫色；革革兰阴性性菌染成成红色。4注意意事项：（1）涂涂片厚薄薄要适宜宜，以菌菌膜刚好好能透过过字迹为为宜（半半透明）。如如果涂片片太厚有有可能将将革兰阴阴性菌染染成紫色色，涂片片太薄则则可能将将革兰阳阳性菌染染成红色色。（2）脱脱色时间间长短要要适宜，如如果涂片片较厚应应相应的的延长脱脱色时间间，如涂涂片较薄薄则相应应的缩短短脱色时时间，脱脱色时应应不断旋旋转玻片片摇匀，使使其充分分脱色，通通常脱到到乙醇中中没有紫紫色流下下即可。（3）水水洗时，水水流不能能过大，防防止水流流直接对对准菌膜膜冲洗。（4）所所有染液液应防止止因蒸发发而改变变浓度，特特别是卢
33、卢戈碘液液久存或或受光作作用后失失去媒染染作用；涂片上上积水过过多会降降低染液液浓度，影影响染色色效果。（5）因因细菌的的菌龄不不同染色色结果也也有差异异，一般般以188244h培养养物染色色结果最最好。5医学学意义：通过革革兰染色色有助于于细菌的的初步鉴鉴别，并并可作为为选择药药物的参参考，了了解细菌菌的致病病性。三、特殊殊染色法法细菌的细细胞壁、核核质、胞胞浆颗粒粒和细菌菌的特殊殊结构如如芽胞、荚荚膜、鞭鞭毛等，必必须用相相应的特特殊染色色法才能能染上颜颜色。1细胞胞壁染色色法（1）涂涂片、干干燥：同同革兰染染色法。（2）固固定：滴滴加1000g/L鞣酸酸固定标标本155minn，水洗洗。
34、（3）滴滴加5gg/L龙龙胆紫染染色35miin，水水洗，待待干、镜镜检。结果：有有细胞壁壁的细菌菌仅菌体体周边染染成紫色色，菌体体内部无无色；无无细胞壁壁的细菌菌（如LL型细菌菌）整个个菌体都都染成紫紫色。2鞭毛毛染色法法（改良良Ryuu法）鞭毛染色色可从平平板上直直接挑取取菌落，也也可从斜斜面培养养基上刮刮取菌苔苔涂片，必必须注意意动作尽尽量轻，以以免鞭毛毛脱落。培培养基应应为营养养较好的的琼脂平平板（如如血平板板、营养养琼脂），不不可用含含抑制剂剂的选择择培养基基（如SSS、中中国蓝、MMAC等等）。（1）玻玻片的处处理：要要求用新新的载玻玻片，用用前在995%乙乙醇中浸浸泡244h以上
35、上，用时时从酒精精中取出出，用干干净的纱纱布擦干干使用。若若水滴向向周围流流散而不不形成水水珠表示示玻片处处理良好好。（2）在在玻片上上加蒸馏馏水1滴滴，用接接种针蘸蘸取菌落落少许，将将细菌点点在蒸馏馏水滴的的顶部（一一般只需需点一下下，仅允允许极少少量细菌菌进入水水滴），使使其自然然流散成成薄膜，不不可搅动动，以免免鞭毛脱脱落。（3）室室温自然然干燥，不不可在火火焰上烘烘干。（4）滴滴加染液液（配方方见附录录二），染染色约110115miin后，将将玻片微微倾斜，用用蒸馏水水缓慢滴滴加在玻玻片顶端端无菌膜膜处洗去去染液，注注意洗净净染液表表面的金金属光泽泽液膜。（5）玻玻片自然然干燥后后镜检
36、。观观察时应应从细菌菌较少的的地方寻寻找鞭毛毛。结果：鞭鞭毛染成成红色。3芽胞胞染色法法（1）涂涂片、干干燥、固固定：同同革兰染染色法。（2）染染色：分分为以下下三步。1）初染染：在菌菌膜上加加石炭酸酸复红染染液，用用微火加加热使染染液冒蒸蒸气5mmin，注注意不能能煮沸或或烧干，加加热过程程中应随随时添加加染液，冷冷却后水水洗。2）脱色色：用995%乙乙醇脱色色122minn，水洗洗。3）复染染：用碱碱性美蓝蓝染1mmin，水水洗，待待干、镜镜检。结果：菌菌体呈蓝蓝色，芽芽胞染成成红色。4荚膜膜染色法法（1）黑黑斯氏法法1）涂片片，自然然干燥，加加热固定定。2）滴加加结晶紫紫染液，在在火焰上
