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1、微生物技术应用微生物技术应用环境生物学技术(3)主要内容主要内容固定化微生物技术固定化微生物技术微生物制剂微生物制剂微生物细胞外多聚物微生物细胞外多聚物环境生物学技术(3)环境生物学技术(3)环境生物学技术(3)环境生物学技术(3)环境生物学技术(3)目目 录录环境生物学技术(3)酶的固定化 通过某些物理或化学方法处理，使酶变成通过某些物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失（即运动受到限制）而又能发不易随水流失（即运动受到限制）而又能发挥高效催化作用的酶制剂，这一过程称为酶挥高效催化作用的酶制剂，这一过程称为酶的固定化。的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也固定化所采用的酶，可以是纯
2、化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。的酶或酶系。环境生物学技术(3)酶的分离纯化环境生物学技术(3)酶的来源尽管可以从几乎所有生物体提取到活性酶，但目前产业化的固定化酶主要来源于微生物，其中真菌约50%，细菌约1/3，动物约8%，植物约4%。一方面是因为微生物酶更廉价，更容易扩增并定量；同时也因为动植物组织可能含有潜在的有害成分。环境生物学技术(3)Enzyme ECEnzyme ECSourcesSourcesApplicationApplicationa a-Amylase-Amylase3.2.1.13.2.1.1Asperg
3、illusAspergillusE EBakingBakingCatalaseCatalase1.11.1.61.11.1.6AspergillusAspergillusI IFoodFoodCellulaseCellulase3.2.1.43.2.1.4TrichodermaTrichodermaE EWasteWasteDextranaseDextranase3.2.1.113.2.1.11PenicilliumPenicilliumE EFoodFoodGlucose oxidaseGlucose oxidase1.1.3.41.1.3.4AspergillusAspergillusI
4、IFoodFoodLactaseLactase3.2.1.233.2.1.23AspergillusAspergillusE EDairyDairyLipaseLipase3.1.1.33.1.1.3RhizopusRhizopusE EFoodFoodRennetRennet3.4.23.63.4.23.6Mucor Mucor mieheimieheiE ECheeseCheesePectinasePectinase3.2.1.153.2.1.15AspergillusAspergillusE EDrinksDrinksProteaseProtease3.4.23.63.4.23.6Asp
5、ergillusAspergillusE EBakingBakingE:extracellular enzyme;I:intracellular enzymeFungal Enzymes环境生物学技术(3)EnzymeEnzymeSourcesSourcesApplicationApplicationa a-Amylase-Amylase3.2.1.13.2.1.1BacillusBacillusE EStarchStarchb b-Amylase-Amylase3.2.1.23.2.1.2BacillusBacillusE EStarchStarchAsparaginaseAsparagin
6、ase3.5.1.13.5.1.1Escherichia Escherichia colicoliI IHealthHealthGlucose Glucose isomeraseisomerase5.3.1.55.3.1.5BacillusBacillusI IFructose Fructose syrupsyrupPenicillin Penicillin amidaseamidase3.5.1.113.5.1.11BacillusBacillusI IPharmacePharmaceuticaluticalProteaseProtease3.4.21.143.4.21.14Bacillus
7、BacillusE EDetergentDetergentBacterial EnzymesE:extracellular enzyme;I:intracellular enzyme环境生物学技术(3)酶的固定化方法吸附法吸附法：通过通过通过通过氢键、疏水作用和氢键、疏水作用和氢键、疏水作用和氢键、疏水作用和电子亲和力电子亲和力电子亲和力电子亲和力等物等物等物等物理作用，将酶固定于水不溶多孔载体上理作用，将酶固定于水不溶多孔载体上理作用，将酶固定于水不溶多孔载体上理作用，将酶固定于水不溶多孔载体上包埋法包埋法：将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于：将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于：将聚合物
