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1、病毒的鉴定方法-科三第二组 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望病毒的鉴定病毒的鉴定病毒的鉴定病毒的鉴定鉴定依据鉴定依据病毒分类病毒分类鉴定方法鉴定方法病毒鉴定依据病毒鉴定依据随着现代病毒学近半个世纪的发展历程，病毒的检测手段和方法也在不断发展和改进，但无论是什么样的方法，都是根据病毒所共有的两个特性而发展起来的。一是病毒的侵染性；二是病毒作为核蛋白的特性，也就是病毒理化性质。病毒鉴定分类病毒鉴定分类动物病毒动物病毒植物病毒植物病毒噬菌体病毒噬菌体病毒其
2、他鉴定方法其他鉴定方法Part1 Part1 植物病毒植物病毒植物病毒植物病毒枯斑和指示植物检测法枯斑和指示植物检测法 血清学检测法血清学检测法酶标免疫吸附法酶标免疫吸附法(ELISA)电镜负染检测法电镜负染检测法 电镜超薄切片法电镜超薄切片法 基因检测技术基因检测技术 免疫电镜检测法免疫电镜检测法1.1.枯斑和指示植物检测法枯斑和指示植物检测法植物病毒最方便的测定法是利用受病毒侵染能产生枯斑的寄主植物进行检测病毒，此法是美国病毒学家霍姆斯(Hohnes)在1929年发现的，用感病的植物叶片与少许金刚砂相混，研磨成粗汁液，然后在指示植物的叶片上蘸取汁液，磨擦供试植物的叶片，经清水清洗后，置于室
3、温条件下的温室内待测，2-3d后叶片上会出现局部坏死灶，即圆形的枯斑，在一定的范围内，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比。枯斑法虽不能测出病毒总的核蛋白浓度，但能测出病毒的相对侵染力，对于病毒的定性有着重要的意义。诺贝尔奖获得者美国科学家斯坦利(Stanley)第一次提纯出TMV(烟草花叶病毒)时就是使用此法来检测病毒的。时至今日，很多试验室和生产检测单位仍然利用此方法检测病毒。枯斑法在提纯一个未知病毒时，它还可起到追踪病毒踪迹的作用，一旦有了病毒的纯品，利用病毒的稀释曲线，可以换算出病毒的实际浓度。2.2.血清学检测法血清学检测法基本原理是动物受其致病细菌、病毒侵染后，动物体内血液中的球蛋白发生
4、变化而产生抗体，引起动物产生抗体的物质简称为抗血清。血清中的抗体能与同系的抗原在体外特异的结合，这一特性就是血清学测定病毒的基本原理。这种方法已经广泛应用于植物病毒的定性定量分析和医学临床诊断上，其方法的种类也很多，这里仅对一些重要的方法做扼要的介绍：(2)(2)沉淀法。沉淀法。相对来说沉淀法即非常简便，在植物病毒学中应用的极为广泛，其原理是在电解质存在时，抗体与同源抗原相互结合形成沉淀，不同病毒类型所形成的沉淀也不同。如杆状、线状病毒形成絮状沉淀，球形病毒多形成颗粒状沉淀，通过稀释终点法，就是利用抗原稀释终点对于每种病毒来说是比较稳定的这一特点，来测试病毒的浓度。(1)(1)补体结合测定法。
5、补体结合测定法。血清中有一种对热不稳定的成分，它能在抗体存在的条件下，溶解红血球或破坏革兰氏阴性菌，这种成分就称之为补体。补体是一种很复杂具有酶活性的蛋白质，在560(；下加热，30min后补体则失活，它的一个重要特性是一旦抗体与抗原结合，则补体也与之结合，通过补体的酶作用可以溶解红细胞。3.3.酶标免疫吸附法酶标免疫吸附法(ELISA)(ELISA)Elisa方法是Enzyme-Linked immunosorbentassay的缩写，最早用于动物病毒的检测，近二三十年才应用于植物病毒的检测，并作为病毒的定量方法广泛应用于病理、免疫学的研究和生产实践中，对病毒进行快速检测。此法的最大优点是灵
6、敏度高，能与放射免疫技术媲美。有很多的病毒因其浓度太低或某种抑制剂的干扰，常规血清学方法检测不出时，此法就显示出独特的优越性。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入酶标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。4.4.电镜负染检测法电镜负染检测法第一台电子显微镜的诞生打开了人类认识微观世界的大门，电镜技术在近70年发展历程中，为生物学、细胞学、病毒学领域的发展作出了重要贡献。正是由于电镜的出现，实现了人类可直观病毒及其他生物大分子的可能。因此电子显微镜技术可以
