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1、离子交换层析ionexchangechromatography Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、原理一、原理离离子子交交换换层层析析是是用用离离子子交交换换剂剂（具具有有离离子子交交换换性性能能的的物物质质）作作固固定定相相，利利用用它它与与流流动动相相中中的的离离子子能能进进行行可可逆逆的的交交换换性性质质来来分分离离离离子型化合物的层析方法。子型化合物的层析方法。即即溶溶液液中中的的离离子子同同离离子子交交换换剂剂上上功功能能基基团团交换反应
2、交换反应的过程。的过程。带带电电荷荷量量少少，亲亲和和力力小小的的先先被被洗洗脱脱下下来来，带带电电荷荷量量多多，亲亲和和力力大大的的后后被被洗脱洗脱下来。下来。离子交换过程示意：离子交换过程示意：起始起始吸附吸附解吸解吸完成完成x+:起始缓冲离子起始缓冲离子y+：待分离离子待分离离子z+：待分离离子待分离离子二、离子交换剂的种类二、离子交换剂的种类在在惰惰性性载载体体上上引引入入带带有有电电荷荷的的活活性性基基团团即即离子交换剂。离子交换剂。（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子交换剂带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离
3、子交换剂带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换（二）按载体种类不同（二）按载体种类不同1.离子交换树脂离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂：主要有聚苯乙烯树脂苯苯乙乙烯烯+二二乙乙烯烯苯苯聚聚苯苯乙乙烯烯（单体）（交联剂）（单体）（交联剂）二乙烯苯二乙烯苯交联度交联度=100%苯乙烯苯乙烯+二乙烯苯二乙烯苯交交联联度度大大，网网孔孔变变小小，大大分分子子量量的的离离子子不不能进入树脂颗粒内发生离子交换。能进入树脂颗粒内发生离子交换。在不影响分离的情况下，以采用在不影响分离的情况下，以采用交联度较交联度较高高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性的选择性。
4、目数目数：离子交换树脂的颗粒直径大小：离子交换树脂的颗粒直径大小Dowex50为为20-50目目Dowex20840 m50297 m100149 m（代表二乙烯苯的百分含量）代表二乙烯苯的百分含量）树脂树脂resin（据所含交换基团的性质分）据所含交换基团的性质分）阳离子交换树脂阳离子交换树脂强酸型强酸型含磺酸基团含磺酸基团(R-SO3H)中等酸型中等酸型含磷酸基团含磷酸基团(-O-PO2H4)弱酸型弱酸型含酚基、羧基含酚基、羧基阴离子交换树脂阴离子交换树脂强碱强碱含季胺基团含季胺基团-N+(CH3)3弱碱弱碱含叔胺、伯胺基团含叔胺、伯胺基团-N(CH3)2阴阴离离子子交交换换树树脂脂对对化
5、化学学试试剂剂及及热热都都不不如如阳阳离离子交换树脂稳定。子交换树脂稳定。2.离子交换离子交换纤维素纤维素阴阴离离子子交交换换纤纤维维素素如如:DEAE-纤纤维维素素pH8.6以以下下分分离离中中性性或或酸酸性性物物质质,具具二二乙乙胺乙基胺乙基阳离子交换纤维素阳离子交换纤维素如如:CM-纤维素纤维素一般一般pH4条件下使用条件下使用,具有羧甲基具有羧甲基3.离子交换凝胶离子交换凝胶分离大分子物质分离大分子物质如如：葡葡聚聚糖糖（Sephadex）、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺（PAG）、）、琼脂糖（琼脂糖（Sepharose）三、操作注意点三、操作注意点（一）离子交换剂的选择（一）离子交换剂的选择原
6、原则则：根根据据被被分分离离物物质质的的性性质质选选择择同同一一性性质质离离子子交交换换剂剂中中选选用用对对被被分分离离物物质质各各组组分分之之间间结结合合力力差差异异大大的的型型号号交交换换剂剂，以以保保证证通通过过离离子子交交换换层层析析后后能能得得到到比比较较满满意意的的结结果。果。考虑因素：考虑因素：1.被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素3.被分离物质所处的环境被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量被分离物质的大
7、概数量根据分离过程的实验条件根据分离过程的实验条件强酸强碱强酸强碱应用广泛应用广泛弱酸型弱酸型只能在碱性只能在碱性pH范围内使用范围内使用弱碱型弱碱型只能在酸性只能在酸性pH范围内使用范围内使用（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择原原则则：不不能能发发生生化化学学反反应应，所所带带电电荷荷应应与与样样品一致。避免使样品变性品一致。避免使样品变性(三三)洗脱剂洗脱剂原原则则：所所用用洗洗脱脱液液比比吸吸着着物物质质具具有有更更活活泼的离子或基团泼的离子或基团改变改变pH或离子强度或离子强度增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交
8、换剂的结合力洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱四、应用四、应用分分离离多多肽肽蛋蛋白白、氨氨基基酸酸、核核酸酸及及其其他他带电的生物分子带电的生物分子离子交换层析法分离氨基酸及测定离子交换层析法分离氨基酸及测定原理原理 所所用用样样品品为为天天冬冬氨氨酸酸和和组组氨氨酸酸的的混混合合液液，分分别别属属酸酸性性氨氨基基酸酸(pI2.77)pI2.77)、碱碱性性氨氨基基酸酸(pI7.59)pI7.59)，用用 强强 酸酸 型型 阳阳 离离 子子 交交 换换 树树 脂脂Dowex50，在在一一定定的的洗洗脱脱条条件件下下洗洗脱脱，将将它它们们分分离离。利利用用氨氨基基酸酸可可与与茚茚三三酮酮反反
9、应应生生成成有有色化合物进行氨基酸鉴定。色化合物进行氨基酸鉴定。紫色物质，用于紫色物质，用于氨基酸的比色测定和纸层析显色氨基酸的比色测定和纸层析显色与水含茚三酮的反应：与水含茚三酮的反应：AspHispH4.2pH10器材器材1.层析柱等层析柱等2.2.沸水浴沸水浴试剂试剂Dowex500.1mol/LNaOHpH4.2柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液样品液：氨基酸混合液样品液：氨基酸混合液茚三酮混合液茚三酮混合液操作操作1 1、层层析析：将将Dowex50装装柱柱后后，用用0.1mol/LNaOH清清洗洗树树脂脂5分分钟钟。再再用用pH4.2柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液平平衡衡10分分钟钟。（方方法法同
10、同凝凝胶胶层层析析法法）加加样样8滴滴。当当样样品品进进入入树树脂脂后后，加加入入pH4.2柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液洗洗脱脱加加样样后后立立即即收收集集，每每管管收收集集3ml（控控制制流流速速15滴滴/分分钟钟）。当当第第一一峰峰一一出出现现，换换用用0.1mol/LNaOH作作洗洗脱脱液液，直直至至第第二二峰峰收收集集完完毕毕。用用pH4.2缓缓冲冲液液再再平平衡衡10分钟，再生。分钟，再生。2 2、检检测测：从从第第2管管起起每每收收集集管管中中加加入入2ml茚茚三三酮酮显显色色液液，充充分分混混合合，沸沸水水浴浴15分分钟钟，自自来来水水冷冷却却，观观察察氨氨基基酸酸与与茚茚三三酮酮的的显显色色反反应应，若若生生成成紫紫色色化化合合物物，则则说说明明收收集集到到氨氨基酸。基酸。OperationofacationexchangecolumnfortheseparationoftheaminoacidsAsp,SerandLys.SeparationofaminoacidsonacationexchangecolumnDifferenttypesofionexchangeresins(a)Cationexchanger(b)Anionexchanger.