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1、实验实验12-12-质粒质粒DNADNA的提取的提取1.实验目的2.实验原理 3.实验仪器、材料与试剂 4.实验步骤 5.实验结果及讨论（二）材料 l含重组质粒的大肠杆菌。（三）试剂 l1.LB液体培养基（1L）胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。lLB固体培养基（1L）在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。l2.Solution 50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)
2、高压灭菌后，4保存备用。l3.Solution(现用现配制)0.2mol/LNaOH1%SDS4.Solution（100ml）5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml 配制成的溶液含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸 （pH4.8）。5.氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存备用。6.胰胰RNA酶酶l将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。7.氯仿，乙醇氯仿，乙醇，70%乙醇
3、乙醇。8.TE缓冲液10mMTris.HCl(pH7.4)1mMEDTA(pH8.0)实验步骤实验步骤 l1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液体培养基（含Amp0.1mg/ml）中，37振荡培养过夜。l2.将菌液倒入1.5mlEppendorf管中，12,000rpm离心2min，去掉上清液。将EP管口朝下，用滤纸吸干水分。l3.沉淀悬于100LSolutionI中,涡旋使充分悬浮，盖子打开，室温放5分钟。l4.加入200LSolutionII，混匀（注意动作轻），冰浴5分钟。l5.加入1LRNase和150LSolutionIII，上下颠倒5-10次，冰浴10分钟。l6.12,000
4、rpm，离心5min，将上清移至1个新EP管中，注意所取体积。l7.加入2倍体积无水冰乙醇混匀（注意动作轻），-20沉淀10min。l8.12,000rpm离心3min，弃上清，加入1ml70%乙醇振荡漂洗一次，再10000rpm离心2min，去上清。l9.沉淀于-20保存备用。lBiospin质粒DNA小量提取试剂盒（实际实际用）用）ll操作过程操作过程l1.将11.5ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中。l2.于10，000rpm离心30秒，并弃去上清液。l如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。l3.加250lResuspension
5、Buffer，重悬细菌体沉淀。l重悬后应该没有细菌团块。l4.加250l细胞LysisBuffer，轻柔颠倒46次。l不要剧烈振动，以防止基因组DNA被剪切。注意不要让反应持续超过5分钟。l5.加350lNeutralizationBuffer，立即轻柔颠倒离心管46次。l溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。l6.于13,000rpm离心10分钟。l如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。l7.将步骤6离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1分钟，并弃去接液管内液体。l8.向Spin column 内加650lWashBuffer，于12
6、，000g离心3060秒，并弃去接液管内液体。l9.重复第8步一次。l10.再次于12，000rpm离心1分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。l11.向Spin column 内加20lElutionBuffer、去离子水或TE溶液，并于室温静置1分钟。l可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。l12.于12，000rpm离心1分钟，1.5ml离心管内溶液中含有质粒DNA。l13.提取的质粒DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20。实验结果及讨论 l碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。法之一，提取量较大，便于操作。l如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！21