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1、 培养基的配制培养基的配制(pizh)及质量及质量控制控制 2017年年8月月 第一页，共45页。一、培养基的配制一、培养基的配制(pizh)培养基是绝大多数微生物试验的基础。因此，培养基的质量是微生物试验成功与否的关键因素。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制(kngzh)试验是提供优质培养基的保证。第二页，共45页。培养基可按培养基可按处处方制方制备备也可使用按也可使用按处处方生方生产产的符合的符合规规定的商品化成品定的商品化成品(chngpn)培养基，脱水培养基除附有培养基，脱水培养基除附有处处方和使用方和使用说说明外明外还应还应注明有效期、注明有效期、贮贮存条件、适用性存条件、适用
2、性试验试验的的质质控菌株和用途。配制控菌株和用途。配制时应时应按使用按使用说说明上的要求操明上的要求操作，受潮作，受潮结块结块不能使用，以确保培养基的不能使用，以确保培养基的质质量符合要求。量符合要求。第三页，共45页。使用使用(shyng)容器容器 配制培养基使用配制培养基使用(shyng)的容器应的容器应是玻璃器皿或搪瓷器皿如搪瓷筒、量筒、是玻璃器皿或搪瓷器皿如搪瓷筒、量筒、漏斗、三角烧瓶、刻度吸管、试管、培漏斗、三角烧瓶、刻度吸管、试管、培养皿等。养皿等。禁用金属容器如铁、铜、铝容器，避免禁用金属容器如铁、铜、铝容器，避免金属离子与培养基成分结合，生成有害金属离子与培养基成分结合，生成有
3、害物质，影响细菌生长。物质，影响细菌生长。第四页，共45页。使用的器皿应使用的器皿应 洗净，用蒸馏洗净，用蒸馏水或纯化水完全冲洗以消除清洁剂水或纯化水完全冲洗以消除清洁剂和外来物质的残留，并进行清除污和外来物质的残留，并进行清除污物的确认后方可使用。物的确认后方可使用。若于非洁净的玻璃器皿中制备，若于非洁净的玻璃器皿中制备，可能导致可能导致(dozh)抑菌物质进入培抑菌物质进入培养基中。抑菌物质可能是残留的玻养基中。抑菌物质可能是残留的玻璃器皿清洁用的清洁剂或之前玻璃璃器皿清洁用的清洁剂或之前玻璃器皿所盛装的物质。器皿所盛装的物质。第五页，共45页。配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况配制
4、培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况下需要用去离子水和蒸馏水，对热敏感的培养基下需要用去离子水和蒸馏水，对热敏感的培养基应用应用(yngyng)灭菌水和无菌容器配制与分装，灭菌水和无菌容器配制与分装，配制时若需加热助溶应注意温度不要过高。配制时若需加热助溶应注意温度不要过高。第六页，共45页。对配制培养基的过程作详细的记录，对配制培养基的过程作详细的记录，记录内容包括：配制日期、培养基名记录内容包括：配制日期、培养基名称、成分、配制数量称、成分、配制数量(shling)、质、质量监控结果等进行全面详细记录。量监控结果等进行全面详细记录。第七页，共45页。1、培养基的制备、培养基的制备(zhbi
5、)方法方法 称量 为保证培养基质量的稳定可靠，在配制培养基时，在称量前要详细了解处方和使用说明(shumng)，按照产品说明(shumng)书的规定称量，各称量物的重量应记录。各脱水培养基或组成培养基的组分应准确称量，并要求有一定的精确度。第八页，共45页。配配制制 将将准准确确称称量量的的各各组组分分或或脱脱水水培培养养基基加加入入(jir)溶溶剂剂中中，完完全全溶溶解解，如如需需要要可可适适当当加加热热。所所有有的的培培养养基基对对热热都都有有或或多多或或少少的的敏敏感感，因因此此当当培培养养基基需需要要加加热热溶溶解解时时，应应注注意意不不要要加加热热过过度度，否否则则会会使使培培养养基
6、基颜颜色变深。色变深。配配制制培培养养基基所所用用的的器器具具应应能能方方便便控控制制加加热热和和不不断断搅搅拌拌。当当培培养养基基需需要要添添加加其其它它组组分分时，添加后也应将其充分混匀。时，添加后也应将其充分混匀。第九页，共45页。分装分装 配制的培养基根据试验需要分配制的培养基根据试验需要分装试管、倾注平皿、制备斜面。装试管、倾注平皿、制备斜面。经灭菌的培养基分装，应在无菌环境下经灭菌的培养基分装，应在无菌环境下按无菌要求按无菌要求(yoqi)操作，避免污染。操作，避免污染。第十页，共45页。对热敏感的培养基如糖发酵培养基其分装容器(rngq)一般应预先进行灭菌，以保证培养基的无菌性。
