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1、遗传与育种遗传与育种PPTPPT课件课件理想的工业发酵菌种应符合以下要求：理想的工业发酵菌种应符合以下要求：遗传性状稳定；遗传性状稳定；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；于分离；尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；量并利于分离；培养基成分简单、来源广、价格低廉；培养基成分简单、来源广、价格低廉；对温度、对温
2、度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。微生物的独特生物学特性：微生物的独特生物学特性：（1）个体的体制极其简单；个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4）繁殖速度快；繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环环境境条条件件对对微微生生物物群
3、群体体中中各各个个个个体体作作用用的的直直接接性性和和均一性；均一性；（8）易于形成营养缺陷型；易于形成营养缺陷型；（9）各种微生物一般都有相应的病毒；各种微生物一般都有相应的病毒；（10）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；微微生生物物是是研研究究现现代代遗遗传传学学和和其其它它许许多多主主要要的的生生物物学基本理论问题中最热衷的学基本理论问题中最热衷的研究对象研究对象研究对象研究对象。对对微微生生物物遗遗传传规规律律的的深深入入研研究究，不不仅仅促促进进了了现现现现代代代代分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学和和生生生生物物物物工工工工程
4、程程程学学学学的的发发展展，而而且且为为育育育育种种种种工工工工作作作作提提供供了了丰丰富富的的理理论论基基础础，促促使使育育种种工工作作从从不不自自觉觉到到自自觉觉、从从低低效效到到高高效效、从从随随机机到到定定向向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。研究微生物遗传学的意义研究微生物遗传学的意义遗传与变异的概念遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗遗传传(heredity)：亲亲代代生生物物的的性性状状在在子子代代得得到到表表现现；亲亲代代生生物物传传递递给给子子代代一一套套实实现现与与其其相相同同形形状状
5、的的遗遗传传信信息息。特特点点：具具稳定性。稳定性。遗遗传传型型（genotype）：又又称称基基因因型型，指指某某一一生生物物个个体体所所含含有有的的全部基因的总和；全部基因的总和；-是一种内在可能性或潜力。是一种内在可能性或潜力。遗传型遗传型+环境条件环境条件 表型表型表表型型（phenotype）：指指生生物物体体所所具具有有的的一一切切外外表表特特征征和和内内在在特特性性的的总总和和;-是是一一种种现现实实存存在在，是是具具一一定定遗遗传传型型的的生物在一定条件下所表现出的具体性状。生物在一定条件下所表现出的具体性状。代谢代谢发育发育变变异异(variation):生生物物体体在在外外
6、因因或或内内因因的的作作用用下下，遗遗传传物物质质的的结结构构或或数数量量发发生生改改变变。变变异异的的特特点点：a.a.在在群群体体中中以以极极低低的的几几率率出出现现，（一一般般为为1010-6-61010-10-10）；b.b.形形状状变变化化的的幅度大；幅度大；c.c.变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。饰饰变变（modification）：指指不不涉涉及及遗遗传传物物质质结结构构改改变变而而只只发发生生在在转转录录、转转译译水水平平上上的的表表型型变变化化。特特点点是是：a.几几乎乎整整个个群群体体中中的的每每一一个个个个体体都都发发生生同同样
7、样的的变变化化；b.性性状状变变化化的的幅幅度度小小；c.因因遗遗传传物物质质不不变变，故故饰饰变变是是不不遗遗传传的的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。例如：粘质沙雷氏菌：在例如：粘质沙雷氏菌：在25下培养，产生深红色的灵下培养，产生深红色的灵杆菌素；在杆菌素；在37下培养，不产生色素；如果重新将温度下培养，不产生色素；如果重新将温度降到降到25，又恢复产色素的能力。，又恢复产色素的能力。遗传与变异的概念遗传与变异的概念第一章第一章 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础种种种种质质质质连连连连续续续续理理理理论论论论：18831889年年间间Weiss
