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1、临床基因扩增检验的临床基因扩增检验的质量保证质量保证卫生部临床检验中心卫生部临床检验中心 李金明李金明质质量保量保证证(Quality Assurance,QA)l为为一一产产品或服品或服务满务满足特定足特定质质量量要求提供充分要求提供充分可信性可信性所必要的所必要的有有计计划的和系划的和系统统的措施的措施。室内室内质量控制（量控制（Internal Quality Control,IQC)的概念的概念l由由实验室工作人室工作人员，采取一定的方法和步，采取一定的方法和步骤，连续评价本价本实验室工作的可靠性程度，旨在室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本和控制本实验室工作的精密度室工作的精密度，提
2、高本，提高本室常室常规工作中批内、批工作中批内、批间样本本检验的一致性，的一致性，以以确定确定测定定结果是否可靠、可否果是否可靠、可否发出出报告的告的一一项工作工作。l可概括可概括为:(1)(1)执行者行者：实验室技室技术人人员；(2)(2)目的目的：监测实验室室测定的重复性；定的重复性；(3)(3)功能功能：决定了当批决定了当批测定的有效性，定的有效性，报告可否告可否发出。出。是是对实验室室测定的定的即即时性性评价价。室室间质间质量量评评价（价（External Quality Assessment,EQA）l为为客客观观比比较较一一实实验验室室的的测测定定结结果果与与靶靶值值的的差差异异，
3、由由外外单单位位机机构构，采采取取一一定定的的办办法法，连连续续、客客观观地地评评价价实实验验室室的的结结果果，发发现现误误差差并并校校正正结结果果，使使各各实实验验室室之之间间的的结结果果具具有有可可比比性性。这这是是对对实实验验室室操操作作和和实实验验方方法法的的回回顾顾性性评评价价，而而不不是是用用来来决决定定在在实实时时的的测测定定结结果果的的可可接接受受性性。当当EQA用用来来为为执执业业许许可可或或实实验验室室认认证证的的目目的的而而评评价价实实验验室室操操作作时时，常常描描述述为为实实验验室室能能力力验验证证（Proficiency testing,PT）。在在以以前前的的文文献
4、献中，中，EQA常描述室常描述室间质间质量控制。量控制。批批(Run)l在相同条件下所在相同条件下所获得的一得的一组测定。定。定 义l正正态态分布分布(Gaussian distribution)当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，当测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。正态分布的基本统计学含义可用均数（X）、标准差（s）和概率来说明。临床基因扩增检验实验室常规测定步骤l标本收集：本收集：选择测定项目、标本收集和保存。l实验室室测定：定：标本接收
5、、贴标签、样本处理、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价值。l报告和解告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。质量保证、室内质控和室间质评之间的关系临床床标本收集、运送、保存本收集、运送、保存及其及其质量控制量控制 l标本收集本收集 l标本保存本保存l标本运送本运送 标本收集l标本采集本采集时间对扩增增检测结果的影响果的影响 l标本采集部位的准本采集部位的准备 l标本的本的类型和采集量型和采集量 l采采样质量的量的评价价 l采采样及运及运输容器容器 l标本采集中的防本采集中的防污染染 标本采集时间对扩增检测结果的影响l在疾病在疾病发展展过程中，程中，标本采集本采集过早或早或过晚都可能会
6、晚都可能会给出假阴性出假阴性结果。果。标本采集部位的准备l血液血液标本采集本采集l分分泌泌物物标本本:采采集集部部位位的的清清洁消消毒毒可可去去掉掉污染染的的微微生生物物或或其其它它杂物物,但但应适适度度,过度度清清洁消消毒毒有有可可能能会会去去掉掉或或破破坏坏靶靶微微生生物物,故故标本本采采集集部部位位的的准准备应由由训练有有素素的的人人员进行行。标本的类型和采集量l标本的本的类型型:血清血清(浆)、分泌物、痰、分泌物、痰、粪便、尿和便、尿和脑脊液等。脊液等。l标本的采集量本的采集量:应根据所根据所测病原体而定。病原体而定。一般来一般来说，如果，如果标本的量本的量对病原体培病原体培养养够用的
7、用的话，则其量亦足以用于核酸其量亦足以用于核酸提取及其后的提取及其后的扩增增检测。l对于定量于定量测定来定来说，对标本的收集要本的收集要求更求更为精确。精确。采样质量的评价l血清血清(浆)标本本:溶血、脂血等；溶血、脂血等；l分泌物、痰：分泌物、痰：评价内容包括价内容包括细胞胞组成，成，所需所需类型型细胞的数量和核酸胞的数量和核酸总量。量。评价方法：包括肉眼价方法：包括肉眼观察察,显微微镜下下观察察和化学分析等。和化学分析等。采样及运输容器 l标本的采集材料如棉本的采集材料如棉签应为一次性使一次性使用；用；l采采样及运及运输容器容器应为密密闭的一次性无的一次性无菌装置；菌装置；l采采样所用的防
