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1、精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载河南科技高校试验教学教案课 程 名 称分 子 生 物 学指 导 教 师李市场可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 1 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载河南科技高校试验教学教案首页试验名称试验一、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化试验学时4每次试验组数6每组人数
2、5试验类型综合性试验目的和要求：通过本试验,把握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术.实 验 设 备 及 器 材 ：控温摇床 37 ,高速冷冻离心机,水浴锅,冰箱（-20 , 70）超净工作台,培育箱 37 ,752 分光光度计,灭菌锅等.实 验 原 理 ：r细菌处于简洁吸取外源DNA的状态叫感受态.转化是指质粒DNA或以它为载 体构建的重组子导人细菌的过程.其原理是细菌处于0, CaCl2 低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形.转化混合物中的DNA形成抗 DNA酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42短时间热击处理,促进细胞吸取DNA复合物.将细菌放置在非挑选性培育基中保温一段时间,促
3、使在转化过中获得的新的表型（如 Amp等）得到表达,然后将此细菌培育物涂在含有氨苄青霉素的挑选培育基上.实 验 内 容 ：将质粒载体转移进受体细菌, 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA .将已经转化的细胞在挑选培育基上进行挑选.学 生 实 验 报 告 要 求 ：实 验 报 告 要 求 把 每 个 实 验 步 骤 都 进 行 分 析 .注 意 事 项 ：无菌操作低温操作可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 2 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品
4、资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载试验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化试验目的通过本试验,把握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术.试验原理将质粒载体转移进受体细菌, 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA .转化Transformation是将外源 DNA 分子引入受体细胞 ,使之获得新的遗传性状的一种手段 ,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等争论领域的基本试验技术.转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株, 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 R,M它,可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳
5、固的遗传给后代.为了提高转化效率 , 试验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度 : 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培育液的 OD600 来掌握.DH5 菌株的 OD600 为 0.5 时,细胞密度在 5107个/ml 左右不同的菌株情形有所不同,这时比较合适.密度过高或不足均会影响 转化效率.2. 质粒的质量和浓度 : 1ng 的 cccDNA 即可使 50 l的感受态细胞达到饱和.一般情形下 ,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5.3. 试剂的质量 : 所用的试剂 ,如 CaCl2 等均需是最高纯度的 GR.或 AR., 并用超纯水配制 ,最好分装储存
6、于干燥的冷暗处.4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染.本试验以 E.coliDH5a 菌株为受体细胞 ,并用 CaCl2 处理,使其处于感受态 ,然后与 pUC19 质粒共保温 ,实现转化.由于pUC19 质粒带有氨苄青霉素抗性基因 Ampr ,可通过 Amp 抗性来挑选转化子.如受体细胞没有转入pUC19,就在含Amp 的培育基上不能生长.能在Amp 培育基上生长的受体细胞（转化子）确定已导入了pUC19.转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定.一. 仪器控温摇床 37高速冷冻离心机水浴锅冰箱（ -20, 70）超净工作台培育箱 37可编辑资料 - - - 欢迎下载精品
7、_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 3 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载752 分光光度计灭菌锅二. 试剂CaCl2无菌水 ,冰胰蛋白胨酵母粉AmpNaCl三. 其他用品移液器,枪头1.5ml ,50ml 离心管三角瓶500ml 200ml6cm 平皿试剂瓶 60ml量筒烧杯琼脂甘油酒精灯三角玻棒酒精棉球火柴溶液配制0.1 mol/L CaCl2 溶液 配置 灭菌LB 液体培育基氨苄青霉素（ A
8、mp ）,用无菌水配制成 50_60 mg/mL 溶液,抽虑灭菌置 20冰箱中储存.四. 材料E.coli.DH5 质粒 DNA五:试验步骤： CaCl2（20 人一班,分三组）第一天：从大肠杆菌 DH5 平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB 液体培育基的试管中 ,37振荡培过夜.其次天：1. 取 0.5 mL 菌液转接到一个含有50 mL LB 液体培育基锥形瓶中,37 振荡培育23 h此时, OD 600 0.4-0.5 ,细胞数务必108mL .此为试验胜利的关键 3. 将菌液转移到50 mL 离心管中,冰上放置10 min.4. 离心 10 min（4000r/min）,回收细胞.
