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1、基因工程的基本操作步骤1 1、基因工程包括哪些步骤？、基因工程包括哪些步骤？3 3、基因工程中的核心环节是哪一步？、基因工程中的核心环节是哪一步？4 4、基因表达载体导入到受体细胞有哪些方法？、基因表达载体导入到受体细胞有哪些方法？5 5、目的基因导入受体细胞就会成功表达吗？、目的基因导入受体细胞就会成功表达吗？如何检测和鉴定？如何检测和鉴定？2 2、什么是目的基因？获取的方法有哪些方法？、什么是目的基因？获取的方法有哪些方法？思考讨论问题：思考讨论问题：（二）获取目的基因的方法（二）获取目的基因的方法1、从基因文库中直接获取、从基因文库中直接获取2、PCR技术扩增技术扩增3、化学方法直接人工
2、合成、化学方法直接人工合成1 1、从基因文库中直接获取、从基因文库中直接获取（1 1）基因文库的概念）基因文库的概念部分基因文库：部分基因文库：基因组基因组DNADNA文库：文库：将含有某种生物将含有某种生物不同不同基因的许多基因的许多DNADNA片断，导入到受体菌片断，导入到受体菌的的群体群体中，中，各个受体菌各个受体菌分别含有这种生物的分别含有这种生物的不同基因不同基因，称为基，称为基因文库因文库含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分基因部分基因，如如:cDNA:cDNA文库文库（2 2）基因文库的建立方法基因文库的建立方法提取某种生物的全部提
3、取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与运载体连接片段与运载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库方法一：直接分离法方法一：直接分离法某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与运载体连接与运载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶方法二：反转录法方法二：反转录法-cDNA-cDNA的合成流程图解的合成流程图解PCRPCR技术技术多聚酶链式反应多聚酶链式
4、反应PCR扩增仪扩增仪DNADNA半保留复制的基本原理半保留复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNADNA2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因原理：原理：前提：前提：条件：条件：利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因5 53 3G GG G T TC C3 35 5 A AG GC CC C5 53 3引物引物G GG G高温高温变性变性低温低温退火退火中温中温延伸延伸1.1.目的基因目的基因DNADNA受热
5、变性，解链；受热变性，解链；5 53 3 A AG G引物引物2.2.引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.3.合成链在合成链在DNADNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因目的基因目的基因目的基因推测推测推测推测推测推测推测推测化学合成化学合成化学合成化学合成3、人工合成人工合成 核心核心二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建功功能能：使使目目的的基
6、基因因进进入入受受体体细细胞胞并并有有效效表表达达，而而且且要要能能稳稳定定存存在在且且遗遗传传给给后后代代。基因表达载体的构建基因表达载体的构建 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。个切口，露出黏性末端。2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。生相同的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重连接酶，形成了一个重组组DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）目的基因与运载体的结合过程，实际目
7、的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。上是不同来源的基因重组的过程。编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子 启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶聚合酶结合并能起结合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA RNA聚合酶聚合酶:能够识别能够识别启动子上的结合位点启动子上的结合位点并与其结并与其结合的一种蛋白质合的一种蛋白质.终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片
8、断，它片断，它能阻碍能阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离模板链上脱离下来，使转录终止。下来，使转录终止。终止子终止子编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子A G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CRNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶A G G U C A C G U C GA G G U C A C G U C G基因表达载体的组成：基因表达载体的
9、组成：b b、目的基因、目的基因a a、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因e e、复制原点、复制原点1 1、下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是 利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取 从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成 A.B.A.B.C.D.C.D.小试牛刀小试牛刀2 2、19971997年，科学家将动物体内的能年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNADNA分子重组，并且
10、在大肠杆菌中表分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。达成功。请据右下图回答问题。(1)(1)此图表示的是采取此图表示的是采取_合成基合成基因的方法获取因的方法获取_基因的过程。基因的过程。(2)(2)图中图中DNADNA是以为是以为_模板，形成单链模板，形成单链DNADNA，在酶的作用下，在酶的作用下合成双链合成双链DNADNA，从而获得了所需要的，从而获得了所需要的目的基因。目的基因。人工人工 目的目的 控制胰控制胰岛岛素合成的信使素合成的信使RNARNA 小试牛刀小试牛刀(3)(3)图中图中代表代表 ，它往往含它往往含 基因，以便对基因，以便对目的基因的检测。目的基因的检
11、测。重重组组DNADNA分子分子 标记标记 常用的受体细胞：常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞的方法将目的基因导入植物细胞的方法1、农杆菌转化法、农杆菌转化法2、基因枪法、基因枪法3、花粉管通道法、花粉管通道法土壤农杆菌转化法示意图土壤农杆菌转化法示意图将目的基因导入动物细胞的方法将目的基因导入动物细胞的方法显微注射法
12、显微注射法将目的基因导入微生物细胞方法将目的基因导入微生物细胞方法宿主细胞（大肠杆菌）宿主细胞（大肠杆菌）感受态细胞感受态细胞（大肠杆菌）（大肠杆菌）Ca2+四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定n首先：首先：n其次：其次：n最后：最后：n还要：还要：要检测转基因生物的要检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因上是否插入目的基因DNA分子杂交技术分子杂交技术分子探针分子探针检测目的基因是否转录出检测目的基因是否转录出mRNA检测目的基因是否翻译出蛋白质检测目的基因是否翻译出蛋白质个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，不能，受体细胞必须表现出特定
13、的性状，才能说明目的基因完成了才能说明目的基因完成了表达表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因分子后就说明目的基因完成了表达吗？完成了表达吗？若不能表达，若不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行再进行修饰修饰。多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。变化的个体进一
14、步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。3（2010江江苏苏高考，高考，27题题，8分分）下表中列出了几种限制）下表中列出了几种限制酶酶识识别别序列及其切割位点，序列及其切割位点，图图l、图图2中箭中箭头头表示相关限制表示相关限制酶酶的的酶酶切切位点。位点。请请回答下列回答下列问题问题：（1）一个图）一个图1所示的质粒分子经所示的质粒分子经Sma 切割
15、前后，分别含有切割前后，分别含有 个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。0、2（2）若对图中质粒进行改造，插入的）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，酶切位点越多，质粒的热稳定性越质粒的热稳定性越 。（3）用图中的质粒和外源）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是切割，原因是 。（4）与只使用）与只使用EcoR I相比较，使用相比较，使用BamH 和和Hind 两种两种限制酶同时处理质粒、外源限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止的优点在于可以防止 。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混）为了获取重组质粒，将
16、切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入合，并加入 酶。酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。（7）为了从）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在 的培养基中培养，以完成目的基因表的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。达的初步检测。高高 Sma破坏质粒上的抗性基因和外源破坏质粒上的抗性基因和外源DNA中的目的基因中的目的基因 质粒和含目的基因的外源质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化片段自身环化 DNA连接连接 鉴别和筛选含有目的基因的细胞鉴别和筛选含有目的基因的细胞 蔗糖为唯一含碳营养物质蔗糖为唯一含碳营养物质 结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！32