8、腐所用的防腐剂、抗凝、抗凝剂及相关及相关试剂材料不材料不应对核酸核酸扩增及增及检测过程造程造成干成干扰。标本采集中的防本采集中的防污染染 l采集中要特采集中要特别别注意注意污污染，防止混入染，防止混入操作者的操作者的头发头发、表皮、表皮细细胞、痰液等；胞、痰液等；l 如使用玻璃器皿，必如使用玻璃器皿，必须经须经高高压灭压灭菌，菌，以使可能存在的以使可能存在的RNase失活。失活。标本保存本保存 l靶核酸靶核酸(尤其是尤其是RNA)易受核酸易受核酸酶酶的作用而迅速降解，因此的作用而迅速降解，因此标标本的本的保存保存对对于核酸于核酸扩扩增增测测定的有效性定的有效性极极为为重要。重要。l使用使用GI
9、TC作作为稳为稳定定剂剂保存保存标标本，本，标标本可在室温下本可在室温下稳稳定定约约7天。天。标本保存本保存l临床体液标本长期保存应在-70下。l如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)缓冲液中4 下保存。l用于RNA扩增分析的样本，则应于上述缓冲液中-80或液氮下保存。l核酸的乙醇沉淀物则可于-20下保存。标本运送本运送 l样样本一本一经经采集，采集，则应则应尽可能快的送至尽可能快的送至检检测实验测实验室。室。l样样本中如加入了适当的本中如加入了适当的稳稳定定剂剂,如用于如用于RNA测测定加入定加入GITC的血清的
10、血清(浆浆)样样本和用本和用于于DNA测测定的定的EDTA抗凝血等抗凝血等,则则可在室可在室温下运送或温下运送或邮邮寄。寄。l实验实验室室应应根据待根据待测测靶核酸的特性，靶核酸的特性，对对各各种种临临床床样样本的运送条件作出相本的运送条件作出相应应的的规规定定。临床基因床基因扩增增检验的室内的室内质量控制量控制l测定前的定前的质量控制量控制l核酸核酸样本的制本的制备及其及其质量控制量控制 l统计学学质量控制量控制l质量控制的量控制的评价价测定前质量控制l实验室室设施、施、仪器器设备及管理及管理l理想的理想的试剂和操作方法和操作方法 l人人员培培训实验室设施、仪器设备及管理l临床基因床基因扩增
11、增检验实验室室应有充分合理有充分合理的空的空间、良好的照明和空、良好的照明和空调设备 ；l实验室室仪器器设备应保养良好，保养良好，实验用品用品要达到相要达到相应的要求。的要求。加加样器的校准？器的校准？带滤塞吸塞吸头的使用及的使用及质检？离心机？离心机？热循循环仪？水浴箱和？水浴箱和/或恒温干浴或恒温干浴仪？酶标仪和洗板机？和洗板机？理想的核酸扩增实验室设计理想的核酸扩增实验室设计A产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区产物分析区
12、产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区理想的核酸扩增实验室设计理想的核酸扩增实验室设计B核酸核酸扩扩增增检测实验检测实验室室设计设计的一般原的一般原则则l各区独立l注意风向l因地制宜l方便工作“十六字口诀十六字口诀”门门试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区扩增区扩增区产物分析区产物分析区外走廊外走廊门门门门门门门门试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区扩扩增增及及产产物物分析区分析区外走廊外走廊门门门门门门门门AB试剂准备区试剂准备区
13、标本制备区标本制备区扩扩 增增 及及 产产物分析区物分析区门门门门门门门门空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向走廊走廊走廊走廊试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区扩增和产扩增和产物分析区物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室门试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区扩扩增增及及产产物分析区物分析区门门门空气流向空气流向空气流向空气流向+空气流向空气流向+走廊走廊试试 剂剂 准准 备备区区标标 本本 制制 备备区区扩增和产扩
14、增和产物分析区物分析区空气流向空气流向+空气流向+其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室空气流向产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区传递窗传递窗传递窗“无基因无基因”或或“无核酸无核酸”概念的重要性概念的重要性基因基因扩增增仪器器设备的的质控控带滤芯吸芯吸头的使用及的使用及质检l首先制备一个含12%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸头的最大体积为100l，则将加样器吸取体积调至110120l，