9、4可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 4 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载5. 倒出培育液,将管倒置1min 以便培育液流尽.6. 用冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 10 mL 悬浮沉淀,立刻放在冰上30 min.7. 04 6000 r/min,离心 10 min,回收细胞.8. 用冰冷的 0.1mol/L CaCl2 2 mL 悬浮细胞,（务必放在
10、冰上）.9. 分装细胞,每200 L 一份.此细胞为感受态细胞.转化：10. 取 200 L 新奇制备的感受态细胞, 加入 DNA 2 L（ 50 ng ）混匀冰上放置 30 min.同时作两个对比管受体菌对比： 200 L 感受态细胞 2 L 无菌水质粒对比： 200 L 0.1 mol/L CaCl2 溶液 2 L质粒 DNA 溶液11 .将管放到 42循环水浴 12 min.12. 冰浴 2 min.13. 每管加 800 L LB 液体培育基, 37培育 1 h（慢摇）.14. 将适当体积（ 200 L ）已转化的感受态细胞,涂在含有氨苄青霉素的培育皿中.15. 倒置平皿 37培育 1
11、216 h,显现菌落.16.运算转化效率关于大肠杆菌感受态细胞的制备及转化讲解：1、 感受态细胞的概念重组 DNA 分子体外构建完成后,必需导入特定的宿主（受体）细胞,使之 无性繁衍并高效表达外源基因或直接转变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组 DNA 分子的转化.在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面 取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面仍与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系.所谓的感受态,即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA 片段并实现其转化的一种生理状态, 它是由受体菌的遗传性状所打算的,同时也受菌龄、 外界环可编辑资料 -
12、- - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 5 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载境因子的影响. cAMP 可以使感受态水平提高一万倍,而 Ca2+也可大大促进转化的作用.细胞的感受态一般显现在对数生长期,新奇幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键.制备出的感受态细胞临时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或 -70储存（有效期 6 个月）.2、 转化的概念及原理在基因克隆技
13、术中, 转化特指将质粒 DNA 或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内,使之获得新的遗传特性的一种方法.它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等争论领域的基本试验技术之一.受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法,CaCl2 等化学试剂法）处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA 分子通过的感受态细胞.进入细胞的 DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞显现新的遗传性状.大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2 法）,该法最先是由 Cohen 于 1972 年发觉的.其原理是细菌处于0, CaCl2 的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化 混合物中的 DNA 形成抗 DNa
14、se的羟基 -钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42 短时间热冲击处理, 促使细胞吸取 DNA 复合物,在丰富培育基上生长数小时后, 球状细胞复原并分裂增值, 被转化的细菌中, 重组子中基因得到表达, 在挑选性培育基平板上,可选出所需的转化子.Ca2+处理的感受态细胞, 其转化率一般能达到5 1062107 转化子 /ug 质粒 DNA ,可以满意一般的基因克隆试验.如在Ca2+的基础上,联合其它的二价金 属离子（如 Mn 2+、Co2+）、DMSO 或仍原剂等物质处理细菌,就可使转化率提高 1001000 倍.化学法简洁、快速、稳固、重复性好,菌株适用范畴广,感受态细菌可以在-70储存,因此被广
15、泛用于外源基因的转化.除化学法转化细菌外,仍有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA 进入细菌,转化率最高能达到1091010 转化子/ug 闭环 DNA .因操作简便,愈来愈为人们所接受.3、 感受态细胞制备及转化中的影响因素可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 6 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载、细胞的生长状态和密度最好从