8、的单体与酶溶液混合，再借助于：将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂聚合助进剂聚合助进剂聚合助进剂(包括交联剂包括交联剂包括交联剂包括交联剂)的作用进行的作用进行的作用进行的作用进行聚合聚合聚合聚合，酶被，酶被，酶被，酶被包埋包埋包埋包埋在聚合物；在聚合物；在聚合物；在聚合物；结合法结合法：选择适宜的载体，使之通过：选择适宜的载体，使之通过：选择适宜的载体，使之通过：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子共价键或离子共价键或离子共价键或离子键与酶蛋白侧链基团结合键与酶蛋白侧链基团结合键与酶蛋白侧链基团结合键与酶蛋白侧链基团结合而制成固定化酶；而制成固定化酶；而制成固定化酶；而制成固定化酶
9、；交联法交联法：借助双功能试剂使：借助双功能试剂使：借助双功能试剂使：借助双功能试剂使酶分子之间或酶与载体酶分子之间或酶与载体酶分子之间或酶与载体酶分子之间或酶与载体间间间间发生交联作用而制成固定化酶；发生交联作用而制成固定化酶；发生交联作用而制成固定化酶；发生交联作用而制成固定化酶；热处理法热处理法：将含酶细胞在一定的温度下加热一段时：将含酶细胞在一定的温度下加热一段时：将含酶细胞在一定的温度下加热一段时：将含酶细胞在一定的温度下加热一段时间，使间，使间，使间，使酶固定在菌体酶固定在菌体酶固定在菌体酶固定在菌体内。内。内。内。环境生物学技术(3)固定化方法固定化方法固定化方法固定化方法 酶和
10、细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法 载体结合法载体结合法载体结合法载体结合法载体结合法载体结合法 交联法交联法交联法交联法交联法交联法 包埋法包埋法包埋法包埋法包埋法包埋法 网格型网格型网格型网格型网格型网格型 微囊型微囊型微囊型微囊型微囊型微囊型物理吸附法物理吸附法物理吸附法物理吸附法物理吸附法物理吸附法 离子结合法离子结合法离子结合法离子结合法离子结合法离子结合法 共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法 热处理（细胞）热处理（细胞）热处理（细胞）热处理（细胞）热处理（细胞）热处理（细胞）环境生物学技
11、术(3)吸附法（adsorption）常用有机载体 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、蔗渣等常用无机载体 氧化铝、硅藻土、沸石、高岭土、多孔玻璃、硅胶等环境生物学技术(3)影响吸附法固定酶稳定性的因素介质中离子强度 盐析pH 电荷温度 热运动蛋白质浓度 交换载体的性质 表面特性环境生物学技术(3)吸附法的特点吸附法的优点：吸附法的优点：吸附法的优点：吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型操作简单，可供选择的载体类型操作简单，可供选择的载体类型操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所
12、多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。吸附法的缺点：吸附法的缺点：吸附法的缺点：吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落，酶和载体的结合力不强，易脱落，酶和载体的结合力不强，易脱落，酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。世界第一例获得工业应用的固定化酶是世界第一例获得工业应用的固定
13、化酶是世界第一例获得工业应用的固定化酶是世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAE-DEAE-DEAE-DEAE-Sephadex A-25Sephadex A-25Sephadex A-25Sephadex A-25吸附的吸附的吸附的吸附的氨基酰化酶氨基酰化酶氨基酰化酶氨基酰化酶反应用于反应用于反应用于反应用于DL-AADL-AADL-AADL-AA的光学分析。的光学分析。的光学分析。的光学分析。环境生物学技术(3)包埋法(entrapment)凝胶包埋法 将酶分子包埋在凝胶格子中将酶分子包埋在凝胶格子中 聚合包埋聚合包埋 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 络合包埋络合包埋 胶原、海藻酸钠胶原、海藻酸
