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1、医学实验常用方法学简介 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望 问问 题题 解决方法解决方法 观察对象太小观察对象太小 放大放大 显微镜显微镜光线不能透过观察对象光线不能透过观察对象 切片切片观察对象缺乏反差观察对象缺乏反差 染色染色观察对象生化成分不同观察对象生化成分不同 细胞化学细胞化学 免疫组织化学免疫组织化学观察对象为生活状态观察对象为生活状态 培养培养（一）光学显微镜技术（一）光学显微镜技术1 1、一般光学显微镜、一般光学显微镜2 2、荧光显微镜
2、、荧光显微镜3 3、相差显微镜、相差显微镜4 4、激光扫描共聚焦显微镜、激光扫描共聚焦显微镜（二）电子显微镜技术（二）电子显微镜技术1 1、透射电子显微镜、透射电子显微镜2 2、扫描电子显微镜、扫描电子显微镜（三）组织化学术（三）组织化学术1 1、多糖、多糖2 2、脂类、脂类3 3、酶、酶4 4、核酸、核酸（四）免疫组织化学术（四）免疫组织化学术（五）原位杂交术（五）原位杂交术（六）细胞和细胞化学定量术（六）细胞和细胞化学定量术1 1、显微分光光度测量术、显微分光光度测量术2 2、形态计量术、形态计量术3 3、流式细胞术、流式细胞术（七）组织培养术（七）组织培养术（八）放射自显影术（八）放射自
3、显影术（一）光学显微镜术一）光学显微镜术light microscope（LM）1 石蜡切片石蜡切片取材取材 Formalin 40%,4%固定固定 Bouin Formalin 40%25ml 苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液 75ml 冰醋酸冰醋酸 5ml 脱水脱水-乙醇、包埋乙醇、包埋-石蜡石蜡切片切片 6um脱蜡脱蜡 二甲苯二甲苯乙醇乙醇 水水 染色染色 HE Hematoxylin：核酸核酸RER、Ribosome Eosin：蛋白、膜结构（蛋白、膜结构（mitochondria、SER、lysosome）透明、封片透明、封片3 3、涂片、涂片 血涂片血涂片 精液精液 痰液痰液 培养
4、细胞培养细胞4 4、铺片、铺片5 5、磨片、磨片 骨和牙需制成磨片、经染色后观察骨和牙需制成磨片、经染色后观察（二）电子显微镜技术（二）电子显微镜技术 电子显微镜（简称电镜）的发明和使用，使组织电子显微镜（简称电镜）的发明和使用，使组织胚胎学研究内容发生了深刻变化。光镜分辨率为胚胎学研究内容发生了深刻变化。光镜分辨率为0.2um，放大倍数约为，放大倍数约为1000倍，而电镜的分辨率为倍，而电镜的分辨率为0.2nm，比光镜高，比光镜高1000倍，可放大几万倍至几十万倍，可放大几万倍至几十万倍，因此电镜能观察到更微细的结构。在电镜下所倍，因此电镜能观察到更微细的结构。在电镜下所见的结构称为超微结构
5、见的结构称为超微结构(ultrastructure)。用于观察细胞内部结构，标本制备比光用于观察细胞内部结构，标本制备比光镜的要求更严格，组织块要更新鲜，体积更镜的要求更严格，组织块要更新鲜，体积更小（小（1mm3），固定常用戊二醛和锇酸。切片），固定常用戊二醛和锇酸。切片则用超薄切片机，制成则用超薄切片机，制成5080nm的超薄切片，的超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，然后在电镜下观用醋酸铀和柠檬酸铅染色，然后在电镜下观察并摄片。察并摄片。1、透射电镜（、透射电镜（transmission electron microscope）用于观察组织或细胞表面的微细结构，标用于观察组织或细胞表面的微