16、 -70或-20甘油储存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.不要用已经过多次转接,及贮存在4的培育菌液.细胞生长密度以每毫升培育液中的细胞数在5107 个左右为佳. 即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培育液的OD600 掌握.对 TG1 菌株, OD600 为 05 时,细胞密度在 5 107 个/ml 左右.（应留意 OD600 值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）.密度过高或不足均会使转化率下降.此外,受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株.并且受体细胞仍应与所转化的载体性质相匹配.、质粒 DNA 的质量和浓度用于转化的质粒DN
17、A 应主要是超螺旋态的,转化率与外源DNA 的浓度在肯定范畴内成正比,但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时,就会使转化 率下降.一般的,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%,1ng 的 cccDNA即可使 50ul 的感受态细胞达到饱和.对于以质粒为载体的重组分子而言,分子量大的转化效率低,试验证明,大于 30kb 的重组质粒将很难进行转化.此外,重组DNA 分子的构型与转化效率也亲密相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10100 倍,因此重组 DNA 大都构成环状双螺旋分子.、试剂的质量所用的 CaCl2 等试剂均需是最高纯度的,并用最纯洁的水配制,最好分装
18、储存于 4.、防止杂菌和杂DNA 的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理.全部的试剂都要灭菌,且留意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 DNA 所污染,否就均会影响转化效率或杂DNA 的转入.、整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否就细胞转化率将会降低.可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 7 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - -
19、 -学习好资料欢迎下载河南科技高校试验教学教案首页试验名称试验二、质粒 DNA 的提取及其酶切试验学时4每次试验组数6每组人数5试验类型验证明验目的和要求：通过本试验学习和把握碱裂解法提取质粒DNA.实 验 设 备 及 器 材 ：微量移液器,微量离心管,常用玻璃器皿,恒温培育箱,恒温摇床,台式离心机,高压灭菌锅实 验 原 理 ：碱裂解法提取质粒是依据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分别它们.在 pH 值介于 12.012.5 这个狭窄的范畴内,线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性, 尽管在这样的条件下, 共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相
20、互缠绕, 仍会紧密的结合在一起. 当加入 pH4.8 的乙酸钾高盐缓冲液复原pH 至中性时,共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起,因此复性快速而精确,而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开, 复性就不会那木快速而精确, 它们缠绕形成网状结构, 通过离心, 染色体 DNA与不稳固的大分子RNA ,蛋白质 SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去.实 验 内 容 ：用碱裂解法提取质粒DNA学 生 实 验 报 告 要 求 ：分析 实 验 的 每 一 个 步 骤 .注 意 事 项 ：1、 时 间 要 严 格 控 制 . 2 、注 意 实 验 所 用 的 温 度 .可编辑资料 - -
21、 - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 8 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载试验二、质粒DNA 的提取及其酶切试验目的通过本试验学习和把握碱裂解法提取质粒DNA .试验原理碱裂解法提取质粒是依据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分别它们.在 pH 值介于 12.012.5 这个狭窄的范畴内,线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭
22、环质粒 DNA 的氢键会被断裂, 但两条互补链彼此相互缠绕, 仍会紧密的结合在一起.当加入 pH4.8 的乙酸钾高盐缓冲液复原pH 至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性快速而精确,而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开, 复性就不会那木快速而精确, 它们缠绕形成网状结构, 通过离心,染色体DNA与不稳固的大分子RNA ,蛋白质 SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去.试验仪器： 微量移液器,微量离心管,常用玻璃器皿,台式高速离心机,分光光度计,恒温培育箱,恒温摇床,台式离心机,高压灭菌锅.试剂及溶液：1 用碱法提取质粒DNA溶液 1（GET 缓冲液）：5