14、钠 凝结包埋凝结包埋 明胶、卡拉胶、淀粉、明胶、卡拉胶、淀粉、微囊法 包埋于半透性聚合物膜的微囊内 界面沉淀界面沉淀 高聚物在水和有机相界面上溶解度较低高聚物在水和有机相界面上溶解度较低 界面聚合界面聚合 液体干燥法液体干燥法 脂质体包埋脂质体包埋环境生物学技术(3)包埋法的特点 包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。环境生物学技术(3)共价结合法(Covalent)理
15、论上酶蛋白上可供载体结合的功能基团有：酶蛋白N-端的M-氨基或赖氨酸残基的-氨基；酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的-羧基和Glu残基-羧基；Cys残基的巯基；Ser、Tyr、Thr残基的羟基；Phe和Tyr残基的苯环；His残基的咪唑基；Trp残基的吲哚基。最普遍的基团是：氨基氨基、羧基羧基以及苯环苯环，且被偶联的基团应是酶活性的非必需基团非必需基团环境生物学技术(3)共价结合的影响因素载体载体载体载体的物化性质要求的物化性质要求的物化性质要求的物化性质要求载体载体载体载体亲水亲水亲水亲水，并且有一定的，并且有一定的，并且有一定的，并且有一定的机机机机械强度械强度械强度械强度和和和和稳定性稳
16、定性稳定性稳定性，同时具备在温和条件下与酶结，同时具备在温和条件下与酶结，同时具备在温和条件下与酶结，同时具备在温和条件下与酶结合的合的合的合的功能基团功能基团功能基团功能基团；偶联反应的偶联反应的偶联反应的偶联反应的反应条件反应条件反应条件反应条件必须在必须在必须在必须在温和温和温和温和pHpH、中等离子强中等离子强中等离子强中等离子强度度度度和和和和低温低温低温低温的缓冲溶液中；的缓冲溶液中；的缓冲溶液中；的缓冲溶液中；所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团
17、基团基团基团副反应尽可能少副反应尽可能少副反应尽可能少副反应尽可能少；要考虑到酶固定化后的要考虑到酶固定化后的要考虑到酶固定化后的要考虑到酶固定化后的构型构型构型构型，尽量减少载体的，尽量减少载体的，尽量减少载体的，尽量减少载体的空空空空间位阻间位阻间位阻间位阻对酶活力的影响。对酶活力的影响。对酶活力的影响。对酶活力的影响。环境生物学技术(3)共价载体的选择一般而言，亲水载体在蛋白质结合量和固一般而言，亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体；定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体；载体结构疏松，表面积大，有一定的机械载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度；强度；载体必须
18、有在温和条件与酶共价结合的功载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团；能基团；载体没有或很少有非专一性吸附；载体没有或很少有非专一性吸附；载体来源广泛，廉价并能反复使用。载体来源广泛，廉价并能反复使用。环境生物学技术(3)共价偶联法的优缺点共价偶联法的优点共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用牢固、稳定性好、利于连续使用共价偶联法的缺点共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，：载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶
19、的空间构象，从而对酶的催化会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。活性产生影响。环境生物学技术(3)形成共价结合的偶联类型重氮法重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8-9)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。卤代烃烷基化反应卤代烃烷基化反应 具有卤素取代的芳香环或含有卤素取代的杂环的高聚物以及含有卤乙酰基的高聚物，可以通过烷基化、芳香基化，在碱性条件下，与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反应。环境生物学技术(3)重氮法-1 多糖类的芳香族氨基衍生物 在碱性条件下用对-硫酸脂乙砜基胺多糖，制得的醚键连接的乙砜基苯胺衍生物，经重
