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1、分子荧光分析法分子荧光分析法.ppt.ppt基本要求基本要求掌握分子荧光的发生过程，激发光谱和发射光掌握分子荧光的发生过程，激发光谱和发射光谱，荧光光谱的特征，分子结构与荧光的关系；谱，荧光光谱的特征，分子结构与荧光的关系；影响荧光强度的因素，荧光定量分析方法。影响荧光强度的因素，荧光定量分析方法。熟悉分子从激发态返回基态的各种途径，荧光熟悉分子从激发态返回基态的各种途径，荧光寿命与荧光效率。寿命与荧光效率。了解荧光分光光度计与其他荧光分析技术。了解荧光分光光度计与其他荧光分析技术。2 处于基态的分子吸收能量被激发至激发态，然后从不稳定的激发态释放能量返回至基态。如果通过碰撞以热能或动能的形式
2、释放能量回到基态，称为无辐射跃迁；如果是以辐射(发射光子)的形式回到基态，此种现象称为光致发光。常见的光致发光包括荧光和磷光。概概 念念3荧光分析法荧光分析法 定义定义：根据物质的荧光谱线位置及其：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。强度进行物质鉴定和含量测定的方法。待测物质待测物质分子荧光分子荧光原子荧光原子荧光激发光的波长范围激发光的波长范围紫外紫外-可见荧光可见荧光红外荧光红外荧光X射线荧光射线荧光 分类分类：4荧光分析法的特点荧光分析法的特点 灵敏度高：灵敏度高：检测限检测限0.0001 g/mL,比分光光度法高比分光光度法高24个数量级。个数量级。（在黑背景下
3、检测；光源的强度大）（在黑背景下检测；光源的强度大）选择性高：选择性高：适当选择激发光的波长和荧光测定的适当选择激发光的波长和荧光测定的波波长；长；应用荧光寿命的差别应用荧光寿命的差别 时间分辨技术。时间分辨技术。5MFS与与UV/Vis法比较：法比较：原理原理UV/Vis吸收吸收MFS发射发射测定方法测定方法I0ItF灵敏度灵敏度,选择性选择性10-510-6molL-110-710-9molL-1I0F61575年，西班牙医生年，西班牙医生N.Monardes发现。发现。1852年，年，Sir George Stokes对荧光产生的机理对荧光产生的机理作了解释，并提出了作了解释，并提出了“
4、荧光荧光”。1867年，首次用于分析测定。年，首次用于分析测定。1928年，年，Jette和和West提出第一台光电荧光计。提出第一台光电荧光计。1952年，商品荧光分光光度计出现。年，商品荧光分光光度计出现。7第一节第一节 荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理一、分子荧光一、分子荧光二、荧光与分子结构二、荧光与分子结构三、影响荧光强度的外部因素三、影响荧光强度的外部因素8一、分子荧光一、分子荧光（一）（一）分子荧光的产生分子荧光的产生1、分子的电子能级与激发过程、分子的电子能级与激发过程分子的多重性分子的多重性M:M=2s+1，s表示总自旋量子数，表示总自旋量子数，s=0时分子所处的电时
5、分子所处的电子能态为单重态，用子能态为单重态，用S来表示；来表示；s=1时分子所处的电时分子所处的电子能态为三重态，用子能态为三重态，用T来表示；来表示；9光吸收过程光吸收过程失活过程发光失活分子间能量转移失活非辐射失活荧光磷光振动驰豫内转换外转换系间跨跃2.荧光的产生荧光的产生10吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间跨跃振动驰豫外转换基态荧光寿命荧光寿命:109107s磷光寿命磷光寿命:10410s图11-2 荧光和磷光产生示意图11辐射跃迁发光失活辐射跃迁发光失活荧光荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。磷光磷光：激发态分子从第一激发三重
6、态T1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。波长关系波长关系：激发光荧光磷光。12无辐射失活无辐射失活a.振动弛豫振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高b.内转换内转换：当两个电子能级非常接近以致其振动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级的过程。13无辐射失活无辐射失活c.外转换外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间发生相互碰撞而失去能量的过程。d.系间跨越系间跨越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。14吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间跨跃振动驰豫外转换基态荧光寿命荧光寿命:109107s磷光寿命磷光寿