7、第十一页，共45页。矫正矫正pH 配制培养基必须矫正配制培养基必须矫正pH，干，干燥培养基也必须对燥培养基也必须对pH进行验证，高压进行验证，高压灭菌前的灭菌前的pH应比最终应比最终pH值高值高0.2左右左右(zuyu)。矫正。矫正pH后的培养基应加后的培养基应加热、过滤，使培养基澄清。热、过滤，使培养基澄清。第十二页，共45页。2、培养基的灭菌、培养基的灭菌(mi jn)灭菌方法及条件灭菌方法及条件(tiojin)不当可直接影响不当可直接影响培养基质量，培养基灭菌方法和条件培养基质量，培养基灭菌方法和条件(tiojin),商品化的成品培养基或自配的培养基若采用不适商品化的成品培养基或自配的培
8、养基若采用不适当的加热和灭菌条件当的加热和灭菌条件(tiojin)，有可能引起颜，有可能引起颜色变化、透明度降低、琼脂凝固力或色变化、透明度降低、琼脂凝固力或pH的变化，的变化，而不符合培养基质量的要求。而不符合培养基质量的要求。第十三页，共45页。培养基的灭菌应按照生产商提供或使用者验证的参数进行(jnxng)。商品化的成品培养基必须附有所用灭菌方法的资料。第十四页，共45页。不同种类培养基应采用不同的灭菌方不同种类培养基应采用不同的灭菌方法，配制好的培养基灭菌一般多用流法，配制好的培养基灭菌一般多用流通蒸汽灭菌和滤膜过滤通蒸汽灭菌和滤膜过滤(gul)除菌。除菌。流通蒸汽灭菌是最常用的最有效
9、的灭流通蒸汽灭菌是最常用的最有效的灭菌法，菌法，121，15min(121，30min)或或116，40min可杀死所有可杀死所有的细菌芽孢。的细菌芽孢。第十五页，共45页。3、培养基的贮藏、培养基的贮藏(zhcng)商品化培养基应根据使用说明书上的商品化培养基应根据使用说明书上的要求进行储存要求进行储存(chcn)。培养基标签上。培养基标签上应标有批号，生产日期、有效期及培养应标有批号，生产日期、有效期及培养基的有关特性。所采用的保藏和运输条基的有关特性。所采用的保藏和运输条件应使培养基最低限度失去水分并提供件应使培养基最低限度失去水分并提供机械保护。机械保护。第十六页，共45页。脱水培养基
10、或单独配方组分应在适当的条件下贮存，如低温、干燥和避光，所有的容器应密闭(mb)，尤其是盛有脱水培养基的容器.第十七页，共45页。配制好的培养基应保存配制好的培养基应保存(bocn)在在225避光的环境。避光的环境。若保存若保存(bocn)于非密闭容器中，一般于非密闭容器中，一般在三周内使用在三周内使用,若保存若保存(bocn)于密闭容于密闭容器中，一般在一年内使用器中，一般在一年内使用.第十八页，共45页。琼脂培养基不得在琼脂培养基不得在0或或0以下存放，防止冷冻破以下存放，防止冷冻破坏凝胶特性。坏凝胶特性。琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，一般不超琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，一般
11、不超过一周，且应密闭包装，若延长过一周，且应密闭包装，若延长(ynchng)保存，保存，保存期需经验证确定。保存期需经验证确定。培养基灭菌后应立即取出，不得储藏在高压灭菌器中，培养基灭菌后应立即取出，不得储藏在高压灭菌器中，避免影响培养基的质量。避免影响培养基的质量。第十九页，共45页。固体培养基灭菌后的再融化应在加热固体培养基灭菌后的再融化应在加热的水浴中或采用流通蒸汽进行，只允许的水浴中或采用流通蒸汽进行，只允许一次，融化的培养基应放在一次，融化的培养基应放在4550的的烘箱中，不得超过烘箱中，不得超过8小时。小时。使用过的培养基（包括使用过的培养基（包括(boku)失效失效的培养基）应按
12、照国家污染废物处理相的培养基）应按照国家污染废物处理相关规定进行。关规定进行。第二十页，共45页。二、培养基的质量二、培养基的质量(zhling)控控制制 经经实实验验室室配配制制或或由由生生产产厂厂生生产产的的培培养养基基的的质质量量高高度度依依赖赖于于其其如如何何制制备备，采采用用不不适适宜宜方方法法制制备备的的培培养养基基将影响微生物的生长将影响微生物的生长(shngzhng)或复苏，从而影响试验结果的可靠性。或复苏，从而影响试验结果的可靠性。第二十一页，共45页。所有配制所有配制(pizh)好的培养基均应好的培养基均应进行验证，验证方法参照中国药进行验证，验证方法参照中国药典典2015
13、年版附录无菌检查或微年版附录无菌检查或微生物限度检查项下有关规定进行。生物限度检查项下有关规定进行。第二十二页，共45页。实验室配制的培养基监控实验室配制的培养基监控(jin kn)项目项目 外观、性状、外观、性状、pH、促生长试验、定期的稳、促生长试验、定期的稳定性检查以及培养基有效期的确定。定性检查以及培养基有效期的确定。第二十三页，共45页。验证时间 由同一批脱水培养基配制培养基时，若采用已验证的配制和灭菌程序，那么可不进行批批促生长试验。如果培养基制备的方法未经验证，那么，配制的每一批培养基必须进行促生长试验。试验方法 根据培养基的用途(yngt)参照中国药典2015年版附录无菌检查或