7、说是最直接，最准确的检测病毒的手段，它可以直接看到病毒的形态结构、存在与否，所以在进入了分子水平的今天它仍然有着不可替代的作用。电镜负染技术是20世纪60年代开始使用于英国试验室，当时人们发现一些重金属离子能绕核蛋白体四周沉淀下来，形成一个黑暗的背景，在核蛋白体内部不能沉积而形成一个清晰的亮区，其图像如同一张照相的底片，因此人们习惯地称为负染色，电镜负染技术也就由此而生。5.5.免疫电镜检测法免疫电镜检测法免疫电镜技术是将免疫学原理与电镜负染技术相结合的产物，在电镜制样过程中，病毒颗粒不能集中的沉积在有效的电镜视野内，而容易造成电镜观察时的疏漏，免疫电镜法利用了抗体、抗原的亲和性与吸附性的这一
8、特点，在电镜制样过程中，于铜网上先铺展一层细胞色素A，稍后再添加一滴抗体，多余液滴用滤纸吸掉，最后点上一滴抗原和染液，由于细胞色素A的作用，减少了样品即抗体、抗原的表面能力，能形成均匀的涂层，再加抗体、抗原的吸附作用使病毒能较集中地沉集在有效视野内，从而便于电镜下的观察，大大提高了检测几率。6.6.电镜超薄切片法电镜超薄切片法该技术的发展已经达到病毒的体内定位研究和体内复制及侵染过程的动态研究水平，并能直观病毒生物大分子的亚基单位，已经从细胞水平发展到分子水平。尤其对一些未知病毒，难于提纯的病毒材料，负染技术不能解决的检测材料都可用此方法，通过对组织细胞的直接观察而得到解决，因此在病毒学检测和
9、脱毒快繁的实际生产中均有着特殊的重要性和不可取代的作用。7.7.基因检测技术基因检测技术基因工程技术的兴起在对病毒的检测手段中带来了新的飞跃，检测水平已经达到超微量，即微克水平。其成熟的方法也很多，如分子探针杂交检测技术，利用一定序列的核苷酸合成探针，通过分子杂交技术，检测出供试样品中与之相补的碱基序列。PCR技术是通过体外扩增可以使供试样品中的目的基因片段很快扩增，使之达到了对即使是病毒含量极低的样品，也能灵敏准确地得到定性的结果。基因检测技术对病毒的检测已经达到分子水平，其灵敏度和特异性是任何生化方法的检测所不能比拟的，同时可以省略大量的病毒提纯和血清的制备工作。Part2 Part2 动
10、物病毒动物病毒动物病毒动物病毒细胞病变效应细胞病变效应 红细胞吸附现象红细胞吸附现象50%致死量（致死量（LD50）或）或50%组织细胞感染量（组织细胞感染量（TCID50）的测定）的测定 蚀斑和感染病灶蚀斑和感染病灶 血凝现象和干扰现象血凝现象和干扰现象1.1.细胞病变效应细胞病变效应 细胞变化，由病毒引起的细胞病变称为细胞病变效应，不同病毒有不同的病变效应。用于细胞培养的标本一般以细胞病变效应作为病毒感染的指标2.包含体包含体是某些病毒增殖过程中在宿主细胞内形成的嗜酸性或嗜碱性的病变结构。由于不同病毒包含体的大小、形状、组分 以及存在于宿主细胞中的部位均不同，所以包含体可用于病毒的分类、快
11、速鉴别和某些病毒疾病的辅助诊断指标。例如，昆虫病毒可根据包含体的特性及有无分为质型包含体病毒、核型包含体病毒、颗粒体病毒及无包含体病毒4类；烟草花叶病毒与马铃薯Y病毒的形态及其相似，但它们的包含体形态截然不同，前者为三角形，后者为矩形；狂犬病毒可在神经元细胞中形成特征性的嗜酸性包含体，又称内基氏小体，具有诊断价值。1.细胞融合现象指由于病毒感染宿主细胞而出现的多核细胞现象。其发生决定于病毒和细胞的种类，也受病毒数量、温度、离子强度等因素的影响。如猪肾继代细胞内引起细胞融合，但不能在人的二倍体成纤维细胞中诱发融合现象。2.2.红细胞吸附现象红细胞吸附现象 流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后24-4
12、8小时，以细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。3.3.50%50%致死量（致死量（LD50LD50）或或50%50%组织细胞感染量（组织细胞感染量（TCID50TCID50）的测定）的测定 本法可估计所含病毒的感染量。方法是测定病毒感染鸡胚，易感动物或组织培养后，引起50%发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬液作10倍连续稀释，接种于上述鸡胚，易感动物或组织培养中，经一定时间后，观察细胞或鸡胚病变，如绒毛尿
13、囊膜上产生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感动物发病而死亡等，经统计学方法计算出50%感染量或50%组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。4.4.蚀斑和感染病灶蚀斑和感染病灶 一些动物病毒在动物细胞或组织培养系统培养时，由于受病毒感染细胞裂解，出现与噬菌斑类似的蚀斑或称空斑。5.5.血凝现象和干扰现象血凝现象和干扰现象 血凝现象指带有血凝素的病毒能凝聚一定种类哺乳动物或禽类的红细胞。如流感病毒、天花病毒。可根据病毒凝聚的血细胞种类及凝聚条件不同而鉴定病毒。干扰现象指两种不同的病毒同时或先后感染同一宿主细胞时，一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象。如乙型脑炎病毒能干扰脊髓灰质炎病毒，流感病毒可
14、干扰西方型马脑炎病毒的增殖等。若在某一组织细胞培养物同时加入接种物及可被干扰的病毒，若后者被抑制，则可间接判断接种物存在可干扰后者的病毒。噬菌体病毒噬菌体病毒双层平板法双层平板法 菌体的噬菌斑测定一般采用双层平板法，将一定量经稀释的噬菌体悬液与高浓度敏感菌悬液及半固体琼脂培养基（1%琼脂）混合均匀，倒入含底层琼脂培养基（2%琼脂）9的平板，经过一段时间培养后，在细菌菌苔上会出现一个个圆形局部透明区域，即噬菌斑。可以认为，每个噬菌斑是一个噬菌体侵染的结果，一个噬菌斑中的噬菌体遗传性都相同，故通过多次重复接种，可获得纯系噬菌体。因每种噬菌体的噬菌斑有一定大小、形状、边缘和透明度，故可以作为鉴定的指
15、标。此外，噬菌斑亦可用于病毒的定量。Part3 Part3 噬菌体病毒噬菌体病毒噬菌体病毒噬菌体病毒Part4 Part4 其他鉴定方法其他鉴定方法其他鉴定方法其他鉴定方法免疫荧光（免疫荧光（IF）法）法 病毒形态和结构观察法病毒形态和结构观察法血清学鉴定法血清学鉴定法 电喷方法电喷方法 1.1.免疫荧光（免疫荧光（IFIF）法）法 病毒在细胞内增殖引起细胞退形性变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落。某些病毒产生特征性CPE，普通光学倒置显微镜下可观察上述细胞病变，结合临床表现可做出预测性诊断。免疫荧光（IF）法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点，细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异
16、性抗体着色，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。2.2.病毒形态和结构观察法病毒形态和结构观察法 病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判断病毒属那一科。还可用分子生物学技术分析病毒核酸组成、基因组织构、序列同源性比较加以鉴定。3.3.血清学鉴定法血清学鉴定法 用已知的诊断血清来鉴定。补体结合试验可鉴定病毒科属；中和试验或血凝捣蛋制试验可鉴定病毒种、型及亚型。从病人检材中分离出病毒株，应结合临床症状，检材来源及流行季节等加以综合分析，并应注意混杂病毒、隐性感染或潜伏病毒的混淆，须用病人急性期与恢复期双份血清作血清学试验，血清抗体滴度有4倍以上增高，才有意义。4.4.电喷法电喷法 英国科学家发明了一种立即鉴定病毒的方法，可在未来生物战中对军队提供更佳的保护.研究人员指出。利用电喷方法将一种液体中的阳电荷大量喷酒在病毒的蛋白质上，再以磁场进行质谱测定分析,即可鉴定病毒的种类。这个研究小组已用这种方式鉴定出一种噬菌体，以及与小儿麻痹症、甲肝和口蹄疫同属一类的一种病毒，并且正在将鉴定范围扩大到包括细菌在内。Thank You!Thank You!