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1、1 1 透明质酸菌种染色方法透明质酸菌种染色方法?用吸管吸取菌液一滴滴在载玻片中央，加一滴藩红染色液染色三分钟，在酒精灯上固定干燥后，用洗瓶洗去染色液后，晾干，显微镜下观察。2 2 斜面的制作斜面的制作（1）按斜面配方称取各种药品用纯水溶解后，调PH 至 7.0，加入琼脂，在电炉上加热至沸（沸腾三次）分装于试管（装液量约到试管高度的1/4 处），塞上棉塞，用报纸包扎好灭菌。（2）01MPA，121，20min（3）灭菌完毕待压力自然下降至零，方可打开灭菌锅盖，严禁急速排气降压，以防培养基冲湿棉塞，灭菌后的斜面试管待冷却至 45左右放置斜面，盖上无菌报纸，经无菌检查（空培养 24h）后用报纸包扎
2、好（报纸注明日期），放入冰箱备用。3 3 种子的制作种子的制作（1）培养基的制作，按种子培养基配方称取药品用纯水溶解后，调PH 至 7.0，装液量按 500ml 三角瓶 150ml，2000ml 三角瓶装 1000ml 分装于三角瓶中，瓶口用纱布包扎，用报纸包扎好灭菌，并注上日期及培养基类型。（2）在无菌条件下通过无菌操作将菌源接种于培养基中。（3）将接种好的三角瓶放入 37转速 150r/min 的摇床中培养 12-16h。4 4 菌种的分离纯化（试管稀释法）菌种的分离纯化（试管稀释法）（1）倒板：无菌操作条件下，将灭菌后冷却至 60-70的培养基倒入培养皿内，每皿约 25ml，水平放置，凝
3、固后备用。（2）吸取 0.5ml 菌悬液于无菌水管中做梯度稀释。（3）用无菌吸管吸取菌悬液两滴于培养皿中，每个稀释梯度2-3 板，首末梯度可做 1 板。（4）用无菌刮刀将培养皿上的菌悬液由低浓度到高浓度涂布均匀。（5）于 36-37的培养箱中倒置培养1-2 天，待刚有菌落长出，挑取单个菌落移接斜面，挑取透明圈大的菌落。（6）斜面放 36-37恒温培养箱中培养 1-2 天，成熟后供菌种筛选。5 5 划线分离的操作方法划线分离的操作方法（1）取无菌平板一套在火焰旁按无菌操作法倒入20ml 营养琼脂,让其冷凝成平板。（2）左手拿上述平板,右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取原始分离物在平板上平行划线三条（
4、3）将接种环在火焰上灭菌,左手平板转动大约 70 度,用灭菌接种环通过第一次划线的地方作二次划线,亦划三条。（4）同上法再作第三次,第四次划线。（5）盖上平板盖,将平板倒过来置 37下培养 1-2 天后观察结果.划的好应在第四次划线处出现单个菌落。6 6 菌种的传代操作菌种的传代操作（1）在火焰旁将原有的菌种斜面与待接种的新鲜斜面持在左手拇指、食指及中指之间，菌种管在前，接种管在后。（2）以右手在火焰旁转动两管的棉塞，再以右手持接种环的柄端将接种环在火焰上灼烧，使用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间在火焰旁分别拔出两支试管的棉塞持住，再将试管口在火焰上通过，但勿烧烫。（3）待接种环冷却后
5、将接种环插入菌种管内从斜面上挑取菌苔少许在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上轻轻划线接种。划线时一般先由下而上划一直线后再由下而上划曲线。（4）接种完毕，立即将管口通过火焰，右手到火焰旁塞上棉塞，即可进行培养。7 7 小罐实消操作小罐实消操作（1）第一阶段：打开系统设置中的灭菌控制，并点上自动控制，利用夹套升温至98，同时进行过滤器灭菌。（2）第二阶段：关闭夹套进汽，夹套排污，打开两路蒸汽（进风口，罐底出料口）升温至 121，同时打开冷凝水进水阀门，并注意保持罐内压力和温度相匹配。（3）第三阶段：保持温度 12120min。（4）第四阶段：关闭所有蒸汽阀门和罐底阀门，打开进风阀门使罐内温度自然冷却
6、降温至112，打开加热器进水阀门，自动降至接种所需温度，同时保证罐内不失压。8 PH8 PH 一点标定校正方法一点标定校正方法（1）打开电源开关。（2）清洗电极，放入标准液中（一般为6.86PH）（3）用温度计测量当前标准温度，并在仪器上设定相同的温度值。（4）待 PH 读数稳定后，按定位键，仪器提示STD yes字样，按确认键，仪器自动识别并显示当前温度下的标准PH 值。（5）按确认键即完成一点标定（斜率为100%）。9 9 培养基配制的基本过程培养基配制的基本过程（1）按培养基的配方称取各种药品,用量太少的药品应配制成溶液后再取一定量加入。（2）将各种药品加水溶解,通常是加所需水量的一半。