14、微生物限度检查项下有关规定进行。第二十四页，共45页。培养基的有效期 是指已通过促生长试验的培养基在整个有效期内均需符合(fh)这些相应的标准。每批培养基储存的时间将取决于一定存放条件（包括容器和密封性）的培养基组成成分的稳定性。第二十五页，共45页。试验结果处理 当批培养基不符合促生长试验，应寻找造成不合格的原因。这个(zh ge)调查包括采取适当的行动以防止问题的重复出现。如果未找到原因或还没有解决有关培养基的促生长问题，那么任何不符合要求的批次均不能使用。第二十六页，共45页。1、测定、测定(cdng)PH值值 每批培养基灭菌后均应测定每批培养基灭菌后均应测定pH值；在值；在冷却至室温（
15、冷却至室温（25）后，以无菌操作）后，以无菌操作取出少量培养基进行测定。除非经验取出少量培养基进行测定。除非经验证表明证表明(biomng)培养基的培养基的pH允许允许的变化范围很宽，否则，培养基的的变化范围很宽，否则，培养基的pH的范围不得超过规定的的范围不得超过规定的0.2。第二十七页，共45页。2、一般、一般(ybn)性状性状 制成平板或分装于试管的培养基应检制成平板或分装于试管的培养基应检查；容器和盖子的破裂，装量。查；容器和盖子的破裂，装量。固体培养基因水分流失而造成表面产固体培养基因水分流失而造成表面产生裂缝或涟漪。生裂缝或涟漪。其他其他 如溶血，可能冷藏温度下形成如溶血，可能冷藏
16、温度下形成的结晶的结晶(jijng)，大量的汽泡，微生物，大量的汽泡，微生物污染，氧化还原指示剂的状况，批数量污染，氧化还原指示剂的状况，批数量和有效期的检查和记录，培养基的无菌和有效期的检查和记录，培养基的无菌检查等。检查等。第二十八页，共45页。液体(yt)培养基应观察培养基的颜色，是否有沉淀，微生物污染，氧化还原指示剂的状况，批数量和有效期的检查和记录等。第二十九页，共45页。3、培养基的促生长和抑制、培养基的促生长和抑制(yzh)性能试验性能试验 无菌检查用培养基 使用前应进行适用性试验，适用性试验包括(boku)无菌性检查和灵敏度检查，无菌性试验是检查培养基灭菌是否完全，灵敏度检查是
17、确定培养基的质量好坏、稳定与否，这对检验结果有极为重要的影响。培养基的灵敏度检查法如下：第三十页，共45页。灵敏度检查灵敏度检查(jinch)菌种菌种 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003 铜绿铜绿(tngl)假单胞菌假单胞菌 CMCC(B)10 104 枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌 CMCC(B)63 501 生孢梭菌生孢梭菌 CMCC(B)64 941 白色念珠菌白色念珠菌 CMCC(F)98 001 黑曲霉黑曲霉 CMCC(F)98 003 第三十一页，共45页。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 好氧性革兰阳性菌好氧性革兰阳性菌 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 好氧性革兰阴性菌好氧性
18、革兰阴性菌 枯草枯草(k co)芽胞杆菌芽胞杆菌 好氧性芽胞杆菌好氧性芽胞杆菌 生孢梭菌生孢梭菌 厌氧菌厌氧菌 白色念珠菌白色念珠菌 酵母菌酵母菌 黑曲霉黑曲霉 真菌真菌 这几类菌基本上代表了自然界常见的微生物这几类菌基本上代表了自然界常见的微生物,也是药品也是药品中常见的污染菌；中常见的污染菌；。第三十二页，共45页。灵敏度检查(jinch)培养基接种量试验菌试验菌 培养温度培养温度 培养基培养基 培养时间培养时间 接种管数接种管数 装装 量量 ()(天天)（支）支）（ml/支）支）金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 硫乙醇酸盐流体硫乙醇酸盐流体 3 2 12铜绿铜绿(tngl)假单胞菌假单胞菌