15、再套上吸头后吸取上述有色液体。如果吸头质量好，则有色液体不应出现在滤芯之上，否则说明滤芯不严。核酸提取用离心管质检l离心管离心管PCR抑制物抑制物质检质检l其他其他扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法l一是使用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示记录仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统，当孔间温度变异超出1时，其可测出来。l具体做法是将装有TE缓冲液并上加石蜡油的扩增反应管放置于扩增仪各孔中，热电偶探针透过扩增反应管盖插至缓冲液中，然后按程序进行一个常规的PCR扩增，加热模块如为96孔，则至少要测定12孔不同位置孔内的温度，在整个扩增过程中，可移动热电偶探针至上述不同孔中监测温度，但每一
16、孔内温度监测至少要有一个扩增周期。扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法l第二种方法并非直接测定孔内温度，而是通过扩增功能来间接获知孔间的均一性，即将加有一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测，观察结果的一致性程度，如果有某一个或几个孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性结果，如果是，则表明相应孔的热传导有损坏。理想的理想的试剂和操作方法和操作方法 l试剂盒的质检l定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平方根(SD)=上式中SDa、SDb、SDc是步骤a、b、c等（例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等）的标准差 理
17、想的试剂和操作方法l改善测定精密度的措施必须首先着重在最不精密的步骤上，应对试剂准备、标本收集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”(SOP)实验室质量管理体系的建立l质质量手册量手册l质质量体系程序文件量体系程序文件l标标准操作程序准操作程序(SOP)(相关相关记录记录表格、表格、报报告告)存在存在问题lSOP：形式，缺乏可操作性l记录：检查型。多而杂。l质控：形式或没有l分析：缺乏。实验室室质量管理的内涵量管理的内涵l写你所应做的l做你所写的l记录你已做的l分析你已做的l看得见的l看不见的l好习惯是生产力l习惯即命运l思维习惯与行为习惯l罗马不是一天建成的(Rome was n
18、ot built in a day)质量体系文件的三大特性量体系文件的三大特性l法法规性、唯一性和适用性。性、唯一性和适用性。l法法规性性:是指文件一旦制定完成并批准实施，就必须认真执行，按照相应的文件去完成日常检验工作，也就是前面所说的做你所写的。并且文件的修改不能随意，只能按规定的程序进行。l唯一性唯一性:则是指（1）一个实验室只能有一个质量体系文件系统；（2）一项检验活动只能有唯一的操作程序；（3）一项规定只能有唯一的理解，不产生歧义；（4）只能使用文件的有效版本，无效版本在实验室的任何地方都不能使用。l适用性适用性:是指质量体系文件无统一格式；无标准文本；怎么做怎么写，切合实际，具有可
19、操作性，不拘一格。所有文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到。当发现文件有不适合情况时，则应立即按规定程序对文件进行修改。SOP等于等于试剂盒盒说明明书吗？怎样编写SOP？XXX单位XXX实验室XXX标准操作程序编号：启用日期：版本：第 页 共 页一目的：二适用范围：三职责或责任人：四（方法原理）五（检测设备和试剂）六（所需的环境条件）七操作步骤：1 2 3 五、本操作程序变动程序：六、相关的文件七、相关的记录表格和报告编写人审核人批准人SOP（5W和和1H）l谁来做(Who)：责任人任人l做什么(What)：适用范适用范围l何时（When）：适用范适用范围l何地（Where）：适用
20、范适用范围l为什么做（Why）：目的目的l如何做（How）：操作步操作步骤实验记录表格的表格的设计存在存在问题l表格种类繁多l重复记录l表格无实用性，用于检查的痕迹很重记录表格表格设计的基本原的基本原则l信息充分l简单明了l临床标本的检测信息能有机联系起来l融入LIS系统？临床临床PCRPCR检验流程记录表检验流程记录表 检验日期检验日期 检验项目：检验项目：扩增仪中保存文件名：扩增仪中保存文件名：使用说明：使用说明：1本记录表须严格遵循试剂准备区标本制备区扩增区（产物分析区）单一流向移动，严禁逆向移动。2各项工作执行后，在相应叙述前的“”内打“”。3本记录表最后与相应的标本接收记录等归档保存