6、细结构，标本需经喷镀金属膜特殊处理，然后在扫描电镜本需经喷镀金属膜特殊处理，然后在扫描电镜下观察，在荧光屏上扫描成像，呈现富于立体下观察，在荧光屏上扫描成像，呈现富于立体感的表面图像，如细胞表面的微绒毛、纤毛和感的表面图像，如细胞表面的微绒毛、纤毛和细胞伸出的伪足等。细胞伸出的伪足等。2、扫描电镜（、扫描电镜（scanning electron microscope)2 2、冰冻切片、冰冻切片 组织置入液氮（组织置入液氮（-196-196）快速冻结，恒冷切）快速冻结，恒冷切 片机切片、染色。片机切片、染色。更好保存细胞内酶的活性、蛋白质结构。更好保存细胞内酶的活性、蛋白质结构。缺点：组织片厚，
7、经冷冻后易破坏组织结构缺点：组织片厚，经冷冻后易破坏组织结构2 2、荧光显微镜（、荧光显微镜（fluorescence microscope）由光源、滤光系统和显微镜三个部分由光源、滤光系统和显微镜三个部分组成。光源为高压汞灯，可产生紫外光，组成。光源为高压汞灯，可产生紫外光，标本中的自发荧光物质或经荧光素染色或标本中的自发荧光物质或经荧光素染色或标记的结构在紫外光激发下可产生各种颜标记的结构在紫外光激发下可产生各种颜色的荧光，以此来研究该荧光物质在细胞色的荧光，以此来研究该荧光物质在细胞和组织中的分布。和组织中的分布。3 3、相差显微镜、相差显微镜（phase contrast micros
8、cope）用于进行细胞培养中活细胞的观察，可用于进行细胞培养中活细胞的观察，可使无色透明的细胞镜下结构反差明显，图像使无色透明的细胞镜下结构反差明显，图像清晰。清晰。4 4、激光扫描共聚焦显微镜、激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope）是近年研制和应用的一种新型显微镜。它将激光束是近年研制和应用的一种新型显微镜。它将激光束落在样品上，并作移动扫描，对样品内某种荧光标记的落在样品上，并作移动扫描，对样品内某种荧光标记的物质进行二维和三维的动态微量分析测定。可用来研究物质进行二维和三维的动态微量分析测定。可用来研究活细胞内活细胞内Ca2、Na+和
9、和 K+等等pH值的动态变化；细胞内各值的动态变化；细胞内各种细胞器、细胞骨架、核酸、蛋白质和受体等的定位和种细胞器、细胞骨架、核酸、蛋白质和受体等的定位和定量分析；细胞膜电位、膜通道及信息传递的检测；利定量分析；细胞膜电位、膜通道及信息传递的检测；利用激光对细胞结构或染色体作切割、分离和克隆等逐渐用激光对细胞结构或染色体作切割、分离和克隆等逐渐成为生物医学研究中重要的研究手段。成为生物医学研究中重要的研究手段。（三）组织化学术（三）组织化学术（histochemistry）应用化学反应与物理反应原理检应用化学反应与物理反应原理检测组织或细胞内某种化学成分并进行测组织或细胞内某种化学成分并进行
10、定位、定量及相关功能研究的技术。定位、定量及相关功能研究的技术。1、多糖、多糖 显示多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘显示多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘酸酸雪夫反应雪夫反应(periodic acid Schiff reaction,PAS反应反应)。组织或细胞中的多糖被。组织或细胞中的多糖被结合形成紫红色沉淀物。此反应称结合形成紫红色沉淀物。此反应称PAS阳性反阳性反应，应，PAS阳性部位为多糖存在部位。阳性部位为多糖存在部位。2 2、脂类、脂类 标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红O O、尼罗蓝或苏丹类染料染色，使组织和细胞尼罗蓝或苏丹类染料染色，使组织和细胞中的脂