20、氮化后偶联酶；环境生物学技术(3)重氮法-2氨基酸共聚体氨基酸共聚体 共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐，共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐，可供酶固定用。蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等可供酶固定用。蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等环境生物学技术(3)重氮法-3 聚丙烯酰胺衍生物 EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，经重氮化可固定酶；氨基酰化酶，淀粉酶等。环境生物学技术(3)重氮法-4 苯乙酰树脂 聚氨基苯乙烯(a)和一种异丁烯一间一氨基苯乙烯(b)的共聚物，通过重氮化后可固定酶；胃蛋白酶、核糖核酸酶等。环境生物学技术(3)重氮法-5 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理
21、使之酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成叠氮衍生物。环境生物学技术(3)重氮法-6 多孔玻璃的氨基硅烷衍生物 多孔玻璃在丙酮中与Y氨基丙基三氧乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃；用对硝基苯酚氯处理后，再还原，转变为芳香基衍生物；此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合，产生固定化酶。环境生物学技术(3)卤代烃烷基化-1 将纤维素在二恶烷(Diaxanc)-溴乙酸中与嗅乙酰溴反应，形成溴乙酰纤维素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化；常用载休有卤乙酰、卤异丁烯衍生物，如氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维索、碘乙酰纤维素等。环境生物学技术(3)卤代烃烷基化-2纤维素等载体在碱性条件下和均三氯
22、三嗪等反应，引入活泼的卤素基后，能与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化酶与纤维素共价结合的另一类芳香烃化功能基是3-F-4,6-二硝基苯。控制pH7，使它与酶分子的氨基反应，产生固定化酶。环境生物学技术(3)卤代烃烷基化-3 四元缩合反应 利用四元化合物(羧酸、胺、醛和异氰酸)发生缩合反应，形成N取代的酰胺；羧酸(R1)和胺化合物(R2)形成酰胺键，醛(R3)和异氰酸(R4)结合形成酰胺氮的侧链。当选择适当条件，适当的载体及控制反应液中的添加物，可以使连接键或通过酶的氨基或通过羧基，将酶固定并免除有害反应。环境生物学技术(3)卤代烃烷基化-4巯基-二硫基交换反应 带有-SH或二硫基的载体，
23、通过巯基-二硫基的交换反应，和酶分子上非必需巯基偶联。若载体的功能基团为-SH时，可先用2,2-二吡啶二硫化物处理，生成的二硫基中间产物在酸性条件下能与酶分子的巯基发生交换反应，从而产生固定化酶。环境生物学技术(3)卤代烃烷基化-5金属偶联法 利用某些过渡金属盐溶液将载体(纤维素、尼龙、硼硅玻璃、滤纸及酵母细胞等)浸泡24h，洗除末反应的金属盐后，制得的活化载体放入酶溶液中，即可将酶固定化。环境生物学技术(3)芳香烃化-6 溴化氰-亚胺碳酸基反应 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下，载体的羟基与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联固定。环境
24、生物学技术(3)芳香烃化-7 酰氯化反应 含羧基载体如羧基树脂(Amberlite IRC-50等)，可用氯化亚砜处理，生成酰氯衍生物，与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。环境生物学技术(3)缩合法 缩合反应 一些带羧基或氨基的载体用羰二亚胺活化后，与酶分子的氨基或羧基直接偶联，形成肽键，产生固定化酶。环境生物学技术(3)芳香氨异硫氰反应含有芳香氨基的载体，在碱性PH条件下，与光气或硫芥子气反应生成异硫氰酸或异琉氰酸衍生物，可在温和条件下与酶分子的氨基连接，产生固定化酶。环境生物学技术(3)酸酐反应乙烯或苯乙烯、甲代乙烯基与顺丁烯二酸酐的共聚物，在己二胺作用下，酸酐与酶蛋白的氨基起偶联反应，产生