23、0 mmol葡萄糖,10mmol/L EDTA ,25mmol/LTris.HCI pH 8.o,用前加溶菌酶 4rngmL .溶液 2（变性液）：02 rnoI/I NaOH ,1 SDS.溶液 3（乙酸钾溶液）： 60 ml 的 5 mol L KAc, 11.5 ml, 冰醋酸, 28.5Ml H 2O.（2） 缓 冲 液 EcoR 酶 解 缓 冲 液 （ l 0 ） TBE 缓冲液（ I O）：称取 Tris 108g,硼酸 55g, 0.5moI L, EDTA（ pH8.o）40 ml,用 H2o 定容到 l000 ml ,高压灭菌作为 l 0贮液 9 稀释 1 0 倍后作为工作液
24、使用.TE 缓冲液： 1 0 rnmol L Tris HCl , I mmol L EDTA pH 8.o,其中含有 RNase20 g mL .（3）上样液及其他试剂上样液（ 6）：0.25溴酚蓝 ,质量浓度 40蔗糖水溶液.溴化乙啶染色液（ 10 rngm t）：在 20ml 水中溶解 0.2g 溴化乙啶,混匀后 4避可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 9 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - -
25、- - - - -学习好资料欢迎下载光储存.异丙醇, 7 0乙醇等.试验步骤（一）提取质粒1. 将 2 ml含相应抗生素的LB液体培育基加入试管中, 接入上述的含 pUC19质粒的大肠杆菌单菌落,37振荡培育过夜.2. 取培育物倒入微量1.5ml 离心管中, 4000 r/min离心 2 min .3. 弃上清,吸尽残液,使细胞沉淀尽可能干燥.4. 加入 100ul 溶液,充分混匀,室温放置10 min.加 200 ul 溶液 （新奇配制）,盖紧管盖,轻轻颠倒数次混匀,将离心管放冰上5min.5. 加入 150ul 溶液 （ 冰上预冷 ）,盖紧管口,颠倒数次使混匀.冰上放置 15min.6.
26、12022 r/min ,离心 15 min,将上清转至另一离心管中.7. 加入等体积酚：氯仿（ 1： 1）（去蛋白）,反复混匀, 12022 r/min ,离心5 min ,将上清转移到另一离心管中.8. 加入 2 倍体积无水乙醇,混匀后,室温放置5 10 min .12022r/min离心 5 min .倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体.9. 用 1 ml 70% 乙醇洗涤质粒 DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干燥.10. 加 50 ul TE缓冲液,其中含有20 ug/ml的胰 RNA酶,使 DNA完全溶解,20储存.（二） 酶切取 DNA溶液,加酶切缓冲
27、液, EcoRI 酶 1 ul ,无菌水补至总体积10 ul ,37保温 3h, 加终止液,预备下个试验电泳,分析质粒DNA的限制性酶切图谱.质粒提取的关键问题即质粒提取中三种溶液的作用：碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液 I , 50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl /10 mM EDTA,pH 8.0 . 溶液 II , 0.2 N NaOH / 1% SDS . 溶液 III,3 M 醋酸可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 10 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - -
28、 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载钾 / 2 M醋酸. 让我们先来看看溶液I 的作用.任何生物化学反应, 第一要掌握好溶液的 pH,因此用适当浓度的和适当pH 值的 Tris-Cl溶液,是再自然不过的了.那么 50 mM葡萄糖是干什么的了？说起来不行思议,加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部.因此,假如溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响. 所以说溶液 I 中葡萄2+2+糖是可缺的.那么EDTA了？大家知道 EDTA是 Ca 和 Mg 等二价金属离子的螯
29、合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase的活性, 和抑制微生物生长.在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA,无非就是要把大肠杆菌细胞中的全部 二价金属离子都螯合掉.假如不加EDTA,其实也没什么大不了的,只要不磨洋 工,只要是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕 DNA会快速被降解, 由于最终溶解质粒的TE缓冲液中有 EDTA.假如哪天你手上正好缺了溶液I ,可不行以抽提质粒了？实话告知你,只要用等体积的水,或LB 培育基来悬浮菌体就可以了.有一点不能忘的是,菌体肯定要悬浮匀称,不能有结块.轮到溶液 II了.这是用新奇的 0.4 N的 NaOH和 2的 SDS等体积
