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1、真核生物基因组DNA的提取、电泳 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望考试形式 实验成绩考核占总成绩实验成绩考核占总成绩40%，满分为，满分为40分分。缺缺实验实验课课成成绩绩者，本者，本课课程不予通程不予通过过。随堂考随堂考试（1010分）分）(主要考察理论课与实验课结合内容)闭卷考卷考试（1515分分)(实验方法及原理、实验结果及注意事项、仪器设备操作及注意事项和对失败结果的原因的分析)实验设计（1515分）分）(实验名称、实验目的、方法和步骤预期实
2、验结果、关键问题讨论及参考文献)实验课安排实验一实验一 基因组基因组DNADNA的提取的提取实验二实验二 PCRPCR及琼脂糖凝胶电泳检测及琼脂糖凝胶电泳检测实验三实验三 PCRPCR产物的限制性酶切片段分析产物的限制性酶切片段分析实验四实验四 总总RNARNA的提取及逆转录的提取及逆转录实验五实验五 PCRPCR产物的产物的TATA连接连接实验六实验六 转化转化实验七实验七 质粒的提取、酶切鉴定质粒的提取、酶切鉴定实验八实验八 讨论及实验课考试讨论及实验课考试实验课安排1.1.提取基提取基因组因组DNADNA重组质粒6.连接产物转化无质粒的E.Coli 死亡有质粒的E.Coli 存活2.PC
3、R获取目的基因7.重组质粒提取及酶切鉴定质粒5.TA 连接4.RNA提取与逆转录T载体平板筛选一、加样器的使用及注意事项一、加样器的使用及注意事项 1 1、用途用途 2 2、使用使用2.1 2.1 根据取样量，选择合适的加样器。根据取样量，选择合适的加样器。5 5ulul、50ul50ul、500ul500ul，应选择哪个加样器应选择哪个加样器?顶部标有加样器的顶部标有加样器的最大量程，最大量程，分别为：分别为：20ul:20ul:0.50.5 20 20 l l100/200ul:20100/200ul:20 100/200 100/200 l l 1000ul:200ul1000ul:20
4、0ul 1000 1000 l l 实验仪器的使用及注意事项实验仪器的使用及注意事项练习：加样器读数为练习：加样器读数为练习：加样器读数为练习：加样器读数为 10100 0，实际体积各为多少，实际体积各为多少，实际体积各为多少，实际体积各为多少?2.2 2.2 如何调节如何调节？(1)(1)首先观察目前读数首先观察目前读数,假设为假设为050:050:1000 1000 l:500 l:500 l l 100 100 l:50 l:50 l l 20 20 l l：5 5 l l (2)(2)顺时针调节顺时针调节-读数变小读数变小 逆时针调节逆时针调节-读数变大读数变大(3)(3)注注意意：调
5、调节节前前加加样样器器读读数数正正处处于于最最大大量量程程或或最最小小量量程程时时，如如果果向向错错误误方方向向调调节节，马马上上会会超超出出量量程程，将将会损害加样器的精度会损害加样器的精度。2.3 2.3 加样器使用步骤加样器使用步骤(示教及学生练习示教及学生练习)：6 6）(吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！流损坏加样器！)贴容器内壁，将液体贴容器内壁，将液体匀速匀速打出，加样器推到打出，加样器推到第二挡。第二挡。观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内.5 5
6、）抬起加样器）抬起加样器,估计体积是否正确估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回将外壁液体用容器口引流回去去4 4）缓慢松开拇指）缓慢松开拇指,吸取液体。松开过快，液体上吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器冲会腐蚀加样器;完全放开拇指后，停留约半秒完全放开拇指后，停留约半秒钟钟,急于离开液面，容易吸入空气。急于离开液面，容易吸入空气。3 3）将吸头插入液面下适当）将吸头插入液面下适当深度深度，过深可能会腐，过深可能会腐蚀加样器蚀加样器,过浅可能会吸入空气。过浅可能会吸入空气。2 2）吸取液体前，先打到）吸取液体前，先打到第一挡。第一挡。1 1）选择加样器）选择加样器,观察读数观察读数,