8、mann提提出出。认认为为遗遗传传物物质是一种具有特定分子结构的化合物。质是一种具有特定分子结构的化合物。基基基基因因因因学学学学说说说说：1933年年摩摩尔尔根根（Thomas Hunt Morgan）发发现现了了染染色色体体，并并证证明明基基因因在在染染色色体体上上呈呈直直线线排排列列，提提出出了了基基因因学学说说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。但但染染色色体体是是由由核核酸酸和和蛋蛋白白质质两两种种长长链链高高分分子子组组成成。20多多种种氨氨基基酸酸经经过过不不同同排排列列组组合合，可可以以演演变变出出的的蛋蛋白白质质数数目目几几乎乎可可以
9、以达达到到一一个个天天文文数数字字，而而核核酸酸的的组组成成却却简简单单得得多多，一一般般仅仅由由4种种不不同同的的核核苷苷酸酸组组成成，它它们们通通过过排排列列核核组组合合只只能能产产生生较较少少种种类类的的核核酸酸，因因此此当当时时认认为为决决定定生生物物遗遗传传型型的的染染色色体体和和基基因因，其其活性成分是蛋白质。活性成分是蛋白质。DNADNA是是是是遗遗遗遗传传传传变变变变异异异异的的的的物物物物质质质质基基基基础础础础的的的的证证证证明明明明：1944年年以以后后，先先后后有有利利用用微微生生物物为为实实验验对对象象进进行行的的三三个个著著名名实实验验的的论论证证（肺肺炎炎球球菌菌
10、的的转转化化试试验验、噬噬菌菌体体感感染染试试验验、病病毒毒的的拆拆开开与与重重建建试试验验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。l（一）核酸存在的七个水平及质粒（一）核酸存在的七个水平及质粒细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平细胞核水平:原与真核生物的细胞核结构不同，核外原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA染色体水平染色体水平:倍性倍性(真核真核)和染色体数和染色体数核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或或RNA，复合或裸
11、露，双链或单链复合或裸露，双链或单链基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录转录翻译翻译密码子水平：密码子水平：信息单位信息单位,起始和终止起始和终止,核苷酸水平：核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基突变或交换单位，四种碱基一、遗传物质在细胞内的存在部位和方式一、遗传物质在细胞内的存在部位和方式二、原核生物的质粒二、原核生物的质粒定定义义：是是一一类类小小型型闭闭合合环环状状核核外外双双螺螺旋旋DNADNA分分子子，能能独独立立于于细细胞胞核核进进行行自自主主复复制。制。大小：大小：约为约为2100102100106 6D
12、altonDalton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。性质：性质：可可以以在在细细胞胞质质中中独独立立于于染染色色体体之之外外独独立立存存在在（游游离离态态），也也可可以以通通过过交交换换掺入染色体上，以掺入染色体上，以附加体（附加体（episomeepisome）的形式存在；的形式存在；质质粒粒是是一一种种复复制制子子（repliconreplicon），根根据据自自我我复复制制能能力力的的不不同同，可可把把质质粒粒复复制制的的控控制制形形式式分分为为严严紧紧型型和和松松弛弛型型两两种种，严严紧紧型型质质粒粒的的复复制制受受细细胞胞核核控控制制
13、，与与染染色色体体DNADNA复复制制相相伴伴随随,一一般般一一个个寄寄主主细细胞胞内内只只有有少少数数几几个个（1515）个个拷拷贝贝；松松弛弛型型质质粒粒的的复复制制不不受受细细胞胞核核控控制制，在在染染色色体体DNADNA复复制制停停止止的的情情况况下下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到1020010200个或更多。个或更多。可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转
14、移，也可以携带着染色体（片段）一转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。对于细菌的生存并不是必要的对于细菌的生存并不是必要的功能多样化功能多样化二、原核生物的质粒二、原核生物的质粒功能：功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。重组：重组：在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生。在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生。存在范围存在范围：很多细菌如：很多细菌如E.coli、Shigell
15、a、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等、根癌土壤杆菌等制备：制备：包括增殖、裂解细胞、去除包括增殖、裂解细胞、去除RNA和蛋白质等和蛋白质等成分、分离质粒与染色体成分、分离质粒与染色体DNA等步骤。等步骤。鉴定：鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法切图谱等方法二、原核生物的质粒二、原核生物的质粒几种代表性质粒：几种代表性质粒：1.F因因子子（fertility factor）：又又称称致致育育因因子子或或性性因因子子，62106Dalton，94.5kb，相相当当于于核核染染色色体体DNA2%的的