25、固定化酶。环境生物学技术(3)活化酯法含羧基的共聚物载体在二环己基碳二亚胺(DDC)存在下用N羟基琥珀酰亚胺活化，产生活化酯，再在温和条件下连接酶。环境生物学技术(3)含醛基高聚物多糖类如淀粉、葡聚糖、纤维素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每一葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶。环境生物学技术(3)交联法交联法基本原理是基本原理是酶分子和多功能试剂之间酶分子和多功能试剂之间形成形成共价键得到三维的交联网状结构；共价键得到三维的交联网状结构；交联法是利用交联法是利用双功能或多功能试剂双功能或多功能试剂在在酶分酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载子间
26、、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体体间进行交联反应，把酶蛋白分子彼此交间进行交联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。常用的交联试剂是常用的交联试剂是戊二醛戊二醛和和双耦联苯胺双耦联苯胺-2,2-二磺酸，二磺酸，常与常与吸附法吸附法或或包埋法包埋法配合使配合使用用环境生物学技术(3)交联法的类型交联法的类型交联酶法交联酶法 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶；酶与辅助蛋白交联法酶与辅助蛋白交联法 用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联；吸附交联法吸附交联法 将酶吸附载体上，再用戊二醛等双功能试剂交联；载
27、体交联法载体交联法 用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法；环境生物学技术(3)交联法的优缺点用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。但由于交联反应较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大；且交联剂的成本较高，实际使用时，往往与其他固定化方法联用，如将酶先经凝胶包埋后，再经交联等。环境生物学技术(3)固定化酶制备方法的特点固定化酶制备方法的特点物理吸附物理吸附物理吸附物理吸附包埋法包埋法包埋法包埋法共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法共价交联法共价交联法共价交联法共价交联法制备制备制备制备易易易易易易易易难难难难难难难难结合力
28、结合力结合力结合力弱弱弱弱强强强强强强强强强强强强酶活力酶活力酶活力酶活力高高高高高高高高中中中中中中中中底物专一性底物专一性底物专一性底物专一性无变化无变化无变化无变化无变化无变化无变化无变化有变化有变化有变化有变化有变化有变化有变化有变化再生再生再生再生可能可能可能可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能不可能固定化费用固定化费用固定化费用固定化费用低低低低中中中中高高高高中中中中环境生物学技术(3)固定化方法与载体的选择1.1.必须注意维持酶的催化活性和专一性必须注意维持酶的催化活性和专一性2.2.酶与载体结合牢固酶与载体结合牢固 3.3.载体的机械强度载体
29、的机械强度4.4.固定化酶要有最小的空间位阻固定化酶要有最小的空间位阻 5.5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.6.固定化酶要廉价固定化酶要廉价环境生物学技术(3)固定化酶的特点固定化酶的特点 具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。的功能。可重复使用酶底物产物易分开反应条件易控制酶的利用效率高比水溶性酶更适合于多酶反应环境生物学技术(3)固定化酶的酶活力多数固定化酶活性均有所下降，原因主要有多数固定化酶活性均有所下降，原因主要有：酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚
30、至活性中心的氨基酸也会参生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应；加反应；固定化后的空间障碍效应的影响；固定化后的空间障碍效应的影响；内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻；的接近受阻；包埋法时被高分子物质半透膜包围。包埋法时被高分子物质半透膜包围。环境生物学技术(3)酶固定化效果的测定 固定化酶活力测定基本上与溶液酶相似，即每毫克干重固定化酶每分钟转化1umol底物量或形成1umol产物的酶量为一个单位(umol/mgmin)，对于酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积（cm2）的初速度来表示。环境生物学技术(3)由于在固定化中酶往往会有些失活，因此，