30、混合后使用的.要新从浓NaOH 稀释制备 0.4N 的 NaOH,无非是为了保证NaOH没有吸取空气中的CO2而减弱了 碱性.许多人不知道其实破细胞的主要是碱,而不是SDS,所以才叫碱法抽提. 事实上 NaOH是正确 的溶解细胞的试剂, 不管是大肠杆菌仍是哺乳动物细胞,遇到了碱都会几乎在瞬时就溶解,这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle （微囊）结构的相变化所导致.用了不新奇的0.4 N NaOH,即便是有 SDS也无法有效溶解大肠杆菌 （不妨可以自己试一下） ,自然就难高效率抽提 得到质粒. 假如只用 SDS当然也能抽提得到少量质粒,由于 SDS也是碱性的, 只
31、是弱了点而已.许多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性,以便沉 淀,这是由于没有正确懂得一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致. 有人不禁要问,既然是NaOH溶解的细胞,那为什么要加SDS了？那是为下一步操作做 的铺垫.这一步要记住两点：第一,时间不能过长,千万不要这时候去接电话,由于在这样的碱性条件下基因组DNA片断会渐渐断裂. 其次,必需温顺混合 （象对待女孩子一样）,不然基因组DNA也会断裂.基因组DNA的断裂会带来麻烦.可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 11 页,共 21 页 - - - - -
32、- - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载每个人都知道, 溶液 III加入后就会有大量的沉淀, 但大部分人却不明白这沉淀的本质. 最简洁产生的误会是, 当 SDS遇到酸性后发生的沉淀. 假如你这样怀疑,往 1%的 SDS溶液中加如 2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了.大量沉淀的显现,明显与SDS的加入有关系.假如在溶液II中不加 SDS会怎样了,也会有少量的沉淀,但量上要少得多,明显是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质.既然 SDS不是遇酸发生的沉淀, 那会不会是遇盐发生的沉淀了？
33、在1的 SDS溶液中渐渐加入 5 N 的 NaCl,你会发觉 SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的.因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀.但假如你加入的不是NaCl 而是 KCl,你会发觉沉淀的量要多的多.这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS）,而 PDS是水不溶的, 因此发生了沉淀. 如此看来, 溶液 III加入后的沉淀实际上是钾离 子置换了 SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐, 使得沉淀更完全.大家知道 SDS特的喜爱和蛋白质结合, 平均两个氨基酸上结合一个S
34、DS分子,钾 钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人兴奋的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了.这个过程不难想象,由于基因组DNA 太长了,长长的 DNA自然简洁被 PDS给共沉淀了,尽管 SDS并不与 DNA分子结合.那么 2 M 的醋酸又是为什么而加的了？是为了中和NaOH,由于长时间的碱性条件会打断 DNA,所以要中和之. 基因组 DNA一旦发生断裂, 只要是 50100kb 大小的片断,就没有方法再被PDS共沉淀了.所以碱处理的时间要短,而且 不得猛烈振荡, 不然最终得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电 泳可以观看到一条浓浓的总DNA条带.许多人
35、误认为是溶液III加入后基因组 DNA无法快速复性就被沉淀了,这是天大的误会,由于变性的也好复性的也好,DNA分子在中性溶液中都是溶解的. NaOH原来是为了溶解细胞而用的, DNA分子的变性其实是个副产物, 与它是不是沉淀下来其实没有关系. 溶液 III 加入并混合匀称后在冰上放置,目的是为了 PDS沉淀更充分一点.不要以为 PDS沉淀的形成就能将全部的蛋白质沉淀了,其实仍有许多蛋白质不能被沉淀, 因此要用酚 / 氯仿/ 异戊醇进行抽提, 然后进行酒精沉淀才能得到质量稳固的质粒 DNA,不然时间一长就会由于混入的DNase而发生降解.这里用2可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学
36、习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 12 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载5/24/1的酚/ 氯仿/ 异戊醇是有许多道理的,这里做个全面的介绍.酚（Phenol ）对蛋白质的变性作用远大于氯仿,按道理应当用酚来最大程度将蛋白质抽提掉,但是水饱和酚的比重略比水重,遇到高浓度的盐溶液 （比如 4M的异硫氰酸胍） ,离心后酚相见跑到上层, 不利于含质粒的水相的回收. 但加入氯仿后可以增加比重,使得酚 / 氯仿始终在