19、3035 3 2 12 生孢梭菌生孢梭菌 3 2 12枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 5 2 9白色念珠菌白色念珠菌 2025 胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基 5 2 9黑曲霉黑曲霉 5 2 9 每种菌液接种量含菌小于每种菌液接种量含菌小于100cfu 同时做同时做1支空白对照支空白对照第三十三页，共45页。结果判定结果判定 空白对照管应无菌生长。空白对照管应无菌生长。若加菌的培养基管均生长良好，判若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。该培养基的灵敏度检查符合规定。若加菌的培养基管不生长或生长不若加菌的培养基管不生长或生长不好好(b ho)，判该培养基的灵敏度检查，判
20、该培养基的灵敏度检查不符合规定，不能用于无菌试验，并寻不符合规定，不能用于无菌试验，并寻找造成不合格的原因。找造成不合格的原因。培养基的适用性检查可在供试品的无菌培养基的适用性检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。检查前或与供试品的无菌检查同时进行。第三十四页，共45页。微生物限度检查微生物限度检查(计数培养计数培养基基)培养基的适用性检查培养基的适用性检查 微生物限度检查微生物限度检查(计数培计数培养基养基)使用使用(shyng)前应进前应进行适用性试验，适用性试验行适用性试验，适用性试验包括促生长、抑制及指示能包括促生长、抑制及指示能力检查。力检查。第三十五页，共45页。
21、菌种菌种 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 CMCC(B)10 104金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003枯草芽孢枯草芽孢(y bo)杆菌杆菌 CMCC(B)63501 白色念珠球菌白色念珠球菌 CMCC（B）98001黑曲霉黑曲霉 CMCC（F）98003第三十六页，共45页。检查(jinch)方法 菌种 培养基 加入(jir)菌数 培养温度 培养时间 （cfu）（）（h）铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 胰酪大豆胨琼脂 50100 3035 48 枯草芽孢杆菌 黑曲霉 沙司葡萄糖琼脂 50100 2025 72 白色念珠球菌 第三十七页，共45页。菌菌悬悬液液制制备备后后在在室室温温
22、下下放放置置应应在在2小小时时内内使使用用，若若保保存存在在28可可以以(ky)在在24小小时时内内使使用用。黑黑曲曲霉霉孢孢子子悬悬液液可可保保存存在在 28，在在验验证证过过的的贮贮存存期期内内使使用。用。第三十八页，共45页。结果(ji gu)判定 被被检检培培养养基基上上的的菌菌落落(jnlu)平平均均数数不不得得小小于于对对照照培培养养基基菌菌落落(jnlu)平平均均数数的的70%，且且菌菌落落(jnlu)形形态态、大大小小应应与与对对照照培培养养基基上上的的菌菌落落(jnlu)一一致致。判判该该培培养养基基的的适适用用性性检查符合规定。检查符合规定。第三十九页，共45页。说说 明明
23、 1、在实验室中，培养基若使用、在实验室中，培养基若使用(shyng)同同一批脱水培养基，并采用已验证过的配制和灭菌一批脱水培养基，并采用已验证过的配制和灭菌方法配制那么由同一批脱水培养基配制的培养方法配制那么由同一批脱水培养基配制的培养基可以不必批批进行灵敏度检查。如果培养基制基可以不必批批进行灵敏度检查。如果培养基制备的方法不经验证，那么，必须对每一批配制的备的方法不经验证，那么，必须对每一批配制的培养基进行灵敏度试验。培养基进行灵敏度试验。第四十页，共45页。2、使用商品化培养基必须注意其有效期，有效期是指已通过促生长试验的培养基在整个有效期内均需符合这些相应的标准。每批培养基的存放时间
24、(shjin)将取决于存放条件（包括容器和密封性）和培养基组成成分的稳定性。第四十一页，共45页。3、当批培养基不符合促生长试验，应寻找造成不合格(hg)的原因。这个调查包括采取适当的行动以防止问题的重复出现。如果未找到原因或还没有解决有关培养基的促生长问题，那么任何 不符合要求的批次均不能使用。第四十二页，共45页。4、用于进一步鉴定(jindng)微生物的诊断试剂，如革蓝染色、氧化酶试验试剂等。它们与培养基相似点是培养基质量控制试验。在试剂用于未知样品鉴定(jindng)前，应选择正确的标准质控菌，按规定进行试验。第四十三页，共45页。5、培养基的有效期是指已通过促生、培养基的有效期是指已通过促生长试验的培养基在整个有效期内均需符长试验的培养基在整个有效期内均需符合这些相应的标准。合这些相应的标准。每批培养基有效期时间长短取决于存放每批培养基有效期时间长短取决于存放条件、培养基组成成分条件、培养基组成成分(chng fn)等等多种因素。多种因素。第四十四页，共45页。谢 谢第四十五页，共45页。