16、环环状状双双链链DNA，足足以以编编码码94个个中中等等大大小小多多肽肽，其其中中1/3基基因因（tra区区）与与接接合合作作用用有有关关。存存在在于于肠肠细细菌菌属属、假假单单胞胞菌菌属属、嗜嗜血血杆杆菌菌、奈奈瑟瑟氏氏球球菌菌、链链球球菌菌等等细细菌菌中中，决决定定性性别。别。最初发现于痢疾志贺氏菌（最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发），后来发现还存在于现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和和Staphylococcus中。中。R因子由相连的两个因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子片段组成，
17、即抗性转移因子（resistence transfor factor，RTF）和抗性决定和抗性决定R因子因子（r-determinant），），RTF为分子量约为为分子量约为11106Dalton，控制质粒控制质粒copy数及复制，转移。抗性决定因子大小不固数及复制，转移。抗性决定因子大小不固定，从几百万到定，从几百万到100106Dalton以上，其上带有其它抗生以上，其上带有其它抗生素的抗性基因。素的抗性基因。R-因子在细胞内的因子在细胞内的copy数可从数可从12个到几十个，分为严个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质
18、粒可达20003000个个/细胞。细胞。2.R因子（因子（resistence factor）细菌素细菌素产大肠杆菌素因子。产大肠杆菌素因子。大大肠肠杆杆菌菌素素是是由由E.coli的的某某些些菌菌株株所所分分泌泌的的细细菌菌素素，能能通通过过抑抑制制复复制制、转转录录、转转译译或或能能量量代代谢谢等等而而专专一一地地杀杀死死其其它它肠肠道道细细菌菌。其其分分子子量量约约41048104Dalton。大肠杆菌素都是由。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。因子编码的。Col因子可分为两类，分别以因子可分为两类，分别以ColE1和和ColIb为代表。为代表。ColE1分分子子量量约约为为5106Da
19、lton，无无接接合合作作用用，是是多多copy的的；ColE1研研究究得得很很多多，并并被被广广泛泛地地用用于于重重组组DNA 的的研研究究和和用用于于体体外外复复制制系统上。系统上。ColIb分分子子量量约约为为80106Dalton，它它与与F因因子子相相似似，具具有有通通过过接接合合作作用用转移的功能，属于严紧型控制，只有转移的功能，属于严紧型控制，只有12个个copy。凡凡带带Col因因子子的的菌菌株株，由由于于质质粒粒本本身身编编码码一一种种免免疫疫蛋蛋白白，从从而而对对大大肠肠杆杆菌素有免疫作用，不受其伤害。菌素有免疫作用，不受其伤害。3.Col因子因子（colicinogeni
20、c factor）v降解性质粒降解性质粒只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解解CAMCAM（樟脑）质粒，樟脑）质粒，XYLXYL（二甲苯）质粒，二甲苯）质粒，SALSAL（水杨酸）质粒，水杨酸）质粒，MDLMDL（扁桃酸）质粒，扁桃酸）质粒，NAPNAP（奈）质粒和奈）质粒和TOLTOL（甲苯）质粒等。甲苯）质粒等。4.降解性质
21、粒降解性质粒即诱癌质粒。即诱癌质粒。存存在在于于根根癌癌土土壤壤杆杆菌菌（Agrobacterium tumefaciens）中中,可可引引起起许许多多双双子叶植物的根癌子叶植物的根癌。当当细细菌菌侵侵入入植植物物细细胞胞中中后后，在在其其细细胞胞中中溶溶解解，把把细细菌菌的的DNA释释放放到到植植物物细细胞胞中中。这这时时，含含有有复复制制基基因因的的Ti质质粒粒的的小小片片段段与与植植物物细细胞胞中中的的核核染染色色体体发发生生整整合合，破破坏坏控控制制细细胞胞分分裂裂的的激激素素调调节节系系统统，从从而而使使它转变成癌细胞。它转变成癌细胞。Ti质质粒粒长长200kb，是是一一个个大大型型
22、质质粒粒。当当前前，Ti质质粒粒已已成成为为植植物物遗遗传传工工程程研研究究中中的的重重要要载载体体。一一些些具具有有重重要要性性状状的的外外源源基基因因可可借借DNA重重组组技技术术设设法法插插入入到到Ti质质粒粒中中，并并进进一一步步使使之之整整合合到到植植物物染染色色体体上上，以以改改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。5.Ti质粒质粒（tumor inducing plasmid）是是近近年年来来在在Rhizobium（根根瘤瘤菌菌属属）中中发发现现的的一一种种质质粒粒，分分子子量量为为200300106Dalton，比比一一般般