7、命:10410s图11-2 荧光和磷光产生示意图15结论：结论：荧光是来自最低激发单重态的辐射跃迁过荧光是来自最低激发单重态的辐射跃迁过程所伴随的发光现象，发光过程的速率常程所伴随的发光现象，发光过程的速率常数大，激发寿命短；数大，激发寿命短；磷光是来自最低激发三重态的辐射跃迁过磷光是来自最低激发三重态的辐射跃迁过程所伴随的发光现象，发光过程的速率常程所伴随的发光现象，发光过程的速率常数小，激发寿命相对比较长。数小，激发寿命相对比较长。16复习：复习：荧光的产生荧光的产生基态分子基态分子hv激发态激发态回到基态，如何回去？回到基态，如何回去？17S2S0S1T1l2l1分子的吸收情况分子的吸收
8、情况18S2S0S1T1l2l1振动弛豫：在同一电子能级（激发态）振动弛豫：在同一电子能级（激发态）特点：无辐射；速率快特点：无辐射；速率快 （10-1410-12 s内完成）内完成）19S2S0S1T1l2l1内转移（内转移（internal conversion)：相同多：相同多重性的两个电子能级之间的非辐射跃迁重性的两个电子能级之间的非辐射跃迁20S2S0S1T1l2l1l3l3荧光发射荧光发射Fluorescence21l1l2l3l3 l1 l2 l3 l1 l2 Onlyl3l322S2S0S1T1l2l1系间跨跃系间跨跃磷光发射磷光发射l4IntersystemCrossingP
9、hosphorescence23S0S1T1l2l1外转移外转移 ExternalConversion24复习复习 分子荧光的发生过程分子荧光的发生过程基态分子基态分子 概念：基态、激发态（激发单重态概念：基态、激发态（激发单重态S S*、激发三、激发三重态重态T T*）能量传递过程：能量传递过程：1 1、无辐射跃迁（振动弛豫、内转换、外转换、无辐射跃迁（振动弛豫、内转换、外转换、系间跨越）系间跨越）2 2、辐射跃迁（荧光、磷光）、辐射跃迁（荧光、磷光）25吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间跨跃振动驰豫外转换基态荧光寿命荧光寿命:109107s磷光寿命磷光寿命:10410s图1
10、1-2 荧光和磷光产生示意图26（二）荧光的激发光谱和发射光谱荧光物质分子都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱（荧光光谱）。激发光谱：不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。荧光光谱：在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。图11-3 蒽的激发光谱和荧光光谱27激发光谱和发射光谱具有三个特点：斯托克斯位移，波长：荧光激发光；荧光发射光谱的形状与激发光波长无关；荧光光谱和激发光谱大致成镜像关系。图11-3 蒽的激发光谱和荧光光谱28蒽的激发光谱蒽的激发光谱(吸收光谱吸收光谱)和发射光谱和发射光谱(荧光光谱荧光光谱)激发光谱激发光谱:ExcitationSpectrum,激发波长激
11、发波长:ex发射光谱发射光谱EmissionSpectrum,发射波长发射波长:em图11-3 蒽的激发光谱和荧光光谱b0b1b2b3c3c2c1c029二、荧光与分子结构二、荧光与分子结构（一）荧光寿命和荧光效率（一）荧光寿命和荧光效率荧光寿命荧光寿命(f)：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的 1/e 所需的时间称为荧光寿命(10-810-10s)。荧光物质受到一个极短时间的脉冲光激发后，荧光强度从激发态到基态的变化，可用指数衰减定律表示 Ft=F0e-Kt，推导得，推导得lnF0/Ft=t/f F0、Ft：开始时和t时的荧光强度，K为衰减常数。30荧光效率荧光效率(f