7、（3）若配固体培养基,按 2%的用量称取琼脂,用水将琼脂浸湿一下,用手挤去琼脂中过多的水分,加入 2 的溶液中。（4）加热至琼脂全部溶解,并补足所需的全部水量。（5）用 1molNaOH 和 1molHCL 调节 pH 至要求值。（6）用分装器将培养基分装入试管或三角瓶中,塞上棉塞并包扎,灭菌后备用。1010 无菌操作注意事项无菌操作注意事项（1）操作前开紫外灯照射30min。（2）关闭紫外灯 30min 后，进入无菌室，香皂洗手，进缓冲间换拖鞋、无菌衣，戴无菌口罩，进入无菌室。（3）打开超净工作台的控制开关，开无菌风，开照明灯。（4）酒精棉球洗手，另取一酒精棉球将超净工作台面及前挡板擦一遍。
8、（5）被倾倒物均需通过火焰倒入待倾倒的容器中。(6)菌种不同需换接种针，且用前用后均需灼烧。(7)所有的玻璃物品口部及棉塞用前均需在火焰上烘烤一遍，才能进行下一步接种工作。（8）严禁菌液、菌苔落在操作台面及地面上，若有滴落必须用酒精棉球擦净。（9）严禁手臂接触试管、三角瓶、茄瓶口部，且口部内外培养基必须擦净。（10）各级培养物必须标明接种时间、接种数量及操作人。（11）操作结束后，无菌室及超净工作台要开紫外灯照射15-30min。（12）无菌室口罩、无菌衣、拖鞋要定期清洗杀菌。11 NikonE10011 NikonE100 显微镜操作方法显微镜操作方法（1）接通电源，打开开关，调节光圈亮度。
9、（2）将样品放在载物台上，并尽可能将样品移动到观察区域中。（3）将物镜最低倍数转至样品上方，缓缓降下物镜至最下方，切勿压到样品。(4)边观察边调节粗焦准螺旋，使物镜缓缓升高，直至观察最清晰。(5)切换物镜至更高一级的倍数，调节光源、光圈等，使光线亮度合适。将目标移至视野中央，调节细焦准螺旋旋钮，使观察最清晰。(6)重复步骤 5，直至达到所需观察倍数。(7)使用显微镜右侧 BINO/PHOTO切换键可以使用电脑进行观察及拍照和录像等。(8)观察结束，取下样品，将物镜缓缓降下，关闭仪器，切断电源。12 LDZH12 LDZH 系列系列 立式压力蒸汽灭菌器操作方法立式压力蒸汽灭菌器操作方法1.打开控
10、制面板的电源开关。2.开启上盖,将纯水直接注入蒸发锅内至高水位灯亮起。3.将待灭物品放入锅内。4.盖上锅盖，设定好温度，一般默认程序为121 摄氏度 20min，机器进入自动灭菌循环程序。5.灭菌结束后，锅内无压力，打开下方排气阀，逆时针转动手轮，开盖。1313 电加热蒸汽锅炉（蒸汽发生器）操作方法电加热蒸汽锅炉（蒸汽发生器）操作方法1.接通电源，合上开关，打开控制面板的电源键。2.检查水位和后水箱水位是否足够，按下启动键启动，待锅炉压力达到0.4MP 时，缓慢打开后面出蒸汽阀门使用。1414 发酵罐看罐发酵罐看罐1.接种后保持罐压 0.05，风量 0.1，转速 200 温度 37ph7.0，
11、调整好 DO 100%。2.待加碱量变化很快时，补加另一半的糖，并提高转速400，提高风量至 0.2vvm。3.发酵液便黏后可适当提升转速和通风量。4 发酵不耗碱，残糖小于5g/l 可以放罐。1515 超净工作台操作方法超净工作台操作方法1、作业前准备：首先检查电源插头是否可靠地插入插座中，然后打开位于右下侧的“总电源开关”。再按动“风机开关”启动风机进入“标准运行状态（中速）”。再连续按动“照明/杀菌开关”打开紫外灯。运行二十分钟。在正式作业前关闭紫外灯。2、正式作业正式作业时，按动“照明开关”开启日光灯。作业结束时，保持风机运行十分钟后。关闭风机开关，关闭照明开关。16.16.革兰氏染色法
12、革兰氏染色法革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。2）草酸铵结晶紫染 1 分钟。3）自来水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染1 分钟。5）水洗，用吸水纸吸去水分。6）加 95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30 秒后水洗，吸去水分。7）蕃红染色液（稀）染10 秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。17.17.芽孢染色法芽孢染色法（1）取等量破伤风杆菌厌氧培养菌液和5%孔雀绿水溶液，放入小试管中充分混合，沸水浴 20min;取上述混合液涂片、干燥、固定;（2）用 1%沙黄液复染 10min，水冲洗;（3）干