31、测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为难确。在酶固定化操作中，当酶与载体结合后，用适量适当的缓冲液淋洗固定化酶，以洗除未固定的酶，收集洗脱液，并测定其中蛋白量(或酶活力)，即为残留的蛋白量(或酶活力)。固定化效率固定化效率环境生物学技术(3)固定化酶的稳定性固定化酶的稳定性多数酶的稳定性在固定化后都有所提高，延长了有效寿命，这是由于：第一，固定化增加了酶构象的牢固程度；第二、挡住了不利因素对酶的侵袭；第三，限制了酶分子间的相互作用；但是，如果固定化触及到酶活性敏感区域，也可能导致酶稳定性下降。环境生物学技术(3)pH-酶活力关系酶活力关系反应的最适pH和酶活力p
32、H曲线的变动依据酶蛋白和载体的电荷而定。带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反。尽管大多数固定化酶的活力pH关系曲线仍为钟形曲线，但与溶液酶比较，其钟形更陡，或更坦，向酸性或碱性方向偏移。环境生物学技术(3)对蛋白酶的抵抗力提高氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20，而将其固定于DEAE纤维素上在同样条件下仍有80的活力。这可能是因为蛋白酶分子量大，受到空间位阻，不能进入固定化酶中；对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高氨基酰化酶与固定于DEAESephadex的氨基酰化酶比较，前者在6mol、2mol胍、1SDS和4mmol丙酮溶液中活力分别为9、49、1和5
33、5，而后者在相应溶液中活力则分别为146、117、35和138。环境生物学技术(3)固定化酶在操作中可以长期使用，半衰期(t1/2)，即酶活性达到原有酶活性一半时所需的时间)较长。半衰期可按下式计算：式中ED为反应t时的酶浓度，E为原有酶浓度。操作稳定性操作稳定性环境生物学技术(3)部分固定化酶的半衰期部分固定化酶的半衰期环境生物学技术(3)固定化酶的反应器类型环境生物学技术(3)Batch Stirred tank reactor,BSTR 结构简单，不需要特殊设备，适于小规模结构简单，不需要特殊设备，适于小规模实验。一般应用溶液酶或粗酶制剂催化，酶实验。一般应用溶液酶或粗酶制剂催化，酶不回
34、收，待反应转化至一定程度后，通过加不回收，待反应转化至一定程度后，通过加热或其他方法直接使之失效除去。但在反复热或其他方法直接使之失效除去。但在反复过滤或离心回收过程中，易造成酶的失效损过滤或离心回收过程中，易造成酶的失效损失。工业上很少用失。工业上很少用.环境生物学技术(3)Continuous Stirred tank reactor,CSTR 催化剂采用颗粒状的固定化酶，少数应用催化剂采用颗粒状的固定化酶，少数应用片状固定化酶。运转过程中要不断分出部分片状固定化酶。运转过程中要不断分出部分反应液，同时补充等量的新鲜底物溶液，为反应液，同时补充等量的新鲜底物溶液，为不致使酶随反应液流失，所
35、以在它的出口处不致使酶随反应液流失，所以在它的出口处通常有滤膜。用于有底物抑制场合。通常有滤膜。用于有底物抑制场合。环境生物学技术(3)Plug Flow reactor,PFR 填充床内用颗粒状或片状固填充床内用颗粒状或片状固填充床内用颗粒状或片状固填充床内用颗粒状或片状固定化酶填充，运转时，底物按定化酶填充，运转时，底物按定化酶填充，运转时，底物按定化酶填充，运转时，底物按一定方向以恒定速度通过反应一定方向以恒定速度通过反应一定方向以恒定速度通过反应一定方向以恒定速度通过反应床，床，床，床，沿流动方向底物及产物的沿流动方向底物及产物的浓度逐渐变化，但同一横切面浓度逐渐变化，但同一横切面上浓
36、度一致上浓度一致。使用最普遍。使用最普遍。使用最普遍。使用最普遍。固定化酶堆积密度大，但固定化酶堆积密度大，但固定化酶堆积密度大，但固定化酶堆积密度大，但床床内压降大，固定化酶清洗更换内压降大，固定化酶清洗更换麻烦。麻烦。环境生物学技术(3)Fluidized bed reactor,FBR 底物溶液以足够大的流速向上通底物溶液以足够大的流速向上通底物溶液以足够大的流速向上通底物溶液以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于过固定化酶床层，使固体颗粒处于过固定化酶床层，使固体颗粒处于过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态。混合程度高，故传热、流化状态。混合程度高，故传热、流化状态。混合
37、程度高，故传热、流化状态。混合程度高，故传热、传质情况良好。可用于处理粘性强传质情况良好。可用于处理粘性强传质情况良好。可用于处理粘性强传质情况良好。可用于处理粘性强和含有固体颗粒的底物，或用于需和含有固体颗粒的底物，或用于需和含有固体颗粒的底物，或用于需和含有固体颗粒的底物，或用于需要供应气体或排放气体的反应。要供应气体或排放气体的反应。要供应气体或排放气体的反应。要供应气体或排放气体的反应。传质效果好，不容易堵塞；但需传质效果好，不容易堵塞；但需要保持较高的流速，动力消耗大，要保持较高的流速，动力消耗大，且固定化酶浓度低，颗粒处于流态且固定化酶浓度低，颗粒处于流态化，易损耗。化，易损耗。环