21、于扩增区的专用文件柜内，以备查找。实验前准备实验前准备 试剂在有效期内 扩增仪、加样器和温度计在校准的有效期内 生物安全柜的滤膜在使用有效期内 消毒溶液在有效期内 洗眼器内无菌生理盐水在有效期内 离心管、带滤芯吸头已经过质检合格 操作者操作者：试剂准备区（试剂准备区（1 1区）区）实验前实验前 ：打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）冰箱温度：冷藏室（28）；冷冻室（182）实验室温度：（允许范围：1030）；相对湿度：（允许范围：30%80%）PCR试剂来源：（可直接列出有关厂家名称）批号：XXXXXXX 检验项目：本次实验用量：人份，剩余量：人份。其他有关试剂配制：按XXX（将有
22、关SOP编号列出）SOP配制1%含氯消毒液 毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制4NaOH溶液 毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯 毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制 毫升；其他：仪器设备使用：仪器设备使用：离心机：正常 不正常 振荡器：正常 不正常 超净台：正常 不正常实实验验后后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外照射30分钟以上。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：操作者：标本制备区（标本制备区（2 2区）区）实验前：实验前：打开通风设备 实验台面清洁
23、（水或70%酒精擦拭）冰箱（柜）温度：冷藏室（28）；冷冻室（182）实验室温度：（允许范围：1030）；相对湿度：（允许范围：30%70%）阳性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置：阴性室内质控物来源：批号：扩增位置：所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：191725 334149 2101826 3442503111927 3543514122028 3644525132129 3745536142230 3846 5471523313947 5581624324048 56核酸提取及加样过程核酸提取及加样过程：按XXX（列
24、出编号）SOP进行。仪器设备使用：仪器设备使用：生物安全柜：正常 不正常 恒温仪温度校准：离心机：正常 不正常 振荡器：正常 不正常实验后：实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：操作者：扩增及产物分析区（扩增及产物分析区（3 3区）区）实验前实验前 打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）实验室温度：（允许范围：1030）；相对湿度：（允许范围：30%70%）扩增仪操作：开机自检及运行正常 按XXX（列出编号）SOP进行编程、参数设定标准曲线计算值：标准曲线计算值：Slope值值：（）
25、Intercept值值：（）r值值：（）室内质控结果：室内质控结果：结果：填写室内质控记录、描质控图 是否失控：是否失控：否 是 实验结果：实验结果：见所附扩增仪打印结果实验后：实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：操作者：失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按XXXSOP进行）另外两个存在另外两个存在较多多问题的档案的档案记录l人员的技术档案：一人一个档案（包括个人基本情况；学历、学位、任职资格、培训证、上岗证、荣誉证书等的复印件；论文、著作、成果等的目录和必要的证明文件复印件；培训考核
26、的记录等。）l仪器设备的技术档案：一台仪器一个档案（包括仪器基本情况，如仪器设备名称、型号、序列号、生产厂家、购置日期、启用日期、目前放置地点、责任人等；仪器校准的记录（本次校准日期和下次应校准的日期、校准证书或数据）；维修维护的历史记录；仪器使用说明书、注册证等的复印件；合格证书；配备的小配件如保险丝、灯泡等）人员培训 l方法原理l核酸扩增检测的关键环节l仪器设备使用、维护和校准l结果的分析、报告及进一步处理l质控的分析l知其然又知其所以然知其然又知其所以然。实验室人室人员内部培内部培训的重要性的重要性l外部培训提供的是“理念”，是被动的，更多的是“学习”l内部培训是主动的，源于实践，高于实
27、践，更多的是“思考”人人员培培训如何培如何培训的的举例：新例：新购仪器器设备的操作培的操作培训l在仪器购买合同中，加入培训的内容：厂家提供培训计划l培训计划应包括：培训教材（含具体培训内容，如仪器操作及维护校准的SOP、安全性）、培训者资质证明、培训所需时间与次数、需要接受培训方准备的条件（人员、用具和场地等）、培训合格的考核方法及判断标准等。l培训后保存所有有关记录。核酸核酸样本的制本的制备、扩增增检测及其及其质量控制量控制l一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理l核酸的分离纯化l靶核酸提取的质量 l临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 l核酸样本制备及扩增检测的质控 l产物检