11、类物质显示相应颜色。亦可用锇酸中的脂类物质显示相应颜色。亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。固定兼染色，脂类呈黑色。3 3、酶、酶 酶细胞化学反应的基本原理是利酶细胞化学反应的基本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用酶对其相应底物的水解、氧化等作用，使底物的反应产物被某种捕获剂用，使底物的反应产物被某种捕获剂捕获并在原位沉淀，形成有色的终产捕获并在原位沉淀，形成有色的终产物，借此测定该酶在细胞内的分布及物，借此测定该酶在细胞内的分布及活性强弱。活性强弱。4、核酸、核酸 显示显示DNA的传统方法是的传统方法是Feulgen反应反应（Feulgen reaction），组织切片或细胞涂片先），
12、组织切片或细胞涂片先经稀盐酸处理，使经稀盐酸处理，使DNA水解，醛基暴露，再用水解，醛基暴露，再用雪夫试剂处理，形成紫红色反应产物。雪夫试剂处理，形成紫红色反应产物。（四）免疫组织化学术（四）免疫组织化学术（immunohistochemistry）利用免疫学抗原和抗体特异性结合的原理，利用免疫学抗原和抗体特异性结合的原理，检测组织或细胞中的多肽和蛋白质等大分子物质检测组织或细胞中的多肽和蛋白质等大分子物质的分布。为显示抗原抗体复合物的存在，需进行的分布。为显示抗原抗体复合物的存在，需进行抗体标记；用荧光素如异硫氰酸荧光素标记，可抗体标记；用荧光素如异硫氰酸荧光素标记，可以在荧光显微镜下观察，
13、用胶体金标记，可以在以在荧光显微镜下观察，用胶体金标记，可以在电镜下观察，用辣根过氧化酶标记，则可在光镜电镜下观察，用辣根过氧化酶标记，则可在光镜下或在电镜下观察。常用的方法有直接法、间接下或在电镜下观察。常用的方法有直接法、间接法和亲和素法和亲和素-生物素复合物法（生物素复合物法（ABC法）等。法）等。荧光的观察荧光的观察（按标本分类）（按标本分类）在荧光显微镜下观察的标本，当然必须发在荧光显微镜下观察的标本，当然必须发出荧光，可是大多数标本本身不能发出荧光，因出荧光，可是大多数标本本身不能发出荧光，因而必须用荧光色素处理过才能发出荧光。而必须用荧光色素处理过才能发出荧光。（A A）自发荧光
14、）自发荧光（B B）二次荧光）二次荧光（C C）抗体荧光技术）抗体荧光技术（A）自发荧光）自发荧光（不加染色）（不加染色）有些物质不加染色，也能发出荧光（自发有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学（细胞荧光或原发荧光），但在医学和生物学（细胞学、生物组织、培养体等）领域中，只有很少学、生物组织、培养体等）领域中，只有很少物质具有自发荧光，常采用后两种方法。物质具有自发荧光，常采用后两种方法。测定物质的荧光光谱或者激发光谱，可以测定物质的荧光光谱或者激发光谱，可以判定物质性质（荧光光度法）。判定物质性质（荧光光度法）。应用：生物学方面应用：生物学方面判定维生素，研
15、究判定维生素，研究生物学上的生物源的胺。生物学上的生物源的胺。（B）二次荧光）二次荧光（用化学染色）（用化学染色）非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物等）用非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物等）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察，对特定物体选择合适的荧光色素，以便进行观察，对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别（分离）出来该物体就能和周围的组织或细胞区别（分离）出来而可以观察到。而可以观察到。应用：吖啶橙应用：吖啶橙+核酸核酸 金胺金胺+结核菌结核菌 介子奎二噁因介子奎二噁因+染色体染色体（C）抗体荧