7、调节读数，吸头的安调节读数，吸头的安装要装要紧密紧密。不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下 1 1、打开电源、打开电源 2 2、离心管中的液体为、离心管中的液体为2/3,2/3,盖紧盖紧盖子盖子,防止离心机被腐蚀。防止离心机被腐蚀。二、离心机的使用注意事项二、离心机的使用注意事项 1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。3 3、样品、样品配平配平,对称放入对称放入离心机离心机(管的连接处朝外管的连接处朝外).).4 4、设定离心时间、设定离心时间(如设定如设定2 2分钟，可定时多点时间，分钟，可定时多点时间，再用手表记时再用手表记时)。5 5、统一离心统一离心，逐渐升到，逐渐升到要
8、求转速。要求转速。实验一、真核生物基因组实验一、真核生物基因组DNADNA的提取和电泳的提取和电泳一、一、实验背景实验背景 高等生物的基因组相当宠大。高等生物的基因组相当宠大。真核细胞基因组约含万个结构基因，其它大量存在的是真核细胞基因组约含万个结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的调控的
9、研究是至关重要的研究的起点就是要获得纯度高不含蛋白质、糖类、酚、研究的起点就是要获得纯度高不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好以便有足够量用于分析；基因组相氯仿等污染；得率好以便有足够量用于分析；基因组相对完整不断裂的基因组以便用于以后对完整不断裂的基因组以便用于以后PCR分析，分析，RFLPRFLP分分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。析，基因文库的构建，基因探测等的研究。掌握小鼠肝脏组织模板掌握小鼠肝脏组织模板DNADNA的提取技术。的提取技术。学习学习DNADNA琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。第一部分第一部分 ：肝组织制备、蛋白酶：肝组织制备、蛋白酶k
10、k消化消化第二部分第二部分:酚氯仿抽提、乙醇沉淀酚氯仿抽提、乙醇沉淀第三部分：第三部分：DNADNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳三、实验材料三、实验材料 小鼠肝脏组织小鼠肝脏组织四、主要试剂（稍后讲解）四、主要试剂（稍后讲解）二、二、实验目的实验目的 五、实验步骤（马上讲解）五、实验步骤（马上讲解）1 1.取新鲜小鼠肝组织（约取新鲜小鼠肝组织（约300-500mg300-500mg），小米粒大小，小米粒大小，组织块不宜过大组织块不宜过大,放在毛玻璃片上立即研磨放在毛玻璃片上立即研磨,研磨要研磨要彻底。彻底。2.2.将研磨后的肝组织转移至加有将研磨后的肝组织转移至加有460 460 l NEl
11、NE溶液的溶液的EPEP管中，管中，混匀。混匀。实验第一部分实验第一部分 小鼠肝组织的制备、蛋白酶小鼠肝组织的制备、蛋白酶K K消化消化注意事项注意事项 组织磨得越细越好。组织磨得越细越好。细胞中含有大量的细胞中含有大量的DNADNA酶，因此，第一步的操作（酶，因此，第一步的操作（EDTAEDTA：抑：抑制酶活性）应迅速，以免细胞裂解，释放出制酶活性）应迅速，以免细胞裂解，释放出DNADNA酶，使酶，使DNADNA降解。降解。注意事项：注意事项：离心时离心机内样品平衡后对称放置离心时离心机内样品平衡后对称放置加样器加样准确。加样器加样准确。加样器使用提示：（1）吸头的安装要紧密。（2）打到第一
12、挡，将吸头插入液面下适当深度（3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（4）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出。3.3.1000 r/m,1000 r/m,离心离心5min 5min(统一离心统一离心)，将上层细胞悬液转移，将上层细胞悬液转移至另一至另一EPEP管中，用管中，用NENE溶液补足至溶液补足至500 500 l l，弃掉下层大块，弃掉下层大块的组织沉淀。的组织沉淀。4.4.加加30 30 l 10%SDS,l 10%SDS,迅速混匀。迅