28、测的质控 核酸的分离纯化 l核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。l经典方法l硅吸附法l对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 l临临床床标标本中：本中：血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。l核酸提取中：核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施l质质控措施：控措施：采用内采用内质质控控（i
29、nternal control,IC）（通常）（通常称称为为内内标标）的方法）的方法 l内内标标有两种有两种,即即竞竞争性的和非争性的和非竞竞争性的内争性的内标标。核酸提取及核酸提取及扩增有效性的增有效性的质控控 l已知弱阳性已知弱阳性质质控控样样本（基本（基质质与待与待测标测标本相本相同）：同）：至少带1份，其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测的有效性的综合反映。l已知阴性已知阴性质质控控样样本（基本（基质质与待与待测标测标本相同）：本相同）：至少带1份，扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染。室内室内质控方法控方法l非统计学方法l统计质控方法非非统计学方法学方法l在检测血液标
30、本的同时，检测一定数量（与临床样本的数量相适应）的已知弱阳性（与试剂宣称的测定下限相适应）和阴性的质控样本l检测有效的质控判断方法：阳性检测为阳性（反应性），阴性检测为阴性（非反应性）。统计学质量控制 l理想的室内质控样本的条件l测定中质控样本的设置、数量及排列顺序 l统计学质控的特点 l统计质控方法理想的室内质控样本的条件l基质与待测样本一致；l所含待测物浓度接近试验的决定性水平；l稳定；l靶值或预期结果已定；l无已知的生物传染危险性；l单批可大量获得；l价廉测定中质控样本的设置、数量及排列顺序l标本量不大，如少于30份，定性测定有1份接近cut-off的弱阳性和1份阴性质控样本应可以满足要
31、求。样本量大，则可按比例增加。l定量测定则要根据试验的测定范围，采用高、中、低三种浓度的质控样本。l核酸提取时，质控样本要随机放在临床标本中间。l至于在测定中的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。临床基因扩增检验室内质控的独特性l即监测污染发生的阴性质控的设置。l可包括1份阴性原血清样本、1份在标本核酸提取过程中带入的一个空管和仅含扩增反应混合液的管。阴性原血清阴性原血清质控控样本的功能本的功能 l监测实验室的以前扩增产物的污染；l由实验操作所致的标本间的交叉污染；l扩增反应试剂的污染。在标本核酸提取过程中带入的一个空管的功能l监测实验操作过程中的实验室污染和标本间交叉污染.l不
32、能取代原血清阴性样本。仅含含扩增反增反应混合液的管的功能混合液的管的功能l监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴别性。实验实验室是否室是否发发生生污污染的染的鉴别鉴别l可将一个或多个空管打开静置于标本制备区3060分钟，然后加入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混合液的管为阴性，则说明实验室以前扩增产物的存在。统计学质控的特点 l检验误差有两类，一是系统误差，一是随机误差。l系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移，是由操作者所使用的仪器设备、试剂、标准品或校准物出现问题而造成的，这种误差可以通过前述的措施方法加以控制，是可以排除的。l随机误差则表现为测定S
33、D的增大，主要是由实验操作人员的操作等随机因素所致，其出现难以完全避免和控制。统计学质控的功能l统计学质控的功能就是发现误差的产生及分析误差产生的原因，采取措施予以避免。l开展统计质量控制前，应将可以控制的误差产生因素尽可能地加以控制，这不但是做好室内质控的前提，也是保证常规检验工作质量的先决条件。统计质控方法 l基线测定l质控规则的表达方式及定义 lLevey-Jennings质控图方法 lLevey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法 l累积和(CUSUM)质控方法 l“即刻法”质控方法 基线测定l最佳条件下的变异（Optimal conditions varianc
