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1、微生物综合实验微生物综合实验2 2微生物学综合实验（二）微生物学综合实验（二）第一阶段：分组第一阶段：分组-选题选题-制定实验方案制定实验方案第二阶段：菌株筛选第二阶段：菌株筛选-分离纯化分离纯化-菌落形态观察菌落形态观察第三阶段：菌株保藏第三阶段：菌株保藏-个体形态个体形态-生理生化特征生理生化特征第四阶段：分子鉴定第四阶段：分子鉴定-生物信息学分析生物信息学分析样品的采集采泥器：适用于采集海洋、河流、湖泊、水产养殖场等水底表层泥样 泥样的采集南森采水器：可以采取海洋不同深度的若干个水样，同时测定各水样所在水层的水温。水样 的采集装有海水样品的离心管在超净工作台中处理将采集的样品装于灭菌的离
2、心管中，在尽可能短的时间内进行处理（无菌条件下）。选择合适的培养基培养基的选择标准：有针对性的提供营养物质，如产纤维素酶菌的分离，鉴于菌株可以利用纤维素为碳源，因此需要加入羧甲基纤维素钠，培养后用刚果红染色。菌种的分离纯化1.分离：用无菌生理盐水对样品进行梯度稀释，在相应的培养基上利用平板涂布法对样品涂布，放置在合适温度下培养（海洋菌28）2.纯化：待平板上有明显菌落生长，挑取单个菌落进行划线分离培养，直至纯化。平板分区划线分离法（左）及培养后菌落分布示意图（右）形态观察：菌落形态观察与描述：每人提供一张带有单菌落的划线分离培养的固体平板数字化照片；鼓励另外提供能够显示菌株特点的照片。4月11
3、号之前发指导教师邮箱。形态观察：1、菌株编号：、菌株编号：QM272、培养基：海洋细菌、培养基：海洋细菌2216E3、培养时间：、培养时间：48h4、菌落形态描述：菌落圆形、菌落形态描述：菌落圆形、光滑、湿润、边缘整齐、奶光滑、湿润、边缘整齐、奶油色、直径油色、直径3-5mm、形态观察：显示菌株特点的照片（需附说明）：细菌QM38在海洋细菌2216E平板上生长96h，由于分泌胞外琼胶酶，琼脂降解，导致平板液化。形态观察：显示菌株特点的照片（需附说明）：利用卢戈氏碘液对琼胶降解细菌进行筛选，能够产生胞外琼胶酶的菌株，其菌落周围有着色浅的透明区域。第三阶段：菌株保藏第三阶段：菌株保藏-个体形态个体
4、形态-生理生化特征生理生化特征 菌株保藏：初定于4月13号-17号菌株保藏 1、海洋细菌的菌种是重要的海洋微生物资源；2、学习菌株保藏的相关理论知识；3、利用-80超低温冰箱冷冻保藏菌株。4、具体保藏步骤介绍。甘油冷冻保藏法甘油冷冻保藏法原理：加入保护剂：丙三醇，-70-80保存。步骤：保种液配方：1%Nacl,15%丙三醇，85%水 灭菌 将纯化后的菌种在普通斜面上进行划线 加入保种液，将菌洗脱 加入灭过菌的菌种保存管中超低温冰箱保存画蛇形线 菌种保存管第三阶段：菌株保藏第三阶段：菌株保藏-个体形态个体形态-生理生化特征生理生化特征 个体形态观察：4月11号-1、个体形态与大小；2、革兰氏染
5、色；3、芽胞染色、鞭毛染色。第三阶段：菌株保藏第三阶段：菌株保藏-个体形态个体形态-生理生化特征生理生化特征 生理生化特征：1、生长温度试验；生长盐度实验；2、TCBS培养基生长实验；3、氧化酶、过氧化氢酶实验；4、API 试剂条进行快速生理生化特征测定温度实验n用接种环挑取新鲜细菌培养物于4ml无菌水中稀释，取20ul滴于2216E平板上，分别放在5 、15 、28 、37 、42恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况。n培养时间依温度而异，5、15 培养一周；37 、42培养两天。盐度实验n用不同浓度的NaCl溶液代替陈海水，配制不同NaCl浓度的培养基。挑取培养了48h的新鲜菌落于4ml无菌
6、水中稀释后，取20ul滴于0，1，3，5，7，9%NaCl浓度的培养基上，28培养72h，观察菌落生长状况。n培养基由指导教师统一提供TCBS生长试验 TCBS培养基是一种弧菌的鉴别性培养基，菌落一般呈绿色、黄绿色和黄色等颜色，原因是有些菌可以利用培养基中的蔗糖产酸，使培养基的pH值降低，指示剂变黄色，而不能利用蔗糖的弧菌菌落仍呈现绿色。有时随着培养时间的延长，黄色菌落颜色也会发生变化，变成浅绿色或绿色，这主要也是由于培养基pH的变化造成的。培养基由指导教师统一提供，或指定一个小组准备。鉴于部分生理生化实验培养基的配置要求较高，且不易观察实验结果。因此部分实验采用API试剂条进行。API鉴定系