38、境生物学技术(3)CSTR/Ultrfitration reactor,CSTR/UFR 由连续流搅拌桶式反应器和超滤装置组合由连续流搅拌桶式反应器和超滤装置组合而成，为小分子量产物与高分子底物的分离、而成，为小分子量产物与高分子底物的分离、底物较彻底的转化以及溶液酶或固定化酶的底物较彻底的转化以及溶液酶或固定化酶的反复使用提供了可能。但酶易因循环超滤而反复使用提供了可能。但酶易因循环超滤而失效损失。失效损失。环境生物学技术(3)Recycle reactor,RCR 把部分流出物与加料流混合，然后再把部分流出物与加料流混合，然后再令其进入反应器。特点是可以提高液体令其进入反应器。特点是可以提
39、高液体的流速和减少底物向固定化酶表面传递的流速和减少底物向固定化酶表面传递的阻力。的阻力。环境生物学技术(3)固定化酶反应器的选择根据固定化酶的形状来选择根据固定化酶的形状来选择根据底物的物理性质来选择根据底物的物理性质来选择根据反应的动力学特性来选择根据反应的动力学特性来选择根据外界环境对酶稳定性的影响选择根据外界环境对酶稳定性的影响选择根据操作要求及反应器费用来选择根据操作要求及反应器费用来选择环境生物学技术(3)固定化酶的形状一般言之，颗粒状或片状固定化酶对一般言之，颗粒状或片状固定化酶对连续流连续流搅拌桶式反应器搅拌桶式反应器和和填充式反应器填充式反应器类型的反应类型的反应器均可适用。
40、但膜状和纤维状的固定化酶则器均可适用。但膜状和纤维状的固定化酶则不适于不适于连续流搅拌桶式反应器连续流搅拌桶式反应器，而适用于，而适用于填填充式反应器充式反应器。若固定化酶易变形、易粘结或颗粒细小时，若固定化酶易变形、易粘结或颗粒细小时，那么在填充于那么在填充于填充式反应器填充式反应器后，往往会引起后，往往会引起高的压力降和堵塞床层，并且在大规模生产高的压力降和堵塞床层，并且在大规模生产中无法实现高的流率。此时宜采用流动床反中无法实现高的流率。此时宜采用流动床反应器。应器。环境生物学技术(3)底物的物理性质底物分三种情况：溶解性物质、颗粒物质与胶状底物分三种情况：溶解性物质、颗粒物质与胶状底物
41、分三种情况：溶解性物质、颗粒物质与胶状底物分三种情况：溶解性物质、颗粒物质与胶状物质。溶解性底物显然对任何类型反应器均不会物质。溶解性底物显然对任何类型反应器均不会物质。溶解性底物显然对任何类型反应器均不会物质。溶解性底物显然对任何类型反应器均不会造成困难。造成困难。造成困难。造成困难。颗粒状和胶状底物则往往会导致床层堵塞，对此颗粒状和胶状底物则往往会导致床层堵塞，对此颗粒状和胶状底物则往往会导致床层堵塞，对此颗粒状和胶状底物则往往会导致床层堵塞，对此可用循环反应器或流动床反应器。可用循环反应器或流动床反应器。可用循环反应器或流动床反应器。可用循环反应器或流动床反应器。连续流搅拌桶式反应器连续
42、流搅拌桶式反应器连续流搅拌桶式反应器连续流搅拌桶式反应器只要搅拌速度足够高，能只要搅拌速度足够高，能只要搅拌速度足够高，能只要搅拌速度足够高，能维持底物和固定化酶良好的悬浮状态，也可用于维持底物和固定化酶良好的悬浮状态，也可用于维持底物和固定化酶良好的悬浮状态，也可用于维持底物和固定化酶良好的悬浮状态，也可用于颗粒状底物。但高的搅拌速度会导致固定化酶从颗粒状底物。但高的搅拌速度会导致固定化酶从颗粒状底物。但高的搅拌速度会导致固定化酶从颗粒状底物。但高的搅拌速度会导致固定化酶从载体上被剪切下来，所以转速不能太高。载体上被剪切下来，所以转速不能太高。载体上被剪切下来，所以转速不能太高。载体上被剪切
43、下来，所以转速不能太高。环境生物学技术(3)酶反应动力学特性 一般而言，填充床反应器在固定化酶反应一般而言，填充床反应器在固定化酶反应器中占有主导地位，它适合于产物抑制的场器中占有主导地位，它适合于产物抑制的场合；但在底物抑制的系统中，则合；但在底物抑制的系统中，则连续流搅拌连续流搅拌桶式反应器桶式反应器的性能又优于填充床。流动床反的性能又优于填充床。流动床反应器因其流动特性接近应器因其流动特性接近连续流搅拌桶式反应连续流搅拌桶式反应器器，故也适宜于底物抑制的反应。，故也适宜于底物抑制的反应。环境生物学技术(3)酶的稳定性在反应器操作过程中，由于搅拌浆或液流在反应器操作过程中，由于搅拌浆或液流
44、的剪切作用，常会使固定的酶从载体上脱的剪切作用，常会使固定的酶从载体上脱落下来，或由于磨损，引起粒度的减小而落下来，或由于磨损，引起粒度的减小而影响固定化酶的操作稳定性，其中尤以连影响固定化酶的操作稳定性，其中尤以连续流搅拌桶式反应器最为严重。续流搅拌桶式反应器最为严重。为解决这一问题而改进反应器设计，是把为解决这一问题而改进反应器设计，是把酶直接粘接在搅拌轴上，或把固定酶设置酶直接粘接在搅拌轴上，或把固定酶设置在与轴相连的金属网篮内。在与轴相连的金属网篮内。环境生物学技术(3)操作要求及反应器费用 连续流搅拌桶式反应器是最便宜的，它结连续流搅拌桶式反应器是最便宜的，它结构简单，且具有良好的操