34、e,OCV）和常规条件下的变异（Routine conditions variance,RCV）；l当RCV与OCV接近，或小于2 OCV时，则RCV是可以接受的。以上为批间变异。l批内变异的测定；l室内质控物的测定准确度的评价。临床基因扩增检验IQC统计计算问题l可使用质控样本扩增后的IU/ml来进行统计计算，也可用其对数值进行。l由于基因扩增结果的原始数据通常很大，故使用其对数值来进行质控统计分析可能要更为方便一些。质控规则的表达方式及定义 l质控规则的表达方式 l质控规则的功能 l常用质控规则的符号及定义 质控控规则的表达方式的表达方式l通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超
35、出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值13SD来表示。l当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。l常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。质控规则的功能 l简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。常用质控规则的符号及定义 符符 号号 定定 义义l12S 一个质控测定值超出2s控制限。l13S 一个质控测定值超出3s控制限。l22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。lR4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的 差值
36、超出4s控制限。l41S 四个连续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。l7T 七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变 化。l10X 十个连续的质控测定值同时处于均值（X）的同一侧。Levey-Jennings质质控控图图方法方法 l也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart 于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。l二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。Levey-Jennings质控图Levey-Jennings质质控控图图基本的基本的
37、统计统计学含学含义义l稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。l如以3s为失控限，假失控的概率为0.3%。“假阳性假阳性”的的统计学室内学室内质控方法控方法l基于日常检验的阳性率比值(呈正态分布)l直接概率计算方法（不呈正态分布）“即刻”质控方法 l“即刻法”的实质是一种统计学方法,即Grubs异常值取舍法 l只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。室内质控数据的评价 lIQC为一集体活动，除实际测定者外，还应有另外一人对测定数据进行质检。l不能将IQC作为一个监察方法，
38、当发现一次测定未达到质量标准时，应以建设性的而非批评的方式去探查失控的原因。l除了将IQC数据作为日常质控外，还应定期评价累积数据以监测在测定操作中的长期变化趋势。l评价应定期进行。分析你已做的分析你已做的l每次实验结果的分析 表象与真象l多次实验结果的综合分析 趋势的内在含义l仪器设备的使用情况分析 维护与校准周期的有效性弱阳性质控样本常见的失控原因 l核酸提取中的随机核酸提取中的随机误误差。差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。l仪仪器的器的问题问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。l试剂试剂的的问题问题。如Taq酶和/或逆转录
39、酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。阳性质控样本测定结果偏低或为阴性阳性质控样本测定结果偏低或为阴性结果偏低结果偏低阴性阴性临临床床标标本本中中无强阳性无强阳性临临床床标标本本中中有较强阳性有较强阳性临临床床标标本本中有阳性中有阳性临临床床标标本本全为阴性全为阴性观察临床标本情况观察临床标本情况所所用用离离心心管管含含抑制物抑制物Taq酶酶活活性性降降低低核核酸酸提提取取试试剂剂效率低效率低更更换换进进口口离离心心管管更更 换换Taq酶酶再检测再检测更更换换核核酸酸提提取取试剂试剂所有标本重新检测所有标本重新检测核核酸酸提提取取中中靶靶核核酸酸丢丢失失核核酸酸提提取取中中抑抑