16、光技术）抗体荧光技术（用免疫染色）（用免疫染色）利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原中的抗原进行抗原/抗体反应，这样两者的结合抗体反应，这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。荧光显微镜最常体就能通过抗体的荧光观察到。荧光显微镜最常用于抗体荥光技术进行观察，并成为医学、生物用于抗体荥光技术进行观察，并成为医学、生物学很多领域中极为有用的工具。学很多领域中极为有用的工具。Glial fibrillary acidic protein荧光色素荧光色素+物质物
17、质 激发方法激发方法 吸收波长吸收波长 辐射荧光辐射荧光（自发荧光）（自发荧光）维生素维生素A A 紫外（紫外（UVUV）325-345nm 470-490nm 325-345nm 470-490nm维生素维生素B6 B6 紫外（紫外（UVUV）356 432 356 432 儿茶酚胺儿茶酚胺 紫（紫（V V）410 410（405-415405-415）480 480（475-475-485485）血清素（血清素（5-5-羟色胺）羟色胺）紫（紫（V V）390 390（385-400385-400）530 530（520-520-540540）叶绿素叶绿素 兰（兰（B B）520 650-6
18、60 520 650-660荧光色素荧光色素+物质物质 激发方法激发方法 吸收波长吸收波长 辐射荧光辐射荧光（二次荧光）二次荧光）芥子奎二噁因芥子奎二噁因 兰紫（兰紫（BVBV）450 500 450 500四环素四环素+骨，牙骨，牙 紫（紫（V V）或兰（）或兰（B B）390 560 390 560吖啶橙吖啶橙+DNA +DNA 兰（兰（B B）460 530 460 530吖啶橙吖啶橙+RNA +RNA 兰（兰（B B）460 650 460 650金胺金胺+结核菌结核菌 兰（兰（G G）470 557 470 557福尔根反应福尔根反应+DNA +DNA 绿（绿（G G）550 650
19、 550 650溴化乙啶（溴化乙啶（EBEB）+DNA +DNA 绿（绿（G G）545 605 545 605Propidium IodidePropidium Iodide（PIPI）+DNA+DNA 绿（绿（G G）530 615 530 615DAPI+A-T DAPI+A-T 紫外（紫外（U U）372 456 372 456Mithramycin+G-C Mithramycin+G-C 兰紫（兰紫（BVBV）395 570 395 570Olivomycin+G-C Olivomycin+G-C 兰紫（兰紫（BVBV）430 545 430 545 荧光色素荧光色素+物质物质 激发
20、方法激发方法 吸收波长吸收波长 辐射荧光辐射荧光（抗体荧光技术）（抗体荧光技术）FITC FITC 兰（兰（B B）495 525 495 525TRITC TRITC 绿（绿（G G）555 580 555 580罗达明（罗达明（RhodamineRhodamine）绿（绿（G G）568 597 568 597尼罗红尼罗红+溶酶体溶酶体 兰，绿（兰，绿（B B、G G）485-530 525-605 485-530 525-605派若宁丫派若宁丫+线粒体线粒体 绿（绿（G G）540 470 540 470（五）原位杂交术（五）原位杂交术（in situ hybridization）通过检