13、速混匀。5.5.加加50 50 l l 蛋白酶蛋白酶K(20mg/ml),K(20mg/ml),混匀，置混匀，置5050水浴水浴5050minmin。一、核酸提取的主要步骤一、核酸提取的主要步骤真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步:1)1)破碎细胞破碎细胞2)2)去除蛋白质，糖类等等生物大分子去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞；由于真核细胞基因组较大，在纯化出的基因组较大，在纯化出的DNADNA的操作中应注意动作轻柔，的操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对DN
14、ADNA的剪切，从而获得相对完整的的剪切，从而获得相对完整的DNADNA3)3)沉淀核酸沉淀核酸乙醇沉淀SDS裂解蛋白酶K消化琼脂糖电泳PCRDNA提取步骤图解提取步骤图解酚氯仿抽提作用：作用：a a.阴离子型去污剂阴离子型去污剂阴离子型去污剂阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分，溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.b.使蛋白质变性使蛋白质变性 c.c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用成分：成分：N:NaCl 50mMN:NaCl 50mM E:EDTA.Na E:EDTA.Na2 2 25mM(PH:8.0)25mM(PH:8.0)作用：作用：金
15、属离子螯合剂，抑制金属离子螯合剂，抑制DNaseDNase的活性的活性 (螯合螯合DNaseDNase发挥活性所需的发挥活性所需的2 2价阳离子价阳离子)。二、各种试剂的作用二、各种试剂的作用1 1、NE NE 溶液溶液：2 2、SDS SDS：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 终浓度终浓度0.5%0.5%3 3、蛋白酶、蛋白酶K(K(或链霉蛋白酶或链霉蛋白酶)作用：作用：广谱蛋白酶，能在广谱蛋白酶，能在SDSSDS和和EDTAEDTA的存在下保持很高的活的存在下保持很高的活性，性，降解蛋白质，将降解蛋白质，将降解蛋白质，将降解蛋白质，将DNADNADNADNA游离。游离。游离。游离。重蒸酚重蒸酚
16、:酚的作用是变性蛋白质，而对酚的作用是变性蛋白质，而对DNADNA结构没有影响。结构没有影响。无色无色 酚的氧化产物酚的氧化产物(如醌等如醌等,粉红色粉红色)破坏磷酸二脂键。破坏磷酸二脂键。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。TETE溶液溶液:Tris-HCl 10mM(pH:8.0)Tris-HCl 10mM(pH:8.0)EDTA.Na EDTA.Na2 2 1mM (pH:8.0)1mM (pH:8.0)作用：提供略碱的作用：提供略碱的pHpH值，保证值，保证DNADNA溶于水相。溶于水相。在酸性条件下，在酸性条件下，DNADNA分配于有机相。分配于有机相
17、。8-8-羟基喹啉：羟基喹啉：0.1%0.1%黄色酚相指示剂黄色酚相指示剂 抗氧化剂抗氧化剂作作用用：去去除除蛋蛋白白等等杂杂质质。酚酚对对蛋蛋白白有有强强烈烈的的变变性性作作用用，可可使使样样品品中中的的蛋蛋白白质质变变性性，通通过过离离心心去去除除。为为防防止止其其对对后后续续实实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。4 4、TETE饱和重蒸苯酚：饱和重蒸苯酚：成分：成分：氯仿作用：氯仿作用：a.a.a.a.氯仿的变性作用不如酚好，氯仿的变性作用不如酚好，但与酚共同但与酚共同但与酚共同但与酚共同/交替使用可交替使用可交替使用可交替使用可增强去蛋白效果
18、增强去蛋白效果增强去蛋白效果增强去蛋白效果；b.b.氯仿有加速有机相和水相的分离、氯仿有加速有机相和水相的分离、氯仿有加速有机相和水相的分离、氯仿有加速有机相和水相的分离、去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；5 5、酚、酚/氯仿氯仿 6 6、氯仿、氯仿/异戊醇异戊醇 (24:1)(24:1)氯仿的作用：氯仿的作用：去除去除DNADNA水溶液中残留的微量酚。水溶液中残留的微量酚。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡
19、的产生。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNADNADNADNA发生沉淀发生沉淀发生沉淀发生沉淀。8 8、无水乙醇、无水乙醇 ：作用：提供作用：提供单价阳离子单价阳离子。7 7、醋酸钠：、醋酸钠：3 3M NaAc pH:5.2M NaAc pH:5.2v核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会
20、被变性。被变性。v最常用沉淀剂为最常用沉淀剂为1 1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、酸钠、NaClNaCl、氯化锂、氯化钾等氯化锂、氯化钾等v常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等1 1、加入加入580ul(580ul(等体积等体积)TE)TE饱和酚饱和酚,混匀混匀1 1min.10000rpm,2minmin.10000rpm,2min。(注意抽取下层酚相注意抽取下层酚相;轻柔混匀，避免轻柔混匀，避免DNADNA链断裂链断裂;);)实验第二部分、酚氯仿抽提实验第二部分、酚氯仿抽提DNADNA及
21、乙醇沉淀及乙醇沉淀5 5、加入、加入2-2.52-2.5倍体积无水乙醇（倍体积无水乙醇（1 1mlml）混匀后置混匀后置-70-70 沉淀沉淀10min10min。4 4、取取300ul300ul上清至一新管中，加入上清至一新管中，加入1/101/10体体 积（约积（约30ul30ul）醋酸钠于上清中充分混匀。醋酸钠于上清中充分混匀。3 3、将将400ul400ul上层水相移至一新管中。加入上层水相移至一新管中。加入400ul(400ul(等体积等体积)氯氯 仿仿-异戊醇，异戊醇，同上条件同上条件混匀后离心。混匀后离心。2 2、将、将500ul500ul上层水相上层水相移至一新管中，加入移至一
22、新管中，加入500ul(500ul(等体积等体积)酚酚/氯氯 仿，仿，同上条件同上条件混匀、离心。混匀、离心。(注意要尽量抽尽，又不可吸起注意要尽量抽尽，又不可吸起 酚相酚相)。注意事项：注意事项：1 1）本实验将用到的本实验将用到的TETE饱和重蒸苯酚、氯仿饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而是有机试剂，比水的比重大，而DNADNA溶解在水里，我溶解在水里，我们们总是取上清。总是取上清。；2 2）在在抽取完苯酚、氯仿等抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，有机试剂，不能将加样器不能将加样器平放或倒置平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，以防液体导流损坏加样器，加完样后立加完样后立
23、即弃掉加样器头。即弃掉加样器头。3 3）基因组基因组DNADNA由于太大，非常容易受机械剪切而断由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组裂，因此，为了得到完整的基因组DNADNA，尽量不要多尽量不要多次进行物理性操作。次进行物理性操作。一定要充分充分溶解沉淀7 7、加入、加入15 15 l l双蒸水，溶解沉淀，双蒸水，溶解沉淀，-20-20保存。保存。6 6、10,000 10,000 r/minr/min离心离心5min5min，吸弃上清、滤纸条吸干内壁液体吸弃上清、滤纸条吸干内壁液体(勿触及勿触及勿触及勿触及DNADNADNADNA沉淀沉淀沉淀沉淀)，3737孵箱干燥
24、至沉淀变透明。孵箱干燥至沉淀变透明。9 9 l l：进行：进行电泳电泳 6 6 l l：PCR PCR 模板（用于下次课实验）模板（用于下次课实验）弃上清弃上清黄头黄头滤纸条滤纸条(吸干内壁液体吸干内壁液体)观察观察DNADNA沉淀的颜色。沉淀的颜色。离心离心实验第三部分、实验第三部分、DNADNA质量检测质量检测-琼脂糖电泳琼脂糖电泳 一、琼脂糖凝胶电泳原理一、琼脂糖凝胶电泳原理 DNA DNA分子在分子在 pH 8.0 pH 8.0 的电泳环境中，带负电荷，的电泳环境中，带负电荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。电电泳泳样样品品载载体