40、 抑抑物物残残留留核核酸酸提提取取试试剂剂混入混入扩扩增增仪仪孔孔间间温温度差异度差异随机误差检检测测质质控控样样本本及及35份份已已知阳性样本知阳性样本质质控控样样本本测测定定正正常常且且阳阳性性样样本本有有些些值值增加增加质质控控及及已已知知阳阳性性样样本本测测定定仍仍异常异常按按系系统统误误差差途途径径分分析析重重新新提提取取或或已已知知浓浓度度DNA在同一孔内扩增在同一孔内扩增结果正常结果正常结果仍低结果仍低进进行行扩扩增增仪仪孔孔温温度度校校准准后后再再检测检测Taq酶酶 或或逆逆转转录录酶酶失活失活阴性阴性质控控样本的失控原因本的失控原因 l主要主要为扩增增产物的物的“污染染”和和
41、/或或临床床标本的核酸提取本的核酸提取过程中程中发生生的的标本本间的交叉的交叉“污染染”阴性质控样本测定为阳性阴性质控样本测定为阳性临床标本亦全为阳性临床标本亦全为阳性临床标本中有阳性也有阴性临床标本中有阳性也有阴性扩扩 增增 产产 物物“污染污染”试试 剂剂“污污 染染”同时检测的标本情况同时检测的标本情况扩扩增增产产物物轻轻度度“污染污染”标标本本间间交交叉叉“污染污染”35空空管管室室内静置内静置58份份水水样样本检测本检测试试剂剂直直接接扩增检测扩增检测验证验证验证验证58份份 水水样本检测样本检测暂暂停停日日常常检检验验，实实验室清洁、通风验室清洁、通风更换试剂更换试剂措施措施有有阳
42、阳性性，则则确确认认有有实实验验室室“污污染染”无无阳阳性性，说说明明为为标标本本交交叉叉“污污染染”改善操作改善操作措施措施一个一个临床床PCR实验室室对全全年室内年室内质控控结果的分析果的分析举例例IQC的局限性lIQCIQC可能可能测不出的不出的误差差 l 测定前定前 测定中定中 测定后定后 样本本鉴定不定不对 样本吸取不本吸取不对 结果果记录错误 样本本贮存中存中变质 试剂加入不加入不对l此此类误差的差的发生率在不同的生率在不同的实验室有所不同，一室有所不同，一般要求小于般要求小于0.1%0.1%，且，且应均衡地分布于均衡地分布于测定前、定前、测定中和定中和测定后的不同定后的不同阶段。
43、段。影响临床基因扩增检验结果的最关键因素l产物“污染”（Carry-over)l测定人员的操作：标本混淆；贴错标签、核酸提取等l试剂避免基因扩增检验假阳性结果的措施l严格的实验室分区；l使用带“滤芯”的吸头；l设立“阴性”质控（与标本同时处理）；l使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂；l临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。避免基因扩增检验假阴性结果的措施l避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：（1）纯化核酸；（2）标本重复双份测定；（3）稀释标本。l使
44、用“内质控”（Internal Control,IC)以避免由于试剂、扩增仪或标本处理不当所致的假阴性；须注意的是，如果靶浓度很高，可致在靶核酸和IC之间产生竞争，而使IC受抑制，此时IC可为阴性。室室间质间质量量评评价（价（EQA）lEQAlProficiency testing(PT)EQA 的程序的程序设计设计l确定质评方案,定期发放质评样本；l要求参加质评实验室报告结果的单位要一致，以便于统计；l报告要清楚、简洁；l要求参评实验室在测定EQA样本时，要以与常规样本完全相同的方式测定；l对测定方法、试剂及仪器等归纳总结；l对参评实验室的测定要有评价；lEQA报告要迅速及时。EQA质评样质
45、评样本本 l样本特征与患者样本应尽量一致l样本浓度与试验的临床应用相适应l在样本发放的条件下稳定l不存在不可避免的传染危险性EQA靶靶值值l定性测定，应为明确的阴性或阳性l定量测定，则提供参考方法值或参加实验室的修正均值或参考实验室均值或方法或归组的方法均值评价方法l特定参评实验室的评分根据其与其它实验室得分之间的关系，可分为绝对评分和相对评分两种模式。l绝对评分就是根据已定的靶值对参评实验室测定的每份质评样本计分，然后再计算该次质评的总分，以得分的高低评价参评实验室的水平。l相对评分则是将参评实验室质评得分与所有参评实验室的平均分进行比较，观察其得分在全部参评实验室中所处的位置。相相对评分和
46、分和绝对评分的例子分的例子l相对评分：英国NEQAsl绝对评分：美国CAP采用何种采用何种评分方法分方法较好？好？l建立一个质评体系，上述绝对评分和相对评分的方法均可以采用，其实质内容并无太大的差别，只不过是表现形式的不同，尤其是在定量测定。从室间质量评价对改善实验室测定质量的作用来看，究竟是采用上述哪一种或另外制定的评价方法其实并不重要，关键是要有一个评价方法，从而以其为标准去评价实验室的测定。EQA对测对测定技定技术术的的评评价价l使用适当的统计学方法l全面地对方法、试剂和单个参评实验室测定技术进行评价l指明严重误差l适当时评价测定的其它方面（如测定干扰）。EQA的局限性l参评实验室没有同等的对待EQA样本和患者样本l可能会妨碍给出不同结果的改良方法的发展l在不同的EQA程序中，对实验室的评价可能不同染色体差异染色体差异1.23%(Fujiyama A,et al.Science,2002,295(5552):131-4)谢谢谢谢！