37、下层,便利水相的回收.仍有一点,酚与水有很大的互溶性,假如单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制许多酶反应（比如限制性酶切反应） ,因此假如单独用酚抽提后肯定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除,而用酚 / 氯仿的混合液进行抽提,跑到水相中的酚就少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除洁净而不必担忧酶切等反应不能正常进行.至于异戊醇的添加, 其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清楚,也便利了水相的回收.回收后的水相含有足够多的盐,因此只要加入 2 倍体积的乙醇, 在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来.这时候假如放到 20,时间一长反而会导致大量盐的沉淀, 这点不同于一般的D
38、NA酒精沉淀回收, 所以不要过分当心了.高浓度的盐会水合大量的水分子,因此 DNA分子之间就简洁形成氢键而发生沉淀.假如感觉发生了盐的沉淀,就用70的乙醇多洗几次,每次在室温放 置一个小时以上, 并用 tip将沉淀打碎, 就能得到好的样品. 得到的质粒样品一般用含 RNase（50 ug/ml ）的 TE缓冲液进行溶解,不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的 .可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 13 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精
39、心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载河南科技高校试验教学教案首页试验名称试验学时4每次试验组数6每组人数5试验类型验证试验三、琼脂糖凝胶电泳技术试验目的和要求：通过本试验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术.实 验 设 备 及 器 材 ：恒 温 培 养 箱 ,琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ,台 式 离 心 机 ,高 压 灭 菌 锅 ,紫 外 线 投射 仪 器 .实 验 原 理 ：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应.DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷在电场中向正极移动.由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链 DNA几
40、乎具有等量的净电荷,因此他们能以相同的速度向正极方向移动.在肯定的电场强度下,DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分别.DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系.凝胶电泳不仅可以分别不同相对分子质量的DNA, 也可以分别相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子.如上次试验提取的pUC19 质粒,有 3 种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNAcovalentlyclosed circularDNA ,简称CCCDNA ,开环质粒 DNA ,即共价闭合环状质粒 DNA1 条链断裂,（open cir
41、cular DNA, 简称 OCDNA ） ,线状质粒 DNA ,即共价闭合环状质粒 DNA2 条链发生断裂, （ linear DNA , 简称 L DNA ）.这 3 种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同.因此电泳后呈 3条带,超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA ,开环质粒DNA .实 验 内 容 ：利 用 电 泳 技 术 分 离 已 经 酶 切 过 的 质 粒 DNA.学 生 实 验 报 告 要 求 ：要求 星 期 一 做 完 实 验 后 , 星 期 五 交 上 , 实 验 结 果 要 有 图 示 .注 意 事 项 ：1、 注 意 琼 脂 糖 的 浓 度 , 2 、
42、 用 溴 化 乙 锭 染 色 时 要戴 上 手 套 .可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 14 页,共 21 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载试验三琼脂糖凝胶电泳技术试验目的 通过本试验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术.试验原理 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应.DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷在电场中向正极移动.由于糖磷酸骨 架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷,因此他 们能以相同的速度向正极方向移动.在肯定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA 分子本身的大小和构型.具有不同的相对分子质 量的 DNA 片段泳动速度不一样, 可进行分别. DNA 分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系 .凝胶电泳不仅可以分别不同相对分子质量的DNA,也可以分别相对分子质量相同