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1、双向电泳操作步骤-蛋白质技术水化上样（被动上样）1 .从冰箱中取出IPG胶条，室温放置10mino.沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1cm左右不 加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否那么会影响胶 条中蛋白质的分布。2 .用银子轻轻撕去IPG胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小 心操作。3 .将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条反面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下 面的溶液产生气泡。如产生了气泡,用银子轻轻地提起胶条的一端， 上下移动胶条，直到气泡被赶走。4 .放置3045min大局部样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加
2、入矿物油，每根胶条约3ml（17cmIPG）,防止胶条水化过程中液体蒸发。5 .置等电聚焦仪于-20（水化1115h。第一向等电聚焦.将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 58口1润湿。1 .取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除外表上的不溶物。2 .将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中,胶条的正极（标有+ ）对应于 聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。3 .在每根胶条上覆盖2- 3ml矿物油。4 .对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。5 .聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶 条置于样品水化盘中，-2（rc
3、冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置 10分钟，使其溶解。第二向SDS-PAGE电泳.配制12%的丙烯酰胺凝胶。1 .待凝胶凝固后，倒去别离胶外表的MilliQ水、乙醇或水饱和正 醇，用MilliQ水冲洗。2 .配制胶条平衡缓冲液I.在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸 o将另一份厚滤纸用M川iQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染 色时出现的纵条纹。3 .将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml(17cmIPG)平衡缓冲液I , 在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。4 .配制胶条平衡缓冲液II o.第一次平衡结束后，取出胶条
4、将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放 入平衡缓冲液II中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。5 .用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放 在桌面上，凝胶的顶部面对自己。6 .将琼脂糖封胶液加热溶解。7 .在100ml量筒中加入TGS电泳缓冲液。8 .第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液(将胶条 竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶外表)。9 .用银子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在lx电泳缓冲液中漂洗数 次。10 .将胶条反面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封 胶液。11 .用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶 胶面完全接触。注意：不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶反面的 支撑膜，不要碰到面胶。12 .放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。13 .翻开二向电泳制冷仪，调温度为150.将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用的 低电流(5mA-10mA/gel/17cm ),待样品在完全走出IPG胶条， 浓缩成一条线后，再加大电流(20-30mA/gel/17cm )待漠酚蓝指 示剂到达底部边缘时即可停止电泳。14 .电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴 手套，防止污染胶面)。15 .进行染色。