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1、专题专题3 3植物组织培养技术植物组织培养技术一、基础知识一、基础知识课题课题1 1：菊花的组织培养菊花的组织培养1 1、植物的组织培养、植物的组织培养（1 1）细胞的分化）细胞的分化概念：概念：在个体发育中，相同细胞的后代在形在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程异的过程 过程：过程：如：受精卵增殖、生长、分化形成组如：受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官、系统织、器官、系统特点：特点：（2 2）稳定性：稳定性：细胞分化是稳定的，一般是不可细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的逆转的（3 3）全能性：全能性：已分化的细胞，仍具有发
2、育的潜能已分化的细胞，仍具有发育的潜能（1 1）持久性：持久性：是一种持久性的变化，它发生在生是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度在胚胎期达到最大限度原因：原因：基因在特定的时间和空间条件下的选基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果择性表达的结果结果：结果：形成不同的细胞和组织形成不同的细胞和组织（2 2）细胞的）细胞的全能性全能性定义：定义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性个体的潜能的特性原理：原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套
3、遗传物质，都有发育成为完特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因整个体所必需的全部基因高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的遗传物质为细胞核内含有该物种遗传性所需要的遗传物质已分化的植物细胞，仍具有全能性已分化的植物细胞，仍具有全能性实例实例受精卵受精卵 生殖细胞生殖细胞 体细胞体细胞全能性的比较全能性的比较:在生物的所有细胞中，受精卵的全能性是最高，在生物的所有细胞中，受精卵的全能性是最高，进行有性生殖的生
4、物体的任何一个细胞，都是进行有性生殖的生物体的任何一个细胞，都是由受精卵分裂、分化而成。生殖细胞，尤其是卵由受精卵分裂、分化而成。生殖细胞，尤其是卵细胞，虽然分化程度很高，但是仍然又较高的潜细胞，虽然分化程度很高，但是仍然又较高的潜在全能性，在某些条件下卵细胞可以进行孤雌生在全能性，在某些条件下卵细胞可以进行孤雌生殖殖（3 3）植物组织培养）植物组织培养细胞离体细胞离体必要条件：必要条件：一定的营养物质、激素和其他一定的营养物质、激素和其他外界条件外界条件原理原理:细胞的全能性细胞的全能性外植体：从活植物体上切下进行培养的那部外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官分细胞、组织
5、或器官相关概念相关概念:脱分化：指已经分化的植物器官、组织或细胞脱分化：指已经分化的植物器官、组织或细胞,当受到创伤或进行离体当受到创伤或进行离体(也受到创伤也受到创伤)培养时培养时,已已停止分裂的细胞停止分裂的细胞,又重新恢复分裂又重新恢复分裂,细胞改变原细胞改变原有的分化状态有的分化状态,失去原有结构和功能失去原有结构和功能,成为具有成为具有未分化特性的细胞。未分化特性的细胞。再分化：已经脱分化的细胞在一定条件下再分化：已经脱分化的细胞在一定条件下,又可又可经过愈伤组织或胚状体经过愈伤组织或胚状体,再分化出根和芽再分化出根和芽,形成完形成完整植株整植株,这一过程叫作再分化。这一过程叫作再分
6、化。愈伤组织愈伤组织:细胞排列疏松而无规则细胞排列疏松而无规则,是高度液泡是高度液泡化的、成无定性状态的薄壁细胞化的、成无定性状态的薄壁细胞过程过程:离离离离体体体体组组组组织织织织或或或或细细细细胞胞胞胞植植植植物物物物体体体体脱分化脱分化脱分化脱分化细胞分细胞分细胞分细胞分裂素裂素裂素裂素生长素生长素生长素生长素愈愈愈愈伤伤伤伤组组组组织织织织芽芽芽芽根根根根细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素素素素 生长素生长素生长素生长素细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素素素素 有利于根的分化有利于根的分化生长素生长素细胞分裂素：细胞分裂素：有利于芽的分化，抑有利于芽的分化，抑制根的分化制根的分化生长素
7、生长素细胞分裂素：细胞分裂素：促进愈伤组织生长促进愈伤组织生长生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响对植物细胞发育方向的影响（4 4）pHpH、温度、光照、温度、光照pHpH控制在控制在5.85.8左右，温度控制在左右，温度控制在18182222。C,C,每每日用日光灯照射日用日光灯照射12h12h讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2 2中微生物培养基的配方相比，中微生物培养基的配方相比，MSMS培养基的配方培养基的配方有哪些明显的不同？有哪些明显的不同？答：答：微量元素和大量元素提
8、供植物细胞生活所必微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，养为主。与微生物的培养不同，MSMS培养基则需培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。必须的大
9、量元素和微量元素两大类。二、实验操作二、实验操作（一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基MSMS培养基包括培养基包括2020多种营养成分，实验室一般多种营养成分，实验室一般使用使用4 4保存配制好的培养基母液来制备保存配制好的培养基母液来制备1 1、配置各种母液、配置各种母液 为了避免每次配制培养基都要称量几十种成为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分，减少工作量，可以将各种成分按比例配置分，减少工作量，可以将各种成分按比例配置成浓缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成浓缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成比所需浓度高成比所需浓度高1010100100倍的母液。使用时，倍的母液。使
10、用时，根据浓缩比例计算用量，加水稀释根据浓缩比例计算用量，加水稀释无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩1010倍，微量元素浓倍，微量元素浓缩缩100100倍，常温保存倍，常温保存激素类、维生素类以及用量较小的有机物一激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按般可按1mg/ml1mg/ml的质量浓度单独配制成母液的质量浓度单独配制成母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量的浓缩倍数，计算用量2 2、配置培养基、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml50ml或或100ml100ml 配制培养液配制培养液配制配