7、统鉴定系统 API是 Analytic Products INC的简称。API鉴定系统是由法国生物一梅里埃公司生产的细菌数值分类分析鉴定系统。该系统品种齐全，包括的范围广，鉴定的能力强，数据库在不断地完善和补充，目前约有 1000种生化反应，可鉴定的细菌大于 550种。是世界范围内应用最广、种类最多、最受微生物学家推崇的国际标准化产品。API组成nAPI鉴定系统的主要部分是 API试剂条及检索工具此外有些反应还需使用添加试剂。n发酵试验：为碳水化合物与酸的分解代谢试验，结果 是通过 PH的变化引起酸碱指示剂颜色的改变来判断。如葡萄糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、山梨醇等。n同化试验：根据
8、待测菌能否利用反应杯中的单一碳水 化合物作为碳源而得以生长来判断。如葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N一乙酰葡糖铵、葵酸、乙二酸、苹果酸等。n酶试验：根据待测菌含有相应的酶就可分解底物，再 通过显色反应来判断。如碱性磷酸酶、氧化酶、一半乳糖苷酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱羧酶、吲哚产生等。n其它生化反应：如硝酸盐还原酶、七叶苷、明胶、硝酸盐还原等。API种类根据用途不同，API分为14种：API 20 E、API 20 NE、API 20 STREP、API CAMPY、API STAPH、API NH、API 20 C AUX 、API Candida、API 20 A、API
9、CORYNE、API 10 S、RAPID 20 E、API LISTERIA、API ZYM、API 50 CH API 50 CHB、API 50 CHL、API 50 CHEAPI种类鉴定细菌鉴定细菌 API 20E 肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌 RapiD 20E 肠杆菌 API 10 S 肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌 API 20 NE 非肠道和非苛养革兰氏阴性杆菌 API Staph 葡萄球菌，考克氏菌和微球菌属 API 20 Strep 链球菌 API Coryne 棒状杆菌 API Listeria 李斯特氏菌 API种类鉴定细菌鉴定细菌 API Candida 酵母菌
10、 API 20 C AUX 酵母菌 API 20 A 厌氧菌 API Campy 弯曲杆菌 API NH 奈瑟氏球菌，嗜血杆菌和卡他布兰汉菌 API ZYM 半定量检测酶活性 API 50 CHAPI 50 CHB/E 肠杆菌科、芽孢杆菌 API 50 CHAPI 50 CHL 乳酸杆菌 API 20E-肠道杆菌科於环境中及动物产品中非肠道杆菌科於环境中及动物产品中非常普遍其中部份是致病性常普遍其中部份是致病性(沙门氏、耶沙门氏、耶尔森氏尔森氏)-常规鉴定中的标准常规鉴定中的标准-其他新鉴定系统比较的金标准其他新鉴定系统比较的金标准-方便使用，方便使用，24小时出报告小时出报告API 20 E
11、n23个生化结果n需额外补充氧化酶结果n孵育18-24 小时，37oCn鉴定可使用 n阅读表n编码手册nAPILAB 软件 API 20 E 124 124 124 124 1241 24 124 12 4124ONPG ADH LDC ODC CIT H2S UREE TDA IND VP GEL GLUMAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX NO2 N2 MOB McC OF-O OF-F 39n n利用传统生化及发酵利用传统生化及发酵反应作肠道杆菌鉴定反应作肠道杆菌鉴定n n肉眼判读肉眼判读n n原理使用 20 个风乾底物的小杯11 个传统生化及酶反应，10
12、个发酵试验加附试剂(VP,TDA,IND.)5分钟后阅读补充试验:OX,MOB,MAC,OF,NRAPILABAPI 20 E40nAeromonas(气单胞菌属)(3)nPlesiomonas(邻单胞菌属)(1)nVibrio(弧菌)(7)nPasteurella(巴斯德氏菌)(3)nChromobacter(色杆菌)(1)nChromobacterium(色杆菌属)(1)nPseudomonas(假单胞菌属)(5)nBurkholderia(伯克霍尔德菌属)(2)nChryseomonas(金色单胞菌属)(1)nChryseobacterium(金色杆菌属)(2)nFlavimonas(黄
13、色单胞菌属)(1)nXanthomonas(黄单胞菌)(1)nAcinetobacter(不动杆菌属)(1)nMoraxella(莫拉菌属)(1)nFlavobacterium(金黄杆菌)(3)nWeeksella(威克斯菌属)(2)nBordetella/Alcaligenes (1)(博德特氏菌属/产硷菌属)nAchromobacter(无色杆菌属)(1)nPhotobacterium(发光杆菌属)(1)nSphingomonas(鞘氨醇单胞菌属)(1)nShewanella(腐败希瓦氏菌属)(1)nSphingobacterium(鞘氨醇杆菌属)(1)nStenotrophomonas(