23、质质粒粒大大几几十十倍倍到到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。6.6.巨大质粒巨大质粒（mega质粒）质粒）第二章第二章 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种突变（突变（突变（突变（mutationmutation ）：）：）：）：指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。染色体畸变染色体畸变细胞学上可以看到染色体的变化细胞学上可以看到染色体的变化突变突变 基因突变基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化细胞学上看不到遗传物质的变化突变体（突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株：发生了突变的微生物
24、细胞或菌株野野生生型型（wild type）：从从自自然然界界分分离离到到的的任任何何微微生生物物在在其其发发生生突突变变前前的的原原始菌株始菌株依表型的改变分为：依表型的改变分为：形态突变型形态突变型个体和菌落形态的变异个体和菌落形态的变异营营养养缺缺陷陷型型因因突突变变而而丧丧失失产产生生某某种种生生物物合合成成酶酶的的能能力力，并并因因而而成成为为必必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。发酵突变型发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型抗性突变型抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的
25、抗性因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性条条件件致致死死突突变变型型突突变变后后在在某某种种条条件件下下可可正正常常生生长长繁繁殖殖，而而在在另另一一条条件件下却无法生长繁殖的突变型下却无法生长繁殖的突变型抗原突变型抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变因突变而引起的抗原结构发生改变产量突变型产量突变型 （一）基因突变的类型（一）基因突变的类型按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（选择性突变株（selective mutant）：）：具有选择标记（如营养具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型）
26、，只要选择适当的缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分值等，就比较容易检出和分离到。离到。非选择性突变株（非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。定义：定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突突变变率率为为10108 8
27、是是指指该该细细胞胞在在一一亿亿次次细细胞胞分分裂裂中中，会会发发生生一一次次突突变变。突突变变率率也也可可以以用用每每一一单单位位群群体体在在每每一一世世代代中中产产生生突突变变株株（mutantmutant，即即突突变变型型）的的数数目目来来表表示示。如如一一个个含含10108 8个个细细胞胞的的群群体体，当当其其分分裂裂为为2102108 8个个细细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是10108 8 。突变率突变率=突变细胞数突变细胞数/分裂前群体细胞数分裂前群体细胞数突突变变是是独独独独立立立立的的的的。某某一一基基因因发发生生突突变变不不不不会
28、会会会影影影影响响响响其其其其它它它它基基基基因因因因的的突突变变率率。在在同同一一个个细细胞胞中中同同时时发发生生两两个个基基因因突突变变的的几几率率是是极极低低的的，因因为为双双重重突突变变型型的的几几率只是各个突变几率的乘积。率只是各个突变几率的乘积。由由于于突突变变的的几几率率一一般般都都极极低低，因因此此，必必须须采采用用特特殊殊手手段段筛筛选选突突变变株株加加以以确确定。定。（二）突变率（二）突变率若干细菌某一性状的自发突变率若干细菌某一性状的自发突变率菌菌 名名 突变性状突变性状突变率突变率E.coliE.coli抗抗T1T1噬菌体噬菌体3 103 108 8E.coliE.co
29、li抗抗T3T3噬菌体噬菌体1 101 107 7 E.coliE.coli不发酵乳糖不发酵乳糖1 101 101010E.coliE.coli 抗紫外线抗紫外线1 101 105 5Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus 抗青霉素抗青霉素1 101 107 7S.aureusS.aureus 抗链霉素抗链霉素1 101 109 9 Salmonella typhiSalmonella typhi抗抗2525 g/Lg/L链霉素链霉素1 101 106 6 Bacillus megateriumBacillus megaterium 抗异烟肼抗异烟