12、)：又称为荧光量子产率 或荧光产率。31（二）有机化合物分子结构与荧光的关系（二）有机化合物分子结构与荧光的关系1.1.共轭效应共轭效应 *跃迁跃迁 芳香族化合物、五元杂环上取代苯基芳香族化合物、五元杂环上取代苯基.共轭体系越大共轭体系越大,越易产生荧光越易产生荧光,荧光效率也增大荧光效率也增大.(CH=CH)3=0.68(CH=CH)2=0.28322.刚性结构和共平面效应刚性结构和共平面效应酚酞酚酞(无荧光无荧光)8羟基喹啉羟基喹啉(弱荧光弱荧光)红色荧光红色荧光CO-OOCOO-COCOO-ONO-NOMgNO荧光黄荧光黄33联二苯联二苯=0.2芴芴=1.03,4-苯并芘苯并芘(强荧光物
13、质强荧光物质)CH234F Ff0.75F Ff0.03扭转离开了平面构型，影响了扭转离开了平面构型，影响了p-共轭作用共轭作用35顺式二苯乙烯顺式二苯乙烯无荧光无荧光反式二苯乙烯反式二苯乙烯强荧光强荧光363.取代基的作用取代基的作用 给电子基增强荧光给电子基增强荧光：OH,OR,NH2,NHR,NR2,CN吸电子基减弱荧光：吸电子基减弱荧光：COOH,C=O,NO2,NN,Cl,Br,I 与与 体系作用小的取代基影响不明显体系作用小的取代基影响不明显：SO3R,NH3,SH,F,R。COOHNO2I无荧光无荧光NH2OH比比荧光强荧光强50倍倍37 取代基之间若发生氢键，增强分子平面性取代
14、基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光和刚性会加强荧光:碱性碱性有荧光有荧光COOHOH无荧光无荧光OHCOOH水杨酸水杨酸中性、碱性中性、碱性均有荧光均有荧光OHOHCO38（三）荧光试剂（三）荧光试剂荧光胺荧光胺邻苯二甲醛（邻苯二甲醛（OPA）1-二甲氨基二甲氨基-5-氯化磺酰萘氯化磺酰萘 （Dansyl-Cl，丹酰氯），丹酰氯）测定无机离子的荧光试剂测定无机离子的荧光试剂39有机化合物的荧光分析(1)荧光胺(2)邻苯二甲醛(3)丹酰氯荧光胺及其水解产物不显荧光荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺类形成的衍生物有高强度荧光40NOHHOOHN=NHOSO3Na8羟基喹啉羟基喹啉(Al,Be
15、等等)茜素紫酱茜素紫酱R(Al,F-等等)用于测定无机离子的有机试剂用于测定无机离子的有机试剂C COOHH安息香安息香(B,Zn,Ge,Si等等)黄酮醇黄酮醇(Zr,Sn等等)OOHO41三、影响荧光强度的主要因素三、影响荧光强度的主要因素内部因素：分子结构对荧光效率的影响内部因素：分子结构对荧光效率的影响外部因素：外界条件对荧光效率的影响外部因素：外界条件对荧光效率的影响42内部因素：分子结构对荧光效率的影响。物质分子有强的紫外吸收和一定的荧光产率是发射荧光的两个必备条件。分子结构中有跃迁（K带强吸收）或n跃迁（R带弱吸收）。长共轭结构：分子中必须具有大的共轭键结构。共轭度越大，发射波长长
16、移，发光强度增加。分子的刚性和共平面性：具有刚性平面性结构的分子荧光量子产率高。取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而吸电子取代基则使荧光强度降低。1.内部因素43长共轭结构示例苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36维生素A ex327nm；em510nm 44刚性和共平面结构示例形成络合物后，如果分子的刚性和共平面性增强，可使荧光增强。联苯 f0.2 芴 f1.08-羟基喹啉羟基喹啉8-羟基喹啉镁羟基喹啉镁 45空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有荧光(位阻原因)。例如：1，2二苯乙烯反式有强烈荧光，而
17、顺式无荧光。1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 1-二甲胺基萘-8-磺酸盐 f0.75 f0.0346取代基作用第一类取代基是给电子基团，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移。如：NH2、OH、OCH3、NHR、CN等。第二类取代基是吸电子基团，会妨碍分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。如：COOH、NO2、CO、NO、SH、NHCOCH3、X(卤素原子序数，荧光效率)等。第三类取代基对电子共轭体系作用较小，对荧光的影响不明显。如：R、SO3H、NH3等。47表苯环上取代基对荧光的影响化合物分子式F/nm相对荧光强度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙
18、基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I-0苯酚C6H5OH285-36518苯酚阴离子C6H5O-310-40010甲氧基苯C6H5OCH3285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺正离子C6H5NH3+-0苯甲酸C6H5COOH310-3903腈基苯C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-048外部因素：外界条件对荧光强度的影响 温度的影响：温度降低会使荧光强度增大；温度升高荧光强度减小。溶剂的影响：溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长长移；
19、溶剂的黏度减小，荧光强度减弱。pH的影响：对于弱酸或弱碱性荧光物质，溶液的pH值改变，影响其解离平衡，使荧光强度发生变化。荧光熄灭的影响：荧光物质与荧光熄灭剂相互作用，引起荧光强度降低。散射光的干扰：瑞利光和拉曼光。2.外部因素49温度温度：T 低，低，f增加。增加。荧光素钠的乙醇溶液荧光素钠的乙醇溶液,T0时时,每降低每降低10,增加增加3%,-80时时=100%.50溶溶剂剂的的极极性性：电电子子激激发发态态比比基基态态的的极极性性大大，溶溶剂剂的的极极性增强，荧光强度增大，荧光波长红移。性增强，荧光强度增大，荧光波长红移。溶剂相对介电常数荧光峰l/nm荧光效率乙腈38.84100.064
20、丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率51pH值影响荧光强度示例 pH值：13存在形式：离子 分子 离子有无荧光：无 蓝色荧光 无52熄灭剂：卤素离子、重金属离子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。瑞利光(Reyleigh scattering light)：光子与分子发生弹性碰撞时，仅改变光子运动方向，不发生能量交换，这种散射光称为瑞利光。特点特点：波长与入射光相同。53拉曼光(Raman scattering light)：光子与物质分子发生非弹性碰撞时，不仅改变光子运动方向，而且发生
21、能量交换，这种散射光称为拉曼光。特点特点：当光子失去部分能量时，波长比入射光长，干扰最大；当光子多得到部分能量时，波长比入射光短。消除方法消除方法：选择适当的激发光波长可消除拉曼光干扰。54例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和散射光谱55320448448360320350400350350激发350nm硫酸奎宁激发320nm硫酸奎宁激发350nm0.1mol/LH2SO4激发320nm0.1mol/LH2SO4强强度度(a)强强度度(b)/nm/nm/nm/nm图11-6 硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和散射光谱56荧光是物质吸收光子之后发出的光，荧光强度(F)与荧光物质吸收光的程
22、度以及发射荧光的能力有关。测试荧光的方向与激发光入射方向垂直，吸收池是四面透光的。荧光分析定量依据：荧光强度F与浓度c成线性关系。第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法57Fc一般当一般当b c 0.05时时,F 与与c呈线性关系呈线性关系 高浓度高浓度时，荧光物质发生时，荧光物质发生自熄灭自熄灭和和自自吸收吸收现象，现象，使使F与与c不呈线性关系不呈线性关系Fc58二、定量分析方法二、定量分析方法1.校正曲线法校正曲线法2.比例法比例法3.联立方程式法联立方程式法591、标准曲线法标准曲线法1）确定确定 ex和和 em(激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱)；2）确定适宜的）确定适宜