37、上微微加加热至染染液冒蒸蒸气为止止。3）用硫硫酸铜溶溶液将玻玻片上的的染液洗洗去（注注：切勿勿水洗），用用吸水纸纸吸干后后镜检。结果：菌菌体及背背景均染染成紫色色，荚膜膜染成淡淡紫色或或无色。（2）密密尔氏法法1）涂片片：提前数数日于小小鼠腹腔腔注射肺肺炎链球球菌0.2mll，小鼠鼠死亡后后取腹腔腔液印片片，自然然干燥，加加热固定定。2）滴加加石炭酸酸复红染染液，微火加加热染色色1miin，水水洗。3）加媒媒染剂染染0.55minn，水洗洗。4）加碱碱性美蓝蓝染色11minn，水洗洗，待干干，镜检检。结果：菌菌体染成成鲜红色色，荚膜膜染成蓝蓝色。5异染染颗粒染染色细菌经涂涂片、干干燥、固固定，
38、加加甲液（见见附录二二）染色色355minn，水洗洗后加乙乙液染色色1miin，水水洗，待待干、镜镜检。结果：菌菌体染成成蓝绿色色，异染染颗粒染染成蓝黑黑色。四、不染染色标本本检查法法细菌未经经过染色色呈无色色透明，在在显微镜镜下为有有折光性性的小点点，不能能判断细细菌的形形态和结结构特征征。因此此，不染染色标本本检查法法主要用用于观察察细菌的的动力，常常用的方方法有以以下几种种。1压滴滴法用接种环环分别取取菌液223环环，置于于洁净载载玻片中中央。用用小镊子子挟一盖盖玻片，先先使盖玻玻片一边边接触菌菌液，然然后缓缓缓放下，覆覆盖于菌菌液上，避避免菌液液中产生生气泡。先用低倍镜找到观察部位，再
39、换高倍镜观察细菌的运动。2悬滴滴法取一洁净净凹玻片片，在凹凹窝四周周涂少许许凡士林林。取一一环菌液液于盖玻玻片中央央，将凹凹玻片凹凹窝对准准盖玻片片上的菌菌液，迅迅速翻转转载玻片片，用小小镊子轻轻压盖玻玻片，使使之与凹凹玻片粘粘紧封闭闭（见图图2-11），置置显微镜镜下观察察。图2-11 悬悬滴法3暗视视野显微微镜观察察将上述经经压滴法法制成的的标本片片，置于于暗视野野显微镜镜下观察察，有鞭鞭毛的细细菌运动动活泼，在在黑色的的背景下下闪闪发发亮，有有明显的的位置移移动。观察要点点：有鞭鞭毛的细细菌运动动活泼，可可向不同同方向迅迅速运动动，位置置移动明明显。无无鞭毛细细菌不能能做真正正的运动动，
40、但受受水分子子的撞击击而呈分分子运动动（布朗朗运动），即即在一定定范围内内作来回回颤动，位位置移动动不大，注注意与细细菌的鞭鞭毛运动动相鉴别别。【结果记记录和报报告】实验三 灭菌菌前的准准备与基基础培养养基的制制备【目的和和要求】1熟悉悉常用玻玻璃器皿皿的清洗洗、灭菌菌前的包包装准备备。2熟悉悉培养基基的种类类、主要要成分及及用途。3掌握握基础培培养基的的制备程程序、方方法和注注意事项项。【试剂与与器材】1试剂剂：牛肉肉膏、蛋蛋白胨、氯氯化钠、琼琼脂粉、11moll/L NaOOH、11moll/L HCll等。2器材材：试管管、吸管管、平皿皿、锥形形瓶、量量筒、吸吸管、精精密PHH试纸、天天
41、平、滤滤纸等。【实验内内容】一、常用用玻璃器器材的洗洗涤和准准备1玻璃璃器材的的洗涤 玻璃器器材若不不清洁，常常可影响响实验结结果，如如影响培培养基的的pH值值，甚至至由于某某些化学学物质的的存在可可抑制微微生物的的生长；试管不不清洁也也可影响响血清学学反应的的结果，如如在pHH3时时可发生生酸凝集集。因此此，微生生物实验验所用的的各种玻玻璃器材材必须清清洗干净净后才能能使用。（1）新新的玻璃璃器材：先用肥皂皂水煮沸沸半小时时，再用用自来水水冲洗多多次，晾晾干水后后浸于22HCCl内数数小时，将将游离的的杂质除除去，最最后用自自来水反反复冲洗洗除尽残残余HCCl后，晾晾干备用用。（2）用用过的
42、玻玻璃器材材：1）凡含含有培养养基或病病原微生生物的玻玻璃器材材，均应应先用煮煮沸或高高压蒸汽汽灭菌法法灭菌，然然后趁热热倒出培培养基，用用5肥肥皂水刷刷洗，再再用自来来水冲净净后倒置置架上，晾晾干备用用。 2）试管管：作血血清反应应的试管管若不含含病原微微生物，可可先用55热肥肥皂水刷刷洗，再再用自来来水冲洗洗；若不不够清洁洁，可先先用清洁洁液（配配制法见见附录二二）浸泡泡数小时时，然后后用自来来水冲洗洗7次以以上，晾晾干备用用。3）吸管管：吸过过病原微微生物的的吸管，应应插入盛盛有消毒毒液（335来苏）的的玻璃筒筒中（筒筒底应垫垫纱布或或棉花，以以免碰破破吸管尖尖），使使消毒液液盖过吸吸管