30、肼5 105 105 5 （三）突变的特点（三）突变的特点适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。不对应性不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性稀有性：突变率低且稳定。：突变率低且稳定。独立性独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性可诱发性：诱变剂可提高突变率。：诱变剂可提高突变率。稳定性稳定性：变异性状稳定可遗传。：变异性状稳定可遗传。可逆性可逆性：
31、从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（变（forward mutation），），从突变株回到野生型的从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（过程则称为回复突变或回变（back mutation或或reverse mutation）。）。（四）基因突变的自发性和不对应性的证明（四）基因突变的自发性和不对应性的证明在在各各种种基基因因突突变变中中，抗抗性性突突变变最最为为常常见见。但但在在过过去去相相当当长长时时间间内内对对这这种种抗抗性产生的原因争论十分激烈。性产生的原因争论十分激烈。一一种种观观点点认认为为，突突变变是是通通过过适适应
32、应而而发发生生的的，即即各各种种抗抗性性是是由由其其环环境境（指指其其中中所所含含的的抵抵抗抗对对象象）诱诱发发出出来来的的，突突变变的的原原因因和和突突变变的的性性状状间间是是相相对对应应的的，并认为这就是并认为这就是“定向变异定向变异”，也有人称它为，也有人称它为“驯化驯化”或或“驯养驯养”。另另一一种种看看法法则则认认为为，基基因因突突变变是是自自发发的的，且且与与环环境境是是不不相相对对的的。由由于于其其中中有有自自发发突突变变、诱诱发发突突变变、诱诱变变剂剂与与选选择择条条件件等等多多种种因因素素错错综综在在一一起起，所所以以难难以探究问题的实质。以探究问题的实质。从从1943194
33、3年年起起，经经过过几几个个严严密密而而巧巧妙妙的的实实验验设设计计，主主要要攻攻克克了了检检出出在在接接触触抗抗性性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。变变量量试试验验又又称称波波动动试试验验或彷徨试验。或彷徨试验。19431943年年，S.S.E.E.Luria Luria 和和M.M.Delbrck Delbrck 根根据据统统计计学学原原理理，设设计计了了左左方方的的实实验。验。1.变量试验变量试验fluctuation test2.涂布试验原原理理与与变变量量试试验验相相同同，方方法法更更为为简简便便，且且可可计计算
34、算突突变变率率。涂布试验中突变率的计算涂布试验中突变率的计算初始接种量：初始接种量：5 105 104 4 个个/皿皿培养培养5 5小时，繁殖了小时，繁殖了12.312.3代，每个微菌落约含代，每个微菌落约含51005100个细菌个细菌这时，每个平皿上的细胞数为：这时，每个平皿上的细胞数为：5100 5 105100 5 104 4 2.6 10 2.6 108 8个个/皿皿在在6 6个平板上，比接种时增加的细胞数为：个平板上，比接种时增加的细胞数为：6 6（2.6 102.6 108 8 5 5 10 104 4）=15.6 10=15.6 108 8在未涂布的平板上共发现在未涂布的平板上共
35、发现2828个突变，故个突变，故突变率突变率=28/15.6 10=28/15.6 108 8=1.8 10=1.8 10 8 83.平板影印培养试验（平板影印培养试验（replica plating）19521952年年，J.J.LederbergLederberg夫夫妇妇的的论论文文平平板板影影印印培培养养法法和和细细菌菌突突变变株株的的间间接接选选择择，更更好好地地证证明明了了微微生生物物的的抗抗药药性性是是在在未未接接触触药药物物前前自自发发地地产产生生的的，这一突变与相应药物环境毫不相干。这一突变与相应药物环境毫不相干。平平板板影影印印培培养养法法，是是一一种种能能达达到到在在一一系
36、系列列培培养养皿皿的的相相同同位位置置上上出出现现相相同同遗遗传传型型菌菌落落的的接接种种培培养养方方法法：把把长长有有许许多多菌菌落落的的母母种种培培养养皿皿倒倒置置于于包包有有灭灭菌菌丝丝绒绒布布的的木木质质圆圆柱柱印印章章上上，使使其其沾沾上上来来自自平平板板上上的的菌菌落落。然然后后可可把把这这一一“印印章章”上上的的菌菌落落一一一一接接种种到到不不同同的的选选择择性性培培养养基基平平板板上上。待待这这些些平平板板培培养养后后，对对各各平平板板相相同同位位置置上上的的菌菌落落作作对对比比后后，就就可可选选出出适适当当的的突突变变型型菌菌株株。据据报报道道，用用此此法法可可把把母母平平板