23、的条件条件:试剂浓度、试剂浓度、pH、T、t 等；等；3）以标准溶液做）以标准溶液做工作曲线工作曲线；4）测未知样测未知样的荧光强度的荧光强度(F),根据工作曲线计算荧根据工作曲线计算荧光物质的浓度光物质的浓度.602、比例法：若标准曲线通过原点，在线性范围内可采用比例法(只需1个标准溶液)；若标准曲线不通过原点，则应扣除空白溶液的荧光强度后再计算：3、联立方程式法：多组分混合物的荧光分析61第三节第三节 荧光分光光度计及其他荧光分析技术荧光分光光度计及其他荧光分析技术I0ItF氙灯氙灯(或高压汞灯）或高压汞灯）（200-800nm)光电倍增管光电倍增管图图11-7荧光分光光度计示意图荧光分光
24、光度计示意图62荧光仪部件荧光仪部件激发光源激发光源:能够在紫外能够在紫外-可见光区连续发光，可见光区连续发光，常用常用氙灯氙灯、高压汞灯高压汞灯或或激光光源激光光源.样品池样品池:石英池石英池,四壁透明四壁透明.单色器单色器:两个两个光栅单色器光栅单色器,分置于样品池前后分置于样品池前后.检测器检测器:光电池或光电池或光电倍增管光电倍增管,与激发光与激发光成直角的成直角的 方向方向检测荧光检测荧光.63荧光光度计光路图荧光光度计光路图电源电源光度计光度计记录仪记录仪光电倍增管光电倍增管试样液池试样液池光源光源光栅光栅光栅光栅反射镜反射镜反射镜反射镜激发单色器激发单色器发射单色器发射单色器64
25、仪器的校正仪器的校正灵敏度校正灵敏度校正波长校正波长校正激发光谱和荧光光谱校正激发光谱和荧光光谱校正65二、其他荧光分析技术简介（自学）二、其他荧光分析技术简介（自学）激光分析技术时间分辨荧光分析同步荧光分析胶束增敏荧光分析66 荧光光度法的应用荧光光度法的应用生物化学分析，生理医学研究，临床检测生物化学分析，生理医学研究，临床检测.直接测定能产生荧光的物质直接测定能产生荧光的物质.带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸.测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质.荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；荧光生
26、色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光；无机离子（无机离子（Mg2+、Al3+、Zn2+、Be+等）可同试剂形等）可同试剂形成荧光络合物。成荧光络合物。荧光熄灭法测定猝灭剂荧光熄灭法测定猝灭剂 Ni2+对对Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测络合物有荧光猝灭作用，可测Ni2+（610-5 610-3 gmL-1）67举例举例 痕量痕量3,4-苯并芘的测定苯并芘的测定:苯并芘苯并芘萃取（环己酮或石油醚）萃取（环己酮或石油醚）浓缩浓缩层析层析以以H2SO4溶解苯并芘溶解苯并芘荧光分析荧光分析荧光测定：荧光测定：ex=520nm em=
27、545nm68复习复习 分子荧光的发生过程分子荧光的发生过程 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱 荧光光谱的特征荧光光谱的特征 分子结构与荧光的关系分子结构与荧光的关系 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素 荧光定量分析方法。荧光定量分析方法。69课堂复习课堂复习(1)下列叙述中正确的是下列叙述中正确的是()。a.荧光光谱的形状与激发波长无关。荧光光谱的形状与激发波长无关。b.受激分子从激发态的各个振动能级返回至基态时所发出的光称为荧光。受激分子从激发态的各个振动能级返回至基态时所发出的光称为荧光。c.荧光波长短于激发光波长。荧光波长短于激发光波长。d.磷光波长短于荧光波长。磷光波长短于荧光波长。(2)荧光分光光度法是属于荧光分光光度法是属于:（）a.发射光谱法发射光谱法;b.吸收光谱法吸收光谱法;c.拉曼光谱法拉曼光谱法;d.荧光光谱法荧光光谱法;(3)从化合物的分子结构，推断荧光最强的是从化合物的分子结构，推断荧光最强的是:（）a.苯苯b.萘萘 c.1-氯萘氯萘d.蒽蒽(4)荧光定量分析中，测定的是（荧光定量分析中，测定的是（）a.拉曼光拉曼光b.发射光发射光c.瑞丽光瑞丽光d.磷光磷光aadb70作业作业：p-225：1、571结束结束