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1、实验九实验九 土壤土壤(trng)微生物的分离与微生物的分离与计数计数 涂布平板法涂布平板法 第一页，共10页。一、实验一、实验(shyn)目目的的 1、学习利用平板分离法从土壤分离微生物的基、学习利用平板分离法从土壤分离微生物的基 本操作本操作(cozu)。2、掌握微生物平板计数的方法。、掌握微生物平板计数的方法。第二页，共10页。二、实验二、实验(shyn)原原理理 n n土壤是微生物生活的大本营土壤是微生物生活的大本营n n 根据某微生物的生长条件（营养，酸碱度，温根据某微生物的生长条件（营养，酸碱度，温度，氧气等）而供给它适宜的培养条件，或加入某种度，氧气等）而供给它适宜的培养条件，或
2、加入某种抑制剂造成只利于该菌生长，而抑制其他抑制剂造成只利于该菌生长，而抑制其他(qt)菌生菌生长；用稀释涂布平板法获得单菌落（并不能绝对保证长；用稀释涂布平板法获得单菌落（并不能绝对保证是纯培养，需要结合观察其菌落特征、个体特征，进是纯培养，需要结合观察其菌落特征、个体特征，进一步分离纯化）。一步分离纯化）。稀释到适量浓度稀释到适量浓度 倾注或涂布平板倾注或涂布平板 培养培养 菌落计数菌落计数 第三页，共10页。样品样品(yngpn)充分充分混匀；混匀；同一稀释度三个以上同一稀释度三个以上(yshng)重复，重复，取平均值；取平均值；每个平板上的菌落数目合适每个平板上的菌落数目合适(hsh)
3、，便于准确计数。便于准确计数。第四页，共10页。一般用菌落形成单位（一般用菌落形成单位（colony forming units，CFU）来表示）来表示(biosh)原样品中的细胞数。原样品中的细胞数。第五页，共10页。三、实验三、实验(shyn)材料材料1 1、土样：选择某一生境土壤，去表层土，挖、土样：选择某一生境土壤，去表层土，挖、土样：选择某一生境土壤，去表层土，挖、土样：选择某一生境土壤，去表层土，挖520cm520cm深度深度深度深度 的土壤数的土壤数的土壤数的土壤数10g10g，装入已灭菌的牛皮纸袋。，装入已灭菌的牛皮纸袋。，装入已灭菌的牛皮纸袋。，装入已灭菌的牛皮纸袋。2 2、
4、培养基、培养基、培养基、培养基:牛肉膏蛋白胨培养基：细菌牛肉膏蛋白胨培养基：细菌牛肉膏蛋白胨培养基：细菌牛肉膏蛋白胨培养基：细菌淀粉琼脂培养基（高氏淀粉琼脂培养基（高氏淀粉琼脂培养基（高氏淀粉琼脂培养基（高氏1 1号）：放线菌号）：放线菌号）：放线菌号）：放线菌每每每每300ml300ml培养基加入培养基加入培养基加入培养基加入1ml3%1ml3%的重铬酸钾抑制细菌和霉菌的重铬酸钾抑制细菌和霉菌的重铬酸钾抑制细菌和霉菌的重铬酸钾抑制细菌和霉菌(mjn)(mjn)生长生长生长生长马丁氏培养基：真菌马丁氏培养基：真菌马丁氏培养基：真菌马丁氏培养基：真菌孟加拉红抑制细菌和放线菌孟加拉红抑制细菌和放线
5、菌孟加拉红抑制细菌和放线菌孟加拉红抑制细菌和放线菌第六页，共10页。1、倒平板、倒平板2、土壤、土壤(trng)菌悬液的制备菌悬液的制备 四、实验四、实验(shyn)方法方法 10g土样土样+90ml无菌水无菌水 振荡振荡(zhndng)20min3、梯度稀释、梯度稀释 取取1ml土壤菌悬液土壤菌悬液移入含移入含9ml无菌水的试管中，吹吸均匀，为无菌水的试管中，吹吸均匀，为稀释稀释10倍的样品，依次进行梯度稀释倍的样品，依次进行梯度稀释10-110-6第七页，共10页。分离对象分离对象分离对象分离对象 稀释度稀释度稀释度稀释度 分离方法分离方法分离方法分离方法 细菌细菌细菌细菌 1010-6-
6、6 、1010-7-7、10 10-8-8 0.1ml0.1ml菌悬液，涂布法分离菌悬液，涂布法分离菌悬液，涂布法分离菌悬液，涂布法分离 放线菌放线菌放线菌放线菌 1010-4-4、1010-5-5、10 10-6-60.1ml0.1ml菌悬液，涂布法分离菌悬液，涂布法分离菌悬液，涂布法分离菌悬液，涂布法分离 霉菌霉菌霉菌霉菌 1010-2-2、10 10-3-3、10 10-4-4 0.1ml0.1ml菌悬液，涂布法分离菌悬液，涂布法分离菌悬液，涂布法分离菌悬液，涂布法分离 4、涂布：取、涂布：取0.1ml适当适当(shdng)浓度的稀释液涂布于相应平板，每个浓度的稀释液涂布于相应平板，每个
7、 稀释度做稀释度做3个平行，每种菌需要做个平行，每种菌需要做9块平板，及时块平板，及时 标记，涂布后静置标记，涂布后静置10分钟。分钟。第八页，共10页。5、培养、培养 将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于30培养箱中培养培养箱中培养3-5d。6、计数、计数7、挑菌（纯化）、挑菌（纯化）将培养后长出的单菌落将培养后长出的单菌落(jnlu)数量、形态、培养特征进数量、形态、培养特征进行观察，分别挑取单菌落行观察，分别挑取单菌落(jnlu)于相应平板上划线、分离，于相应平板上划线、分离，培养，检查菌落培养，检查菌落(jnlu)是否一致、单纯（也可以用显微镜涂是否一致、单
8、纯（也可以用显微镜涂片染色镜检是否是单一的微生物），如有杂菌需进一步纯化、片染色镜检是否是单一的微生物），如有杂菌需进一步纯化、分离。分离。每毫升菌落形成单位同一稀释每毫升菌落形成单位同一稀释(xsh)度的三次重复平均数度的三次重复平均数稀释稀释(xsh)倍倍数数 5第九页，共10页。平板平板(pngbn)计计数数五、思考题五、思考题1 1、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行(jnxng)(jnxng)活菌计数活菌计数活菌计数活菌计数的结果。的结果。的结果。的结果。平板平板中的中的CFUCFU数
9、数重复重复1 12 23 3平平均均1 12 23 3平平均均1 12 23 3平平均均稀释度稀释度细菌细菌10-410-410-510-510-610-6稀释度稀释度放线菌放线菌10-210-210-310-310-410-4稀释度稀释度真菌真菌10-210-210-310-310-410-4 每克含菌样品中细菌每克含菌样品中细菌每克含菌样品中细菌每克含菌样品中细菌/放线菌放线菌放线菌放线菌/真菌真菌真菌真菌 活细胞活细胞活细胞活细胞(xbo)(xbo)数数数数 （同一稀释度平板上菌落平均数（同一稀释度平板上菌落平均数（同一稀释度平板上菌落平均数（同一稀释度平板上菌落平均数 10 10稀释倍数）稀释倍数）稀释倍数）稀释倍数）含菌样品克数含菌样品克数含菌样品克数含菌样品克数第十页，共10页。