37、板上上1020%1020%量量的的细细菌菌转转移移到到丝丝绒绒布布上上，并并可可利利用用这这一一“印印章章”接接种种8 8个个子子培培养养皿皿。因因此此，通通过过影影印印培培养养法法，就就可可以以从从从从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变株。在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变株。平平板板影影印印培培养养法法在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用
38、。作用。平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会。种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会。（五）基因突变的机制（五）基因突变的机制基基因因突突变变的的原原因因是是多多种种多多样样的的，可可以以是是自自发发的的或或诱诱发发的的，诱诱变变又又可可分分为为点点突变和畸变。具体类型突变和畸变。具体类型可归纳如下：可归纳如下：1.诱变机制诱变机制诱诱变变剂剂（mutagenmutagen）：凡凡能能提提高高突突变变率率的的任任何何理理化因子，就称为诱变剂化因子，就称为诱变剂种种类
39、类：诱诱变变剂剂的的种种类类很很多多，作作用用方方式式多多样样。即即使使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。按按照照遗遗传传物物质质结结构构变变化化的的特特点点讨讨论论几几种种有有代代表表性性的诱变剂的作用机制。的诱变剂的作用机制。（1）碱基置换（）碱基置换（substitution）定定 义义：对对 DNADNA来来 说说，碱碱 基基 的的 置置 换换 属属 于于 一一 种种 染染 色色 体体 的的 微微 小小 损损 伤伤（microlesionmicrolesion），一一般般也也称称点点突突变变（point point mutationmutation
40、）。它它只只涉涉及及一一对碱基被另一对碱基所置换。对碱基被另一对碱基所置换。分分类类：转转换换（transitiontransition），即即DNADNA链链中中的的一一个个嘌嘌呤呤被被另另一一个个嘌嘌呤呤或或是是一一个个嘧啶被另一个嘧啶所置换；嘧啶被另一个嘧啶所置换；颠颠换换（transversiontransversion），即即一一个个嘌嘌呤呤被被一一个个嘧嘧啶啶,或或是是一一个个嘧嘧啶啶被被一个嘌呤所置换。一个嘌呤所置换。对某一具体诱变剂来对某一具体诱变剂来说，即可同时引起转说，即可同时引起转换与颠换，也可只具换与颠换，也可只具其中的一种功能。根其中的一种功能。根据化学诱变剂是据化学
41、诱变剂是直接直接还是还是间接间接地引起置换，地引起置换，可把置换的机制分成可把置换的机制分成以下两类来讨论。以下两类来讨论。直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂定定义义：一一类类可可直直接接与与核核酸酸的的碱碱基基发发生生化化学学反反应应的的诱诱变变剂剂，不不论论在在机机体体内内或是在离体条件下均有作用。或是在离体条件下均有作用。种种类类：很很多多。例例如如亚亚硝硝酸酸、羟羟胺胺和和各各种种烷烷化化剂剂（硫硫酸酸二二乙乙酯酯，甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯，N-甲甲基基-N硝硝基基-N-亚亚硝硝基基胍胍，N-甲甲基基-N-亚亚硝硝基基脲脲，乙乙烯烯亚亚胺胺，环氧乙酸，氮芥等）。环氧乙酸，氮芥等）
42、。作作用用：它它们们可可与与一一个个或或几几个个核核苷苷酸酸发发生生化化学学反反应应，从从而而引引起起DNA复复制制时时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。羟胺只引起羟胺只引起G CA:T，其余都是可使其余都是可使G C=A:T发生互变的。发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有.亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。HNO2胞嘧啶（胞嘧啶（C）尿嘧啶（尿嘧啶（U）HNO2腺嘌呤（腺嘌呤（A）次黄嘌呤（次黄嘌呤（H）HNO2鸟嘌呤（鸟嘌呤（G）黄嘌呤（黄嘌呤（X
43、）这些反应及形成物均可在这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。主要是使碱基对发生转换。碱基转换的分子机制碱基转换的分子机制以亚硝酸为例以亚硝酸为例 腺嘌呤（腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（）变成次黄嘌呤（H）后引起的转换过程：）后引起的转换过程：腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（He）He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK）DNA复制时，复制时，HK 与胞嘧啶（与胞嘧啶（C）配对配对 DNA第二次复制时，第二次复制时，C与与G正常配对，实现了转换。正常配对，实现了转换。亚硝酸引起