13、后镜检。（4）镜下，破伤风杆菌的菌体染成红色，芽胞染成绿色。传统的方法是滴加石炭酸复红染液于涂片上并弱火加热，使染液冒蒸汽约 5min，此法染液用量大，且容易污染衣物和实验台。现改为菌液和染液混合水浴加热初染，然后制备涂片、固定、复染，即节约时间，染液消耗又少，且菌体、芽胞对比鲜明。18.荚膜染色法荚膜染色法荚膜染色法（1）取菌涂片、干燥、固定;（2）染色:用石炭酸复红染液染 1min，水冲洗;95%酒精脱色 5s 水冲洗;20%鞣酸溶液媒染 10min 水冲洗;0.8%孔雀绿溶液染色 1min，水冲洗;（3）吸干后镜检。（4）镜下，菌体染成红色（成双排列），荚膜染成绿色，存在于菌体的周围。传
14、统的荚膜染色是用结晶紫染液染色，菌体染成紫色，荚膜染成淡紫色或无色，菌体和荚膜之间反差小，不易分辨。改良后，增加了脱色、媒染、复染的步骤，使菌体和荚膜之间反差增大，易于观察。1919 摇床使用注意事项摇床使用注意事项1、仪器放置要平整，环境应清洁整齐，干燥通风。2、为避免仪器产生较大的振动，装瓶时应分布均匀，避免偏载现象出现，各瓶的培养液应大致相等。如非必要情况下试瓶不应装载过满，以免影响气流循环从而降低工作室的温场的均匀度。3、使用结束后清理机器，不能留有水滴，污物残留。2020 镜检操作注意事项镜检操作注意事项1、观察时要注意物镜与样品的距离，不要压到样品。2、目镜物镜需用专用的擦镜纸擦拭
15、。3、使用油镜后，应尽快用擦镜纸蘸95%酒精擦干净，以防时间长了污染镜头不好清洗。2121 菌种筛选依据菌种筛选依据（1）菌落特征：圆圆的透明的雨滴状。（2）镜捡：单个球菌或多个链球状，无杂菌。（3）分析各菌株OD 值，残糖，粘度，透明质酸产量，乳酸含量等参数，选取残糖乳酸低，OD 值高、粘度、透明质酸产量高的菌株。（4）选出的菌种上实验罐验证实际产量。2222 菌种室如何保证无菌环境菌种室如何保证无菌环境（1）菌种室四周地面应保持干净，防止起尘。室内要做到干干净净,物品摆放整齐有序。（2）每天下班后用 0.25%双氧水或其它消毒液拖地一次，两药（或几种药）隔天轮换使用。（3）每周进行大扫除一
16、次，墙面、平台、药品架先用清水擦拭干净，再用药水擦拭。并开紫外灯照射30 分钟。药水种类每周更换一次，平时要常用药水擦拭桌面。（4）菌种室应保持干燥，定期开启去湿机并输入无菌空气。2323 实验罐空消灭菌操作步骤实验罐空消灭菌操作步骤1 第一阶段：打开系统设置中的灭菌控制，并点上自动控制，利用夹套升温至98 摄氏度，同时进行过滤器灭菌。2 第二阶段：关闭夹套进汽，夹套排污，打开两路蒸汽（进风口，罐底出料口）升温至134 摄氏度，并注意保持罐内压力和温度相匹配。3 第三阶段：保持温度 134 摄氏度 30min。4 第四阶段：关闭所有蒸汽阀门，取消系统设置中的灭菌控制，使罐内温度自然降至室温。2
17、424 实验罐实消灭菌操作步骤实验罐实消灭菌操作步骤1 关紧罐底阀，将配制好的培养基倒入罐内，关闭进风阀、加热器进水阀，开排污阀2 打开系统设置中的灭菌控制，并点上自动控制，利用夹套升温至98 摄氏度，同时进行过滤器灭菌。3 关闭夹套进汽，夹套排污，打开两路蒸汽（进风口，罐底出料口）升温升至 121 摄氏度，同时打开冷凝水进水阀门，并注意保持罐内压力和温度相匹配。4 保持温度 121 摄氏度 20min。5 关闭所有蒸汽阀门和罐底阀门，打开进风阀门使罐内温度自然冷却降温至112 摄氏度，打开加热器进水阀门，自动降至接种所需温度，同时保证罐内不失压。2525 上罐菌种培养步骤上罐菌种培养步骤（1）培养基的制作，按种子培养基配方称取药品用纯水溶解后，调 PH 至 7.0，装液量按 500ml 三角瓶 150ml，2000ml三角瓶装 1000ml 分装于三角瓶中，瓶口用纱布塞紧，用报纸包扎好灭菌，并注上日期及培养基类型。（2）待培养基自然冷却至室温后在超净工作台内通过无菌操作将菌源接种于培养基中。（3）将接种好的三角瓶放入37转速 150r/min 的摇床中培养 12-16h。（4）取样镜捡无杂菌即可作为上罐菌种。