21、测细胞内通过检测细胞内mRNA和和DNA分子序列片段，分子序列片段，原位显示细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。原位显示细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。应用某种已知的并被标记的应用某种已知的并被标记的RNA或或DNA片段即核片段即核酸探针（酸探针（cRNA或或cDNA），与细胞内的待测核酸），与细胞内的待测核酸（RNA或或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显片段）进行杂交，通过标记物的显示在光镜和（或）电镜下观察目的示在光镜和（或）电镜下观察目的mRNA或或DNA的存在与定位。的存在与定位。标记胰岛素标记胰岛素cRNA探针探针，示胰岛素示胰岛素mRNA阳性阳性（六）细胞和细胞化学定量术（六
22、）细胞和细胞化学定量术1 1、显微分光光度测量术、显微分光光度测量术2 2、形态计量术、形态计量术3 3、流式细胞术、流式细胞术1、显微分光光度测量术、显微分光光度测量术（microspectrophotometry）应用显微光光度计，以物质分子对光波的选择应用显微光光度计，以物质分子对光波的选择性吸收为基础，在显微镜下对生物样品中的化学物性吸收为基础，在显微镜下对生物样品中的化学物质进行定量分析。质进行定量分析。2、形态计量术（、形态计量术（morphometry）运用几何学和统计学原理，对组运用几何学和统计学原理，对组织或细胞进行二维和三维的形态测量织或细胞进行二维和三维的形态测量研究，如
23、对细胞的数量、体积、表面研究，如对细胞的数量、体积、表面积和周长的相对和绝对值的测量等。积和周长的相对和绝对值的测量等。3、流式细胞术（、流式细胞术（flow cytometry）是近年发展起来的细胞分类和定量研究技术，能对是近年发展起来的细胞分类和定量研究技术，能对细胞的生物化学和生物物理特性进行快速定量测定，还细胞的生物化学和生物物理特性进行快速定量测定，还可分选收集各种细胞。该技术的建立为细胞动力学、免可分选收集各种细胞。该技术的建立为细胞动力学、免疫学、血液学和肿瘤学等的研究提供了重要的研究手段。疫学、血液学和肿瘤学等的研究提供了重要的研究手段。如细胞周期各时相细胞的比例，同步分析细胞
24、内如细胞周期各时相细胞的比例，同步分析细胞内DNA、RNA和蛋白质的含量，和蛋白质的含量，T淋巴细胞亚群的分离和定量，淋巴细胞亚群的分离和定量，淋巴细胞表面受体的分析，分离和浓缩造血干细胞，血淋巴细胞表面受体的分析，分离和浓缩造血干细胞，血细胞增殖情况，恶性肿瘤早期诊断，药物作用机制等。细胞增殖情况，恶性肿瘤早期诊断，药物作用机制等。（七）组织培养技术（七）组织培养技术（tissue culture）是将离体的细胞、组织或器官置于培养基是将离体的细胞、组织或器官置于培养基中，在无菌和适宜温度及酸碱度条件下进行培中，在无菌和适宜温度及酸碱度条件下进行培养成活，藉以观察各种物理、化学和生物因素养成
25、活，藉以观察各种物理、化学和生物因素对组织或细胞的作用，探索和提示细胞生命活对组织或细胞的作用，探索和提示细胞生命活动规律和细胞的结构功能变化。动规律和细胞的结构功能变化。新鲜实体组织细胞分离新鲜实体组织细胞分离 胶原纤维胶原纤维1、酶消化法原理、酶消化法原理 紧密连接紧密连接 粘多糖粘多糖常用酶常用酶 蛋白酶类蛋白酶类-胰酶：脂键、肽键胰酶：脂键、肽键 -胶原酶：胶原胶原酶：胶原 -溶菌酶：糖蛋白和肽的糖苷键溶菌酶：糖蛋白和肽的糖苷键 血管血管 -弹性蛋白酶：糖蛋白和弹性蛋白弹性蛋白酶：糖蛋白和弹性蛋白 心脏心脏 肝脏肝脏注意：注意：溶解液溶解液-酶效价酶效价 时间时间-新鲜组织、酶解时间过长，细胞自溶新鲜组织、酶解时间过长，细胞自溶 pH pH值值-碱性：胃蛋白酶失活碱性：胃蛋白酶失活 -中性：胰酶活性欠佳中性：胰酶活性欠佳 酶纯度酶纯度 细胞膜改变细胞膜改变2、机械法、机械法 -剪碎组织剪碎组织 -100目尼龙网过滤（去除大组织块）目尼龙网过滤（去除大组织块）-离心离心1000prm3-5分钟，去上清分钟，去上清 -洗三次，每次离心（洗三次，每次离心（500800prm）取上清，）取上清，弃细胞碎片弃细胞碎片 -300目尼龙网过滤去除细胞团块目尼龙网过滤去除细胞团块