44、的亚硝酸引起的AT-GC转换细节转换细节这类诱变剂主要是一些这类诱变剂主要是一些碱基碱基类类似物似物,如：如：5-溴尿嘧溴尿嘧啶啶(5-BU)和和5-氨基尿嘧啶（氨基尿嘧啶（5AU）、）、叠氮胸腺叠氮胸腺嘧啶嘧啶（AIT）等）等等等；作用方式作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，分子中，主要是在主要是在DNA复制复制时时碱基碱基类类似物插入似物插入DNA中，中，引起碱基引起碱基对配对错误，造成碱基置换。对配对错误，造成碱基置换。以以5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶(5-BU)为例：为例：5-BU是胸腺嘧啶（是胸腺嘧啶（T）的）的的的类类似物似物，酮式的，酮式的5-BU
45、可以和可以和A配对，烯醇式的配对，烯醇式的5-BU可以和可以和G配对，在配对，在DNA分子复制的过程中，由于分子复制的过程中，由于5-BU的的插入和互变异构导致碱基置换。插入和互变异构导致碱基置换。间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂5-BU引起的转换引起的转换5-BU引起的转换引起的转换从从上上图图中中，还还可可以以看看到到5-BU的的掺掺入入引引起起的的G C回回复复到到AT的的过过程程。通通过过这这两两个个图图示示，就就很很容容易易理理解解为为什什么么同同一一种种诱诱变变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。也也可可以以知
46、知道道，为为什什么么像像5-BU这这类类代代谢谢类类似似物物只只有有对对正正在在进进行行新新陈陈代代谢谢和和繁繁殖殖着着的的微微生生物物才才起起作作用用，而而对对休休止止细细胞胞、游游离的噬菌体粒子或离体的离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。分子却不起作用。（2）移码突变）移码突变frame-shift mutation 或或 phase-shift mutation，指指诱诱变变剂剂使使DNA分分子子中中增增加加（插插入入）或或缺缺失失一一个个或或少少数数几几个个核核苷苷酸酸，从从而而使使该该部部位位后后面面的的全全部部遗遗传传密密码码发发生生转转录录和和转转译译错错误误的的一类突变
47、。一类突变。由由移移码码突突变变所所产产生生的的突突变变株株，称称为为移移移移码码码码突突突突变变变变株株株株（frame-shift mutant）。与与染染色色体体畸畸变变相相比比，移移码码突突变变也也只只能能算算是是DNA分子的微小损伤。分子的微小损伤。丫丫啶啶类类染染料料，包包括括原原黄黄素素、丫丫啶啶黄黄、丫丫啶啶橙橙和和-氨氨基基丫丫啶啶等等，以以及及一一系系列列称称为为ICR类类的的化化合合物物，都都是是移移码码突突变变的的有有效效诱诱变剂。变剂。图图8-14能诱发移码突变的几种代表性化合物能诱发移码突变的几种代表性化合物引起移码突变的诱变剂：主要是吖啶类染料，如吖啶引起移码突变
48、的诱变剂：主要是吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等等。黄、吖啶橙等等。这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一个嘌呤个嘌呤嘧啶对十分相似。嘧啶对十分相似。丫啶类化合物的诱变机制：丫啶类化合物的诱变机制：至今还不很清楚。至今还不很清楚。有有人人认认为为，由由于于它它们们是是一一种种平平面面型型三三环环分分子子，结结构构与与一一个个嘌嘌呤呤嘧嘧啶啶对对对对十十分分相相似似，故故能能嵌嵌入入两两个个相相邻邻DNADNA碱碱基基对对之之间间，造造成成双双螺螺旋旋的的部部分分解解开开（两两个个碱碱基基对对原原来来相相距距0.34nm0.34nm，当当嵌嵌入
49、入一一个个丫丫啶啶分分子子时时，就就变变成成0.68nm0.68nm），从从而而在在DNADNA复复制制过过程程中中，会会使使链链上上增增添添或或缺缺失失一一个个碱碱基基，结果就引起了移码突变。结果就引起了移码突变。丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：（3）染色体畸变（）染色体畸变（chromosomal aberration）某某些些理理化化因因子子，如如X X射射线线等等的的辐辐射射及及烷烷化化剂剂、亚亚硝硝酸酸等等，除除 了了 能能 引引 起起 点点 突突 变变 外外，还还 会会 引引 起起 DNADNA的的 大大 损损 伤伤（macr
50、olesionmacrolesion）染色体畸变，它包括：染色体畸变，它包括：染色体结构上的变化：染色体结构上的变化：缺失（缺失（deletiondeletion）重复（重复（duplicationduplication）易位（易位（translocationtranslocation）倒位（倒位（inversioninversion）染色体数目的变化染色体数目的变化染色体结构上的变化染色体结构上的变化分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。染色体内畸变染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变化，：只涉及一条染色体上的变化，如如发发生生染染色色体体的的部部分分缺缺失