43、，浸浸泡244h后，用用5肥肥皂水洗洗涤，再再用自来来水冲洗洗（若无无病原微微生物污污染，则则可用自自来水浸浸泡或直直接用自自来水冲冲洗），晾晾干水后后，用清清洁液浸浸泡数小小时，最最后用自自来水冲冲洗7次次以上，晾晾干备用用。4）载玻玻片及盖盖玻片：用后分分别浸入335的来苏苏液中，浸浸泡244h后，用用5肥肥皂水煮煮沸100minn，再用用自来水水冲洗，晾晾干后于于清洁液液中浸泡泡数小时时，最后后用自来来水洗净净，晾干干备用。5）注射射器：用用后若无无病原微微生物污污染，立立即用自自来水将将注射器器及针头头等抽洗洗干净；若有病病原微生生物污染染，则立立即进行行煮沸消消毒（含含有芽胞胞菌，则
44、则应用高高压蒸汽汽灭菌）。在在消毒或或灭菌之之前，均均应先将将清水抽抽入针头头及注射射器内反反复抽洗洗几次，并并连同洗洗出水一一起消毒毒或灭菌菌，以免免加热时时有蛋白白质凝固固而阻塞塞针头或或注射器器。若用用上述方方法不能能洗净，可可再置清清洁液中中浸泡数数小时（针针头不能能用清洁洁液泡），取取出用自自来水冲冲洗7次次以上，干干燥后备备用。2常用用无菌器器材的准准备（1）包包装1）平皿皿：用纸纸包好，或或盛入金金属盒内内。2）试管管和锥形形瓶：空空的或盛盛有培养养基的均均可用棉棉塞塞好好，并用用不透水水的厚纸纸包于棉棉塞外。若若是盛有有液体培培养基的的试管，应应直立并并扎成捆捆，以免免灭菌时时
45、倾倒。3）吸管管：于吸吸口端先先垫入少少许棉花花(不可可太松或或太紧)，然后后每支分分别用纸纸包好，或或以数支支放入金金属筒内内。4）注射射器：最最好将内内芯取出出，与外外套一起起用纸或或纱布包包好；针针头最好好装入小试管管内（管管底垫有有少量棉棉花），管管口塞上上棉塞。（2）灭灭菌上述玻璃璃器材可可用高压压蒸汽灭灭菌法，也也可用干干烤法进进行灭菌菌。如用用干烤法法应注意意控制温温度和时时间在116017002hh，以免免烧焦棉棉塞及外外包的纸纸张等。注意：任任何已灭灭菌的器器材。在在使用前前不能随随意打开开，一经经打开则则不再认认为是无无菌的。二、基础础培养基基的制备备程序和和方法培养基是是
46、用人工工方法将将细菌生生长所需需要的营营养物质质按一定定比例配配制而成成的营养养基质。按按照物理理性状分分为：液液体、半半固体和和固体培培养基三三类，其其区别主主要是凝凝固剂的的有无和和多少；按用途途分为：基础、营营养、选选择、鉴鉴别、增增菌、特特殊培养养基等。培养基的的成分因因种类不不同而异异，其中中基础培培养基含含有一般般细菌生生长所需需要的基基本营养养成分，如如：蛋白白胨、肉肉浸液（或或牛肉膏膏）、氯氯化钠和和水，这这些营养养物质能能为细菌菌提供生生命所需需的碳源源、氮源源、无机机盐、水水分，并并能调节节菌体内内外的渗渗透压，为为细菌提提供能量量。其他他培养基基大多是是在基础础培养基基中
47、加入入某些特特殊成分分（如：营养物物质、抑抑菌剂、检检测基质质、指示示剂等）配制制而成。1培养养基配制制的基本本程序包括：调调配、溶溶化、矫矫正pHH、过滤滤澄清、分分装、灭灭菌、鉴鉴定等几几个主要要步骤。（1）调调配：先先在锥形形瓶或烧烧杯中加加入少量量蒸馏水水（事先先量好），按按照培养养基的配配方准确确称取各各种成分分加入瓶瓶中混合合，再将将剩余的的水冲洗洗瓶壁。（2）溶溶化：将将调配好好的混合合物置电电炉上隔隔水加热热，使其其完全溶溶解，注注意随时时搅拌，防防止溶液液外溢，溶溶解完毕毕，应补补足失去去的水分分。（3）矫矫正PHH：用PPH比色色计、比比色法或或精密PPH试纸纸矫正溶溶液的PPH，一一般矫正正至7.277.6左左右。其其中PHH试纸矫矫正法操操作简便便，快速速，但误误差较大大；用PPH比色色计和比比色法测测定PHH较为准准确，后后者无需需特殊仪仪器。