25、体琼琼脂脂糖糖是是一一种种线线性性多多糖糖聚聚合合物物，煮煮沸沸冷冷却却后后形形成成网网格格样样结结构构，电电泳泳中中起起分分子子筛筛作作用用。通通常常情情况况下下，分分子子量量大大的的DNADNA电电泳泳过过程程中中由由于于受受到到的的阻阻力力较较大大，泳泳动动速速率率较较慢慢，反反之之，分分子子量量较小的较小的DNADNA片段跑在前面。片段跑在前面。2.2.2.2.上样：上样：上样：上样：在样品中加在样品中加在样品中加在样品中加 1ul 101ul 101ul 101ul 10上样上样上样上样 液，混匀，加入上样内液，混匀，加入上样内液，混匀，加入上样内液，混匀，加入上样内各组按顺序上样各
26、组按顺序上样 二、二、琼脂糖凝胶电泳实验操作琼脂糖凝胶电泳实验操作1.1.制备琼脂糖凝胶电泳（制备琼脂糖凝胶电泳（制备琼脂糖凝胶电泳（制备琼脂糖凝胶电泳（1%1%1%1%）实验老师准备实验老师准备实验老师准备实验老师准备3.3.3.3.电泳：电泳：电泳：电泳：110110110110120V120V120V120V，30303030分钟分钟分钟分钟三、琼脂糖凝胶电泳常用试剂三、琼脂糖凝胶电泳常用试剂上样液成份：上样液成份：1 10.25%0.25%溴酚蓝或溴酚蓝或/和和0.25%0.25%二甲苯青（样品指示剂）二甲苯青（样品指示剂）2 240%40%蔗糖蔗糖 或或 30%30%甘油（增加样品比
27、重利于加样）甘油（增加样品比重利于加样）电泳缓冲液：电泳缓冲液：TAE TAE 为例为例 T:Tris T:Tris碱碱 A:A:冰醋酸冰醋酸 E:EDTAE:EDTA 提供有一定缓冲能力的提供有一定缓冲能力的pHpH值值(8.0),(8.0),EDTAEDTA可抑制可抑制DNaseDNase 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）：染色剂）：染色剂 一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNADNA或或RNARNA 的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。致癌剂致癌剂致癌剂致癌剂 线性线性DNADNA片断大小（片断大小
28、（kbkb）琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（%）5 60 0.4 0.8 10 0.7 0.4 6 1.0 0.2 4 1.5 0.2 3 1.75 0.1 3 2.0思考：思考：凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？四、四、琼脂糖凝胶的浓度琼脂糖凝胶的浓度五、五、电泳仪的使用方法电泳仪的使用方法稳压稳压:电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。如箭头所示。如箭头所示。六、预期结果六、预期结果 如果是如果是SmearSmear带，说明所提基因组带，说明所提基因组DNADNA的断裂现象严重。的断裂现象严重。1 2 3 4 5 ma
29、rker 1 2 3 4 5 marker理想结果理想结果思考题：思考题：思考题：思考题：1.1.1.1.本实验中所用到的各试剂的作用是什么本实验中所用到的各试剂的作用是什么本实验中所用到的各试剂的作用是什么本实验中所用到的各试剂的作用是什么?蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K,SDS,TE K,SDS,TE K,SDS,TE K,SDS,TE 饱和酚，氯仿饱和酚，氯仿饱和酚，氯仿饱和酚，氯仿,乙醇乙醇乙醇乙醇,EDTA,EDTA,EDTA,EDTA2.2.2.2.DNADNADNADNA提取过程中有哪些注意事项？提取过程中有哪些注意事项？提取过程中有哪些注意事项？提取过程中有哪些注意事项？实验结束后整理实验台实验结束后整理实验台,值日生值日值日生值日!预习：预习：预习：预习：1.PCR1.PCR1.PCR1.PCR的基本原理的基本原理的基本原理的基本原理2.PCR 2.PCR 2.PCR 2.PCR 的反应体系的反应体系的反应体系的反应体系3.PCR3.PCR3.PCR3.PCR引物设计原理及注意事项。引物设计原理及注意事项。引物设计原理及注意事项。引物设计原理及注意事项。下次实验课下次实验课 PCR PCR 扩增获得目的基因扩增获得目的基因