45、作性，适应性强；构简单，且具有良好的操作性，适应性强；而其他类型的反应器，则都需为特定的生产而其他类型的反应器，则都需为特定的生产过程专门设计和制造。在讨论反应器价格的过程专门设计和制造。在讨论反应器价格的同时，还应该考虑固定化酶本身的费用，及同时，还应该考虑固定化酶本身的费用，及在各种反应器中的稳定性。在各种反应器中的稳定性。环境生物学技术(3)固定化对酶反应系统的影响固定化对酶反应系统的影响 固定化对酶活性和酶反应体系的影响是十分复杂的，常因酶的种类、反应系统的组成，特别是固定的方法及载体而显著不同。为了简化，通常作两个假设：酶在载体表面或多孔介质内的分布是完全均匀的。整个系统各方同性。环
46、境生物学技术(3)构象改变和屏蔽效应酶在固定化的过程中，出于酶与载休相互作用使酶的活性中心或变构中心的构象发生变化从而导致酶活性下降。这种效应难以定量描写，也难以预测。通常出现在吸附法和共价键结合法。立体屏蔽效应是由于载体对酶的活性中心或变构中心造成空间障碍，因而底物或效应物与酶无法接触，从而影响酶的活性。若在酶和载体间加入臂，可以得到改善环境生物学技术(3)微环境的影响微环境是紧邻固定化酶的环境区域。微环境的影响是由于载体的亲水与疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化效本，或者是酶对效应物作出反应的能力的一种效应，通常可以通过改变载体和介质的性质作出判断和调节。环境生物学技术(3)分配效
47、应由于载体的亲水和疏水性质使底物、产物或其他效应物在微观环境和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响了反应速度。环境生物学技术(3)分配效应的影响载体与底物带有相同电荷，则酶的载体与底物带有相同电荷，则酶的KmKm值将因固定值将因固定化而增大；如果带有相反电荷则相反。化而增大；如果带有相反电荷则相反。当载体带正电荷时，固定化之后，酶活性一当载体带正电荷时，固定化之后，酶活性一PHPH曲曲线向酸性方向偏移；相反，阴离子载体将导致该线向酸性方向偏移；相反，阴离子载体将导致该曲线向碱性方向偏移。曲线向碱性方向偏移。以上效应可通过提高介质离子强度而削弱或消除。以上效应可通过提高介
48、质离子强度而削弱或消除。采用疏水载体时，如底物为极性物质，或电荷物采用疏水载体时，如底物为极性物质，或电荷物质，则酶的质，则酶的KmKm值将因固定化而降低，其他效应物值将因固定化而降低，其他效应物亦然。亦然。环境生物学技术(3)扩散效应扩散限制效应是指：底物或其他效应物的迁移和扩散限制效应是指：底物或其他效应物的迁移和运转受到限制的一运转受到限制的一 种效应。它分内扩散效应和外种效应。它分内扩散效应和外扩散效应两种。扩散效应两种。外扩散限制，是指上述物质从宏观体系穿过包围外扩散限制，是指上述物质从宏观体系穿过包围在固定化酶周围近乎停滞的液膜在固定化酶周围近乎停滞的液膜(Nernst)(Nern
49、st)层到固定层到固定化酶表面所受到的限制，可以充分搅拌或混合而化酶表面所受到的限制，可以充分搅拌或混合而减小或消除。减小或消除。内扩散限制，是指上述物质从固定化酶表面来到内扩散限制，是指上述物质从固定化酶表面来到颗粒内部酶活性位点受到的一种限制。颗粒内部酶活性位点受到的一种限制。环境生物学技术(3)固定化酶的优点固定化酶的优点极易将固定化酶与底物、产物分开，简化极易将固定化酶与底物、产物分开，简化了提纯工艺；了提纯工艺；稳定性提高，可长时间反复使用，有利于稳定性提高，可长时间反复使用，有利于工艺的连续化、工业化；工艺的连续化、工业化；酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自酶反应过程可以严格控制
50、，有利于工艺自动化和微电脑化；动化和微电脑化；较能适应于多酶反应；较能适应于多酶反应；酶的使用效率提高，产物得率提高，产品酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。质量有保障，成本低。环境生物学技术(3)固定化酶的缺点固定化酶的缺点由于底物须经扩散才能和载体上的酶接触，由于底物须经扩散才能和载体上的酶接触，反应产物也要经扩散进入液相，固定化酶反应产物也要经扩散进入液相，固定化酶速度一般低于可溶性酶；速度一般低于可溶性酶；不适用于不溶性底物及大分子底物，也不适用于不溶性底物及大分子底物，也不不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应；适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应；应用过程中酶可