14、寡养单胞菌属)(1)API 20 E数据库数据库数据库数据库 版本版本版本版本 4.0 4.041API 试剂盒及其配套试剂(API 20E)l l培养盒培养盒培养盒培养盒保持潮湿环境保持潮湿环境l l石腊油石腊油石腊油石腊油(容量容量容量容量:125ml):125ml)覆盖在指定小孔上覆盖在指定小孔上l l悬浮液悬浮液悬浮液悬浮液 (容量容量容量容量:5ml):5ml)用於调菌液用於调菌液l l附加试条附加试条附加试条附加试条加进指定的生化孔内加进指定的生化孔内l lAPI 20E API 20E 试条试条试条试条每个小孔载有风乾的底物每个小孔载有风乾的底物l lPSIpettesPSIpe
15、ttes 接种管接种管接种管接种管挑菌落，混匀及接种挑菌落，混匀及接种安培架安培架操作步骤 1 (API 20E)l l分离单个菌落分离单个菌落分离单个菌落分离单个菌落 挑单个可疑菌落挑单个可疑菌落 尽量避免使用高度选择性培养基尽量避免使用高度选择性培养基l调制菌液调制菌液l悬浮液悬浮液(容量容量:5ml)操作步骤 2 (API 20E)l将菌液接种到小将菌液接种到小管或小管及小杯管或小管及小杯(CIT,VP和和 GEL)l将试条放进培将试条放进培养盒内养盒内l将将 5ml 无菌无菌水放进培养水放进培养盒里盒里l利用石腊油覆盖指定的生化孔利用石腊油覆盖指定的生化孔(有划线的孔有划线的孔)ADH
16、 ODC H2S UREl把培养盖盖上把培养盖盖上操作步骤 3 (API 20E)l把试条放进孵育箱内，利用指把试条放进孵育箱内，利用指定温度及时间定温度及时间 API20E:35-37oC，18-24 小时小时l按操作说明书规定，将附加试剂按操作说明书规定，将附加试剂加进适当小孔内加进适当小孔内api20E 试剂试剂18-24 小时後小时後阅读结果l利用编码手册利用编码手册 或或APILAB PLUS软件进出分析软件进出分析l根据说明书上，根据说明书上，或彩图的指示，或彩图的指示，记录结果於报告记录结果於报告单上。单上。API试剂条nAPI试剂条由透明的 PVC材料制成，不同的试剂条有 不同
17、数量的反应杯，每个反应杯内包被有相应的干燥生化基质，常见的生化反应有以下 5类：API 试剂盒使用 由指导教师指导，每个小组提供API 20E 试剂条一个，每个小组选取两株菌进行鉴定。每个小组提供ATB 鉴定系统相关试剂条1-2个，培训ATB细菌自动鉴定与药敏系统使用方法。第三阶段：菌株保藏第三阶段：菌株保藏-个体形态个体形态-生理生化特征生理生化特征 时间表：各实验交叉进行，拟4月21-23号进行API试剂条及ATB试剂条鉴定；5月1日前结束生理生化特征测定，但结果可延后观察。第四阶段：分子鉴定第四阶段：分子鉴定-生物信息学分析生物信息学分析 16S rDNA 序列扩增：1、理论知识学习，指
18、导老师发参考文献；2、5月5号左右活化菌株，拟5月7号上午进行PCR实验；3、5月7-8号，电泳，观察结果，送样。4、5月15号，返回测序结果，拟在学院楼415教室统一讲解数据库使用，序列比对，系统发育树构建。6、5月30号之前提交实验报告。PCR模板的制备：在2216E培养基上培养了48h的细菌培养物，接种环挑取菌落，到20ul无菌水中，制备成菌悬液，沸水浴十分钟后，立即放入冰浴中冷却使菌体破裂，10000r/m离心10min，收集菌体，-21保存。PCR反应体系反应体系10*Buffer（Mg2+free）5ul 25mM MgCl2 4ul dNTP Mixture(10mM each)
19、4ul Taq 聚合酶（2.5/ul）0.5ul 模版DNA 1ul 引物1 1ul 引物1 1ul 双蒸馏水 36.5ul 总体积50ul PCR反应循环参数：反应循环参数：n94预变性6minn94变性55s，55退火50s，72延伸90s，30个循环；n72延伸7min。PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定nPCR扩增物6 ul于1.1%琼脂糖凝胶，电压脉冲，在紫外灯下观察,是否有约1.5Kb的片段。PCR扩增产物经电泳检测后，直接交测序公司进行纯化和序列测定。将测定的基因序列运用Blast程序与数据库中已存在的细菌16SrDNA核酸序列进行相似性比较分析。1、每人选取1株细菌进行PCR扩增，测序。2、愿意将序列提交到GenBank数据库的同学，指导教师辅导序列提交。1、每周选一个时间，大家都来实验室，检查交流实验情况。2、除上面约定时间外，指导教师每周一下午2:30来实验室，平时随时可以到206咨询。