11、制1LMS1LMS培养基，先将称好的琼脂加培养基，先将称好的琼脂加800ml800ml蒸蒸馏水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖馏水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖30g30g，取，取配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至1000ml1000ml 调调PHPH培养基的分装培养基的分装 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素不必添加植物激素3 3、灭菌、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸
12、汽灭菌汽灭菌1 1、选材：、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒（二）外植体消毒2 2、消毒、消毒流水冲洗流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min20min左右左右 酒精处理酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为积分数为7070的酒精中摇动的酒精中摇动2 23 3次，持续次，持续6 67s7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗，立即将外植体取出，在无菌水中清洗 消毒液处理消毒液处理取出后
13、用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为放入质量分数为0.10.1的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中1 12min2min，取出后在无菌水中至少清洗，取出后在无菌水中至少清洗3 3次，漂净次，漂净消毒液消毒液（三）接种（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用室消毒是至关重要的。用7070的酒精喷雾使空的酒精喷雾使空气消毒，气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射线照射2020分钟分钟1 1、接种室消毒、接种室消毒2 2、无菌操作要求、无菌操作要
14、求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3 3、材料的切取和接种、材料的切取和接种将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（长约（长约0.5-1cm0.5-1cm）。左手持锥形瓶。右手拉开捆）。左手持锥形瓶。右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥在右手手心，以扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥在右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶
15、，避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取菊花茎段，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取菊花茎段，放入培养基中。插入时应注意不要倒插。每瓶接放入培养基中。插入时应注意不要倒插。每瓶接种种6 68 8块外植体。接种后，将封口膜重新扎好块外植体。接种后，将封口膜重新扎好4 4、接种注意事项、接种注意事项每接种一块外植体前，镊子需放入体积分每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为数为7575的酒精溶液中消毒一次，然后在酒的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体外植体在培养基中要分
16、布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3 34 4块，菊的茎或叶块，菊的茎或叶6 68 8块，也不要太少，以充块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件分利用培养基中的营养成分和光照条件插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分基部插入培养基利于吸收水分和养分思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的
17、装有培养设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。（四）培养（四）培养1 1、愈伤组织的培养、愈伤组织的培养从接种外植体到出现愈伤组织需经过从接种外植体到出现愈伤组织需经过2 2周时间。周时间。2 2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈箱的门应该关闭不必见光，因
18、为在无光条件下愈伤组织长的更快。伤组织长的更快。2 2周后，培养基成分接近耗尽，周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养必须更换培养基，进行继代培养继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养一代为一代为20d20d。如果延长时间，培养基中营养物质。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长
19、到直径为如果愈伤组织长到直径为1 11.5cm1.5cm时，就可以时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养2 2、愈伤组织的继代培养、愈伤组织的继代培养在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色绿色3 3、试管苗的培养、试管苗的培养当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的进行试管苗的见光培养见光培养（五）移栽（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养移
20、栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1 1、打开封口膜、打开封口膜2 2、清洗转移、清洗转移用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间生活一段时间（六）栽培（六）栽培3 3、移栽、移栽珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培透性好，适合栽培幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花况，适时浇水、施肥，直至开花三、课题延伸三、课题延伸1 1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养容易